Il Laboratorio nell accertamento dell uso e abuso di alcol

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1 Il Laboratorio nell accertamento dell uso e abuso di alcol Antonio Colatutto Pierguido Sala Sez. Tossicologia Laboratorio Analisi di Elezione Direttore Dr. P. Sala Az. Ospedaliero Universitaria S. Maria della Misericordia - UDINE Udine 27 maggio 2011

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3 Decessi in presenza di etanolo 28% Dosaggio Etanolo CASISTICA: Friuli Venezia Giulia Prov. di Udine Decessi in assenza di etanolo 72% Decessi in presenza di etanolo Accidente 20% Morte naturale 28% Suicidi Intossicazione paraffina 2% Intossicazione farmaci 8% Precipitazione 8% Annegamento 16% Arma da fuoco 6% Incidente 35% Suicidio 17% Intossicazione CO 4% Arma da taglio 2% Impiccamento 54%

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5 alcol a catena corta, la sua formula bruta è CH 3 CH 2 OH liquido e incolore a temperatura ambiente volatile ed estremamente infiammabile solubile completamente in H 2 O e in molti solventi organici ultimo prodotto della fermentazione degli zuccheri, processo ossidativo anaerobio svolto dai saccaromiceti: C 6 H C 2 H 5 OH + 2CO 2 + E ASSORBIMENTO Avviene nello stomaco e nel primo tratto dell intestino per diffusione semplice È presente nel sangue già 5 minuti dopo l ingestione Il picco è tra 30 e 90 minuti, nel soggetto digiuno 20 minuti Tempo dell assorbimento: da 2 a 6 ore, in funzione di: cibo (i cibi grassi rallentano la velocità dell assorbimento) tempo impiegato per l assunzione della bevanda età, sesso, razza, BMI, polimorfismi enzimatici, interventi di gastroresezione (in tal caso assorbimento più celere), ecc. ETANOLO Bevanda Materiale di estrazione Contenuto in alcool % vol. Calorie per 100 ml Vino Succo d uva Sidro Succo di mele Birra cereali Vodka /Gin Spirito neutro e buccia d arancia o ginepro Brandy vino Whisky cereali Rum melassa

6 METABOLISMO ED ELIMINAZIONE Relazione tra alcolemia ed effetti neurologici ALCOLEMIA mg% ml EFFETTI 30 Aumentato senso di benessere; ritardato senso di risposta agli stimoli esterni 60 Lieve perdita di inibizione sociale; alterazione della capacità di giudizio 90 Marcata perdita di inibizione sociale; riduzione della coordinazione motoria 120 Perdita del controllo fisico; tendenza a risposte estreme 150 Difficoltà di espressione verbale; andatura barcollante 180 Perdita di controllo dell attività volontaria; visione alterata >250 Diplopia, apatia, amnesia, mancanza di reazione agli stimoli, incapacità di stare in piedi e di camminare, sonnolenza, incontinenza urinaria, stupore, possibile perdita di conoscenza Sede: - l 80% dell alcol è metabolizzato a livello epatico alla velocità di 2 mmoli (92 mg di etanolo) per grammo di tessuto al minuto - altre sedi: mucosa gastrica, polmone, rene Velocità del metabolismo: - è costante, indipendente dalla concentrazione ematica e direttamente proporzionale al peso, maggiore nel bevitore abituale rispetto al saltuario (= induzione enzimatica); - una volta completato l assorbimento e raggiunto l equilibrio tra i tessuti, l alcol viene ossidato alla velocità di 0.015g/ dl/ ora, cioè 150mg di alcol/ kg di peso corporeo/ ora, (= 25cc whisky/ ora, cc birra/ ora), con un decremento dell alcolemia tra 0.15 e 0.2g/L/ora; ( N. B.: g di alcol anidro = ml di bevanda x grado alcolico x 0.8 ) 100 intorno a 0,5 g/l da 0,8 1,5 g/l da 1,5 a 2,5 g/l oltre 2,5-3,00 g/l Diminuita capacità nel percepire i colori dei semafori e dei segnali Difficoltà nella percezione di eventuali pericoli laterali e, soprattutto, eccessivo stato di sicurezza che porta a sottovalutare o sfidare il pericolo Mancata coordinazione dei movimenti che comporta altissima probabilità di causare incidenti; in ogni caso la condotta di guida è irrazionale ed estremamente imprudente. Per effetto soporifero che determinano sul conducente (impedimento ad avviare e guidare il veicolo) questi valori sono paradossalmente meno pericolosi ai fini della sicurezza stradale rispetto ai valori più bassi (comunque variabile a seconda dei fattori individuali e dell assuefazione).

7 VIA OSSIDATIVA: il 90-98% è metabolizzato per questa via la reazione di ossidazione più importante è operata dall alcol deidrogenasi con NAD come coenzima ed accettore di H+ con produzione di acetaldeide per concentrazioni di etanolo > 20mM, intervengono anche: - la catalasi epatica, sempre con formazione di acetaldeide - un sistema microsomiale di ossidasi: il prodotto finale è ancora l acetaldeide; queste ossidasi fanno parte del citocromo P450 ed intervengono anche nella detossificazione dei farmaci, SOSTANZE ASSOCIATE EFFETTI CONIUGAZIONE AD ACIDI: a livello epatico, piccolissime quantità di etanolo sono coniugate con acido glucuronico e solforico e quindi escrete con la bile e le urine Anticonvulsivanti Antidepressivi Antidepressivi Antiistaminici Barbiturici Benzodiazepine Ipnotici Neurolettici FANS Ansiolitici Potenziamento Potenziamento Antagonismo Additivazione Additivazione Potenziamento Potenziamento Potenziamento Additivazione Potenziamento ESCREZIONE IMMODIFICATA: un 2% di alcol è eliminato immodificato per via renale, polmonare, saliva ed altri liquidi organici; questa quota può salire al 10% in caso di ingestione massiva VIA METABOLICA NON OSSIDATIVA: l etanolo reagisce con gli acidi grassi originati dall idrolisi dei trigliceridi formando esteri (FAEE) che sembrano avere un ruolo fondamentale nell indurre i danni tissutali da abuso alcolico.

8 PRINCIPALI AZIONI FARMACOLOGICHE DELL ETANOLO & PATOLOGIA DA ALCOL

9 Disturbi del visus (con 50mg/dl si evidenziano) Incoordinazione muscolare (vietato in sport come il tiro al bersaglio!!), incapacità di scrivere a macchina, guidare la vettura, rimanere in equilibrio, con 35 mg/dl si ha parola ingarbugliata. Allungamento del tempo di reazione (basta una alcolemia di 20 mg/dl!!!!) Euforia: sensazione per cui viene rafforzata la determinazione a bere Perdita delle inibizioni: citata da Seneca: l ebbrezza altro non è che pazzia voluta, importante in tossicologia forense ed in criminologia

10 MECCANISMI DI AZIONE A LIVELLO DEL SNC Agisce sui canali ionici attivati da glutammato (eccitatori) e sui canali ionici inibitori che utilizzano il GABA come mediatore Etanolo, come i barbiturici, aumenta la l inibizione sinaptica GABA mediata e i flussi di ioni cloro ad essa correlata Potenzia gli effetti della 5HT sul recettore 5HT3, localizzato negli interneuroni inibitori ALCOLEMIA mg% ml Concentrazione ematica g/l Area encefalica interessata Lobo frontale 1-3 Area psicomotoria Cervelletto 2-3 Area della visione Diencefalo 4-5 Midollo allungato EFFETTI 30 Aumentato senso di benessere; ritardato senso di risposta agli stimoli esterni 60 Lieve perdita di inibizione sociale; alterazione della capacità di giudizio 90 Marcata perdita di inibizione sociale; riduzione della coordinazione motoria 120 Perdita del controllo fisico; tendenza a risposte estreme 150 Difficoltà di espressione verbale; andatura barcollante 180 Perdita di controllo dell attività volontaria; visione alterata > 250 Diplopia, apatia, amnesia, mancanza di reazione agli stimoli, incapacità di stare in piedi e di camminare, sonnolenza, incontinenza urinaria, stupore, possibile perdita di conoscenza

11 L effetto emetico compare sia che vi sia stata ingestione, sia nel caso che l alcool sia stato somministrato per via parenterale Si suppone che vi sia una stimolazione diretta della CTZ, Chemo Trigger Zone, Un area situata nel Bulbo a livello del Pavimento del IV Ventricolo È un tipo di vomito di origine centrale Interferenza con il metabolismo dei Folati e della Vitamina B12 Questi effetti regrediscono dopo astinenza Frequente la vacuolizzazzione degli Eritroblasti e dei mielociti Trombocitopenia Effetto tossico diretto sul Midollo Osseo Alterazione della chemiotassi Sindrome alcolica fetale Effetto inibitorio diretto dell etanolo o dell acetaldeide sulla proliferazione cellulare dell embrione all inizio della gestazione Deficit mentale da teratogenesi Quantità minima di etanolo associata alla Sindrome alcolica fetale: 75ml/ die

12 STEATOSI EPATICA Patologia Epatica Epatite alcolica acuta Acetaldeide Acetaldeide: chimicamente e biologicamente più dannosa della molecola-madre, è la responsabile principale degli effetti dannosi che si osservano nei forti bevitori: interferenza in vari processi metabolici causa di danni organici: diretti attraverso la denaturazione di molecole proteiche e lipidiche native e indiretti attraverso la formazione di addotti CIRROSI EPATICA FAEE FAEE (esteri etilici degli acidi grassi, soprattutto palmitato ed oleato di etile): sono metaboliti minori dell etanolo che si formano per reazione dell etanolo con acidi grassi liberi, trigliceridi, lipoproteine, fosfolipidi sotto l azione dell enzima specifico FAEE sintetasi (presente nel citosol e nei mitocondri) e di vari enzimi aspecifici quali carbossietilesterasi, lipoproteinlipasi

13 Quantità modeste di alcool causano vasodilatazione e sensazione soggettiva di calore Vasodilatazione è da probabile azione centrale Apparato Cardiovascolare A dosi elevate l alcool determina: Azione depressiva centrale sul circolo, sino ad un quadro di vero e proprio shock Come coronarodilatatore possiede un effetto controverso Probabile una blanda azione analgesica, peraltro inferiore a quella dei nitriti (TNT) Pertanto è impedita la normale vasocostrizione da esposizione al freddo, sicchè è frequente l assideramento nei soggetti esposti ed intossicati da etanolo

14 Piccole quantità di etanolo possono diminuire il senso di fatica Dosi elevate di etanolo causano depressione centrale e diminuiscono la quantità di lavoro che può essere eseguita Nell etilismo cronico sono evidenziabili delle alterazioni elettromiografiche È stata descritta una forma di miopatia alcolica che è simile alla miocardiopatia alcolica Etanolo ed Attività Sportiva Discipline sportive Aeronautica Bocce Ginnastica Karate Pattinaggio (a rotelle) Pentathlon moderno Triathlon mg% ml Per le Discipline Automobilismo, Biliardo, Calcio, Motociclismo, Sci, Tiro con l arco, Wrestling sussiste divieto assoluto (zero mg%ml).

15 Valori di alcolemia prossimi a 600mg/dl spesso portano all exitus Il coma è frequente per valori oscillanti tra 450 e 500 mg/dl Margine terapeutico molto stretto, pertanto non utilizzabile per l anestesia.. Terapia sintomatica Intossicazione alcolica mortale

16 TIPOLOGIA DI CAMPIONE, VARIABILI PREANALITICHE E DIFFERENTI PROBLEMATICHE Sangue intero Siero Plasma Sangue capillare Aria alveolare Urina Saliva Da vivente Da cadavere

17 SANGUE CAPILLARE

18 Nel prelievo non usare alcol,ma disinfettanti come ad es. il cloruro di benzalconio SIERO Controllare che la provetta sia ben tappata e ben riempita. L esecuzione del test deve seguire immediatamente l apertura della provetta. Operare in ambienti in cui non si usi l alcol per pulizia e disinfezione Il sangue intero va deproteinizzato con TCA Si utilizza l alcol deidrogenasi L enzima trasforma l alcol etilico in acetaldeide. NAD + +C 2 H 5 OH > C 2 H 4 O + NADH + H + L assorbanza viene misurata a 340 nm La misura del NADH è proporzionale alla concentrazione di etanolo METODI ENZIMATICI

19 METODO ENZIMATICO Utilizzando un secondo enzima, l aldeide deidrogenasi (AlDH) l aldeide acetica, in presenza di NAD, si trasforma in acido acetico e NADH raddoppiando la sensibilità della reazione - (si formano due molecole di NADH per ogni molecola di etanolo). NAD NADH NAD NADH ETANOLO ACETALDEIDE ACETATO ADH Aldeide deidrogenasi Imprecisione intra serie 0,5-1,2 CV% Imprecisione inter serie 0,9-2,3 CV% nell intervallo di conc. 29,4-192 Reattività crociata a 2000 mg/dl: N-propanolo 8% siero, 9,9% urine N-butanolo 2,8% (s), 1,5% (u), metanolo ed isopropanolo trascurabile Correlazione vs GC r =1(siero) r (urine e sangue ( intero

20 ULTERIORI METODI ENZIMATICI Un sistema combinato di perossidasi ed alcol ossidasi reagisce in presenza di alcol formando un complesso blu. La lettura spettrofotometrica a 600 nm Il sistema correla bene con la gas cromatografia (r = 0,9977) Alcol ossidasi non è specifica Una variazione al Bucher e Redetzky sfrutta la reazione NADH + H + +1/2 O > NAD + +H 2 O in presenza di perossido di rafano e Mn 2+ Dalla velocità di consumo di O 2,misurato da un elettrodo ossigeno sensibile si ricava la concentrazione di NADH e di Etanolo

21 Il gold standard per la determinazione dell alcolemia a scopo tossicologico- forense è la metodica gascromatografica ma è una procedura che richiede manualità, personale tecnico formato e soprattutto non è passibile di risposta rapida.

22 IPOTESI: LA DETERMINAZIONE CON METODICA ENZIMATICA PUO ESSERE UNA VALIDA ALTERNATIVA ALLA METODICA GASCROMATOGRAFICA IN TERMINI DI SENSIBILITA, SPECIFICITA, E SOPRATTUTTO POTREBBE ESSERE UTILIZZATA ANCHE IN CAMPO TOSSICOLOGICO- FORENSE?

23 Sono stati analizzati per il dosaggio dell alcolemia 150 campioni di soggetti afferenti al laboratorio analisi dell Azienda Ospedaliero- Universitaria S. Maria della Misericordia di Udine. I campioni prelevati in siringa eparinata, sono pervenuti in laboratorio; sono stati aliquotati: la prima aliquota è stata analizzata con metodica enzimatica entro mezz ora dall arrivo. La seconda aliquota è stata refrigerata e successivamente sottoposta a determinazione gascromatografica in spazio di testa.

24 Campione: plasma eparinato Centrifugazione 5 a 1500g Separazione del plasma dalla parte corpuscolata ed immediata effettuazione dell analisi dopo l apertura della provetta (possibilità di falsi negativi) DETERMINAZIONE CINETICO- ENZIMATICA: la velocità di variazione dell assorbanza tra le successive misure, rilevate in un certo periodo di tempo (quando la reazione è lineare), è funzione della concentrazione dell analita d interesse. etanolo + NAD+ (ADH) acetaldeide + NADH + H+ DETERMINAZIONE ENZIMATICA LXi725 Beckman

25 Rapporto campione/reattivo è 1:27,5 Lettura assorbanza a 340 nm La differenza di assorbanza dovuta al NADH è proporzionale alla concentrazione di etanolo e viene usata per calcolare ed esprimere la concentrazione in base ad una curva di calibrazione a due punti. Sensibilità : 4 mg/dl Intervallo di misura: mg/dl

26 VALORE RILEVATO: 5 mg/dl VALORE RILEVATO: 211 mg/dl

27 DETERMINAZIONE GAS CROMATOGRAFICA GC 1000 CON AUTOCAMPIONATORE PER SPAZIO DI TESTA DANI HSS E una tecnica strumentale molto sensibile che si basa sulla diversa ripartizione di sostanze diverse tra una fase stazionaria ed una fase mobile, costituita da un gas inerte. I meccanismi di separazione sfruttati sono: Adsorbimento (siti attivi che interagiscono mediante legami secondari con la molecola da risolvere GS) Ripartizione (solubilizzazione delle sostanze nella fase stazionaria liquida che si ripartiscono tra le due fasi immiscibili GL)

28 La fase stazionaria è generalmente costituita da un liquido non volatile supportato su una polvere che riempie uniformemente una colonna ("colonna impaccata") oppure distribuito come film sottile spesso qualche micrometro sulla parete interna di una colonna di lunghezza superiore ai 10 metri e di diametro inferiore al millimetro ("colonna capillare"). La fase mobile è un gas, detto anche gas di trasporto, gas vettore o gas carrier. Generalmente, vengono scelti gas chimicamente inerti, a bassa viscosità ed ottenibili ad elevata purezza quali l'azoto, l'elio o l'argon; per alcune applicazioni vengono anche utilizzati l'idrogeno o l'anidride carbonica. OGNI SOSTANZA DELLA MISCELA DÀ ORIGINE AD UN PICCO: IL TEMPO CHE INTERCORRE TRA L INIEZIONE DELLA MISCELA NELLO STRUMENTO E L USCITA DEL PICCO VIENE DETTO TEMPO DI RITENZIONE ; L AREA DEL PICCO È PROPORZIONALE ALLA CONCENTRAZIONE DELLA SOSTANZA IN ESAME

29 La miscela di reazione viene introdotta nell iniettore, esso la vaporizza e le diverse sostanze, sotto l attrazione del gas di trasporto, si spostano lungo la colonna: essendo chimicamente diverse tra loro vengono trattenute con diversa forza dalla fase stazionaria e giungono all uscita separatamente (risolte) e in tempi diversi. Un rilevatore poi segnala il loro passaggio mediante un segnale elettrico che si trasforma in un tracciato nel registratore. Sangue intero da siringa eparinata Metodo dello standard interno (isopropanolo) Nelle apposite vials: 100 µl di standard interno 100 µl di sangue intero 100 µl di SSS Preparazione standard di calibrazione Preparazione controllo (50 mg/dl) Tappare Agitare brevemente al vortex 5 a temperatura ambiente Inserire nell autocampionatore

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31 Ottima correlazione tra le due metodiche: R2= 0,917 Ottimi i valori delle DS: DS gas= 90,162 DS enz= 89,7609 La maggior parte dei valori è compresa all interno delle due DS Metodi sovrapponibili, ripetibili e confrontabili (R di Bland Altman= 0,0002 e curva di correlazione) La discrepanza tra alcuni valori (es 113 mg/dl VS 105 mg/dl) è di scarso interesse clinico e medico- legale Da notare una concordanza per valori prossimi alla soglia legale

32 Niente di nuovo sotto il sole! Il plasma contiene più acqua del sangue intero, per cui più alcol (l alcol è completamente miscibile nell acqua!) Una pratica accettabile è dividere il valore dell alcolemia determinata su siero o plasma per 1.18

33 Anche in questo studio vi è corrispondenza tra le due metodiche: sangue intero in GC HS versus Metodo enzimatico

34 I risultati del nostro lavoro sono in linea con coloro che operano in altre realtà

35 In base ai dati ottenuti si può affermare che l alcolemia ottenuta con metodica enzimatica è sovrapponibile, o assimilabile all alcolemia determinata con metodica gascromatografica METODICA ENZIMATICA METODICA GASCR. MANUALITA facile complessa VARIABILI PREANALITICHE POSSIBILITA DI ERRORE minime minima/ nulla notevoli elevate

36 ABUSO CRONICO: MARCATORI OBSOLETI E NUOVI MARCATORI Nessun marcatore biologico, preso singolarmente, è sufficientemente preciso ed affidabile nella diagnosi dell alcolismo. Un marcatore diagnostico ideale di abuso alcolico dovrebbe: essere il prodotto di un fenomeno biochimico specificatamente correlato alla presenza o al metabolismo dell alcool; essere dipendente dal consumo di alcool; essere abbastanza sensibile da permettere una valutazione dei livelli di consumo alcolico minimi che si associano a danni fisici o psichici; essere caratterizzato da una cinetica di eliminazione ben nota cioè avere un t1/2 definito e relativamente breve in modo da poter monitorare l astinenza. 1) PROBLEMI SIA DIAGNOSTICI CHE PROGNOSTICI 2) INDIVIDUARE I FORTI BEVITORI 3) MONITORARE I PAZIENTI IN REMISSIONE 4) IDENTIFICARE LE EPATOPATIE DI ORIGINE ALCOLICA DALLE ALTRE

37 DIRETTI Sostanze legate alla eliminazione/metabolismo alcool INDIRETTI Sostanze modificate dall abuso recente o cronico dell alcool Alcool (sangue- urine- espirato) Acetaldeide Esteri Etilici Acidi grassi (FAEE) Fosfatidil Etanolo (PEth) Etilglucuronide (EtG) Etilsolfato (EtS) GammaGT Transaminasi (AST/ALT) Volume Corpuscolare Medio (MCV) Transferrina Carboidrato Carente (CDT) Apolipoproteina J 5- Idrossitriptofolo (5- HTOL) Alcool Acetaldeide Acuto Recente Cronico 5- Idrossitriptofolo (5- HTOL) Esteri Etilici Acidi grassi (FAEE) GammaGT Transaminasi (AST/ALT) Alcool espirato Etilglucuronide (EtG) Volume Corpuscolare Medio (MCV) Etilsolfato (EtS) Transferrina carboidrato Carente (CDT) Apolipoproteina J

38 Marcatori tradizionali MCV (Volume Corpuscolare Medio) È uno degli indici di Wintrobe Indica la dimensione dei Globuli Rossi ( in femtolitri) Nel 34-89% degli alcolisti vi è un valore elevato di MCV Condizioni in cui vi è elevazione del MCV: carenza di Folati e/o di Vit. B12, epatopatie croniche non alcol correlate, patologia ematologica (Sn. Mielodisplastiche), terapia con antineoplastici, ipotiroidismo, fumatori, terapia con antiepilettici MCV può rimanere elevato sino a tre mesi dopo astinenza Transaminasi (SGOT, SGPT) SGOT e SGPT sono indici di necrosi cellulare Non sono indicativi di danno specifico da etanolo Sono elevate nella patologia epatica, nella patologia cardiaca, nei danni iatrogeni, nelle patologie neoplastiche La sensibilità complessiva è appena del 30%!

39 MARCATORI DI FIBROSI EPATICA Il razionale è quello di individuare la fase precoce di danno epatico irreversibile Semplice prelievo di sangue, al posto dell epatobiopsia Peptide carbossi-terminale del procollagene tipo I Prodotti di degradazione del procollagene tipo I e IV Prodotti di degradazione del collagene tipo I Sostanze del connettivo non collagenico Inibitore tissutale della metallo proteinasi 1 Acido ialuronico Tessuto fibroso che si dosa comprende derivati del collagene (tipo I e tipo III), glicoproteine (Laminina) e proteoglicani. L eccesso di deposizione può dipendere non solo da aumentata produzione ma anche da deficit di attività della collagenasi Tra i marcatori proposti, che sarebbero importanti per svelare l avvio della fibrogenesi, c è il Pro-peptide amino terminale del collagene di tipo I, che sarebbe in grado di differenziare soggetti con fibrosi o cirrosi da coloro i quali hanno solo steatosi

40 DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DELL ABUSO CRONICO: MARCATORI DI RECENTE INTRODUZIONE CDT & ETILGLUCURONIDE!

41 CDT Nel 1976 Stibler e Kjiellin osservarono che nel LCS degli etilisti era presente una forma di Transferrina con pi > 5.7 Trasferrina Carboidrato Carente o Desialata È uno dei test di più recente introduzione per svelare l abuso alcolico Nel corso di astinenza il valore di CDT si normalizza con una emivita media di 15gg. Utile per il monitoraggio Il termine CDT è il nome collettivo di un gruppo di isoforme minori della transferrina che presentano un ridotto grado di glicosilazione, la cui concentrazione sierica risulta strettamente correlata all abuso alcolico

42 Transferrina (Tf) Glicoproteina con PM = 79,5 Kd Catena polipeptidica di 679 residui amminoacidici divisa in due domini : - N- terminale di 336 aa - C- terminale di 343 aa pi 5.7 La Tf non è una molecola omogenea, ma un insieme di isoforme che, in condizioni non patologiche, si distinguono per il numero di ioni Fe 3+ legati, per la complessità delle catene N-glicaniche e per il numero di residui di acido sialico L ABUSO ALCOLICO INTERFERISCE NELLA GLICOSILAZIONE DELLA TRANSFERRINA

43 TRANSFERRINA: isoforme relative ai legami col Fe TRANSFERRINA: isoforme relative alle catene glicaniche e ai residui di acido sialico

44 VARIABILITÀ PREANALITICA Il ritmo circadiano, la dieta ed i più comuni farmaci sembrano non influenzare la concentrazione sierica della CDT Batteri produttori di neuroaminidasi determinano la rimozione dei residui glicanici con produzione artificiale di forme a minore glicosazione E importante prevenire la contaminazione dei campioni ed ostacolare la crescita batterica In assenza di studi specifici in letteratura è consigliato il prelievo a digiuno STABILITÀ La CDT è stabile: a t.a. per 30 ore - a 4 C per alcune settimane - a 20 C per mesi - Martensson O, Brandt R. Stability of CDT in vivo and in vitro. (Abstract) Alcohol alcohol 1997; 32: 384 Il dosaggio della CDT non è influenzato dalla presenza di caolino o separatori di gel di poliacriloamide EDTA ed eparina potrebbero alterare la saturazione in vitro della Transferrina con ioni ferrici 2

45 Isoforme a pi>5.7 sono presenti nelle persone che assumono forti quantità di alcool Scompaiono dopo astinenza CDT è l insieme delle isoforme ASIALO, MONOSIALO, e DISIALO Isoforma Disialo è costituita da una catena con due residui di Acido sialico, mentre l Isoforma Asialo manca della struttura carboidratica La proteina è il prodotto di una duplicazione genica Deriva da un gene ancestrale che codifica una proteina con un legame in grado di legare un solo atomo di ferro La Tf si lega a recettori specifici della membrana cellulare che mediano l ingresso della proteina La densità dei recettori varia nei diversi tessuti: valori più alti sono stati riscontrati nei globuli rossi e nel tessuto placentare

46 METODI PER LA DETERMINAZIONE DELLA CDT METODI DI SCREENING Metodi immunometrici, diretti o indiretti. I metodi indiretti sono basati su una separazione delle glicoforme su colonnine assorbenti a scambio ionico e successiva reazione con anticorpo antitransferrina. Rilevazione del complesso antigeneanticorpo I metodi diretti utilizzano anticorpi anti-cdt.

47 METODI PER LA DETERMINAZIONE DELLA CDT HPLC Metodo di riferimento* ELETTROFORESI CAPILLARE Lettura 460 nm Separazione quantitativa Alta specificità Nessuna interferenza Lettura 210 nm Separazione qualitativa buona,scarsa specificità Interferenze: Componenti monoclonali, anticoagulanti orali, fusione beta gamma, elevate trisialo * proposta di un documento di consenso per la determinazione della Transferrina carboidrato carente (CDT) in ambito Clinico tossicologico E forense con particolare riguardo al codice della strada e alla sicurezza nei luoghi di lavoro (Workplace testing)(rev 3_2008)

48 Un campione negativo 1.18

49 MECCANISMO PROSPETTATO È stato postulato un meccanismo per cui vi sarebbe un degrado più lento della molecola Emivita :14gg Nel normale l emivita è 7gg Non è chiaro a tutt oggi il meccanismo che porta all incremento di CDT nell abuso di etanolo Sembra che l etanolo o un suo metabolita (Acetaldeide?) stimolino la sintesi della catena polipeptidica a livello della zona del Golgi

50 VARIABILITÀ PREANALITICA EDTA Temperatura Lipemia Emolisi Variazioni circadiane Provette con caolino o accelleratori Dieta Farmaci Fasi di congelamento e scongelamento Il consumo di 50-80g di etanolo per sette giorni induce un aumento della CDT

51 FALSI POSITIVI (CDT VS ϒGT) Patologia epatica ( carcinomi, cirrosi, metastasi, patologia ostruttiva) Scompenso cardiaco congestizio Trapianto renale Sindrome Mononucleosica Farmaci ( barbiturici, contraccettivi orali, DFI, tireostatici, anabolizzanti, cefalosporine)

52 FASE POSTANALITICA & INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO Valori soglia dipendono dalla metodica utilizzata Indicare nel referto la metodica utilizzata ed i relativi cut off!! Nella femmina i valori sono fisiologicamente più elevati IT IS NOT JUSTIFIED TO BASE ANY MEDICAL DECISION ON THE MEASUREMENT OF CDT CONCENTRATIONS,.. EVEN MORE FOR FORENSIC DECISIONS STIEBER P. ET AL. EUR J CLIN INVEST

53 Etil Glucuronide HO H HO COOH O H H O CH 3 E il marcatore di abuso alcolico definitivo? H OH H E un metabolita diretto dell alcool etilico (EtOH) Finestra temporale di 5 giorni Si forma per coniugazione dell EtOH con l acido glucuronico (nel fegato) Applicazione nel monitoraggio dei pazienti alcolisti Applicazioni cliniche e medico-legali Non evapora come l alcool Non si forma in seguito a fermentazione Non si forma o si elimina ad alte temperature (22 C) CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE PER EVENTUALI RIANALISI CON USO DI CONSERVANTI

54 Acuto Alcool Acetaldeide Alcool espirato Recente 5-Idrossitriptofolo (5- HTOL) Esteri Etilici Acidi grassi (FAEE) Etilglucuronide (EtG) Cronico GammaGT Transaminasi (AST/ALT) Volume Corpuscolare Medio (MCV) Etilsolfato (EtS) Trasferrina carboidrato Depleta (CDT) Apolipoproteina J La finestra di rilevazione è di circa 5 giorni

55 METODI PER LA DETERMINAZIONE DELLA EtG METODI DI SCREENING METODI DI CONFERMA METODO IMMUNOCHIMICO GC- MS

56 Scelta della matrice L EtG è rilevabile nel sangue per alcune ore, nell urina per alcuni giorni ed infine nei capelli, se l assunzione è sufficiente a permettere l incorporazione, fino a mesi di distanza. L analisi sarà effettuata quindi su sangue, per verificare assunzione nel momento immediatamente precedente il prelievo (o la morte, in caso di indagine necroscopica), nell urina e nei capelli, se sono d interesse i 2-3 giorni oppure i mesi precedenti!

57 Raccolta dei campioni di urine: Limitazione dei falsi negativi: refrigerare/congelare in provette contenenti sodio-fluoruro per inattivare beta-glucuronidasi Limitazione dei falsi positivi: utilizzare di sali di azide per previene la crescita batterica si consiglia di rapportare la concentrazione urinaria dell EtG alla creatinina

58 L EtG non è presente nell urina se non è stato consumato alcool non esiste virtualmente la possibilità di un falso positivo. Quantità minime di alcool ingerito involontariamente (colluttori, alimenti e prodotti farmaceutici) possono essere escluse attraverso l adozione di una opportuna soglia quantitativa decisionale (cutoff).

59 Schema dei test legenda: Etanolo Acuto 0 EtG/creat Recente 0 0 Cronico CDT % I CERCHI e le LINEE PIENE rappresentano le misure attuali di Alcool, CDT o EtG. I QUADRATI e le LINEE TRATTEGGIATE rappresentano ciò che non è stato misurato. Test su sangue CDT CDT Giorni settimana Test su urine L M M G V S D L M M G V EtG EtG EtG EtG EtG EtG Test su sangue Alc Alc Alc Alc Alc Alc

60 Astinenza Il Paziente non ha toccato alcool Etanolo EtG/creat Acuto Recente Cronico Test su sangue Giorni settimana Test su urine Test su sangue CDT CDT L M M G V S D L M M G V EtG EtG EtG EtG EtG EtG Alc Alc Alc Alc Alc Alc

61 Abuso Ethanol 0 Acute EtG/creat Resent 0 CDT % Chronic 0 Il Paziente beve pesantemente ogni giorno! Test su sangue CDT CDT Giorni settimana Test su urine L M M G V S D L M M G V EtG EtG EtG EtG EtG EtG Test su sangue Alc Alc Alc Alc Alc Alc

62 Disassuefazione dall Alcool Il Paziente ha smesso di bere! Ethanol Etanolo EtG/creat CDT % 0 Acute Acuto 0 Resent Recente 0 Chronic Cronico Blood Test su testing sangue CDT CDT Week Giorni days settimana Urine Test su Testing urine Test su sangue M L M T W M G T V F S D S M L M T W M G T V F EtG EtG EtG EtG EtG EtG Alc Alc Alc Alc Alc Alc

63 Weekend libero / libertà vigilata Ethanol Etanolo EtG/creat CDT % Il paziente usufruisce di un week end libero durante il quale ha il divieto di bere... EtG rivela che ha bevuto. 0 Acute Acuto 0 Resent Recente 0 Chronic Cronico Blood Test su testing sangue CDT CDT Week Giorni days settimana Urine Test su Testing urine Test su sangue M L M T W M G T V F S D S M L M T W M G T V F EtG EtG EtG EtG EtG EtG Alc Alc Alc Alc Alc Alc

64 Alcohol use / social drinker/bevitore occasionale Ethanol Etanolo EtG/creat CDT % Il paziente ha bevuto alcool durante il week end, partecipando ad una festa 0 Acute Acuto 0 Resent Recente 0 Chronic Cronico Blood Test su testing sangue CDT CDT Week Giorni days settimana Urine Test su Testing urine Test su sangue M L M T W M G T V F S D S M L M T W M G T V F EtG EtG EtG EtG EtG EtG Alc Alc Alc Alc Alc Alc

65 Abuso di alcool controllato Ethanol Etanolo EtG/creat CDT % Il Paziente sa esattamente quando smettere di bere per risultare negativo al test 0 Acute Acuto 0 Resent Recente 0 Chronic Cronico Blood Test su testing sangue CDT CDT Week Giorni days settimana Urine Test su Testing urine Test su sangue M L M T W M G T V F S D S M L M T W M G T V F EtG EtG EtG EtG EtG EtG Alc Alc Alc Alc Alc Alc

66 Non più scuse... Ethanol Etanolo EtG/creat CDT % Il Paziente ha la scusa di avere alti livelli di CDT a causa di alterazione genetica... Ma EtG rivela che ha bevuto. 0 Acute Acuto 0 Resent Recente 0 Chronic Cronico Blood Test su testing sangue CDT CDT Week Giorni days settimana Urine Test su Testing urine Test su sangue M L M T W M G T V F S D S M L M T W M G T V F EtG EtG EtG EtG EtG EtG Alc Alc Alc Alc Alc Alc

67 Episodi di ricaduta Il paziente, in trattamento di disassuefazione, ha avuto una ricaduta Ethanol Etanolo EtG/creat CDT % 0 Acute Acuto 0 Resent Recente 0 Chronic Cronico Blood Test su testing sangue CDT CDT Week Giorni days settimana Urine Test su Testing urine Test su sangue M L M T W M G T V F S D S M L M T W M G T V F EtG EtG EtG EtG EtG EtG Alc Alc Alc Alc Alc Alc

68 Alterazione genetica: alti livelli di CDT Ethanol Etanolo EtG/creat CDT % 0 Acute Acuto 0 Resent Recente 0 Chronic Cronico Blood Test su testing sangue CDT CDT Week Giorni days settimana Urine Test su Testing urine Test su sangue M L M T W M G T V F S D S M L M T W M G T V F EtG EtG EtG EtG EtG EtG Alc Alc Alc Alc Alc Alc

69 AMBITI APPLICATIVI EtG Workplace drug testing Completare il percorso diagnostico per uso/abuso di alcool = Alcool + EtG + CDT Alcolisti in trattamento = controllo ricadute Evidenziare i bevitori occasionali Controllare gli automobilisti = controllo assunzione EtOH con prelievo ritardato nel tempo Discriminazione di EtOH proveniente da processi fermentativi e/o inquinamento (es disinfezione pelle) Accertare l astinenza prima e dopo un trapianto di fegato Applicazioni forensi: determinare post mortem la causa del decesso, discriminare se l etanolo rinvenuto nel sangue cadaverico è ante mortem o post mortem

70 Diversi Cut Off Diverse Applicazioni 1000 ng\ml Consumo non Domestico 500 ng\ml Ingestione di Alcol Etilglucuronide Applicazioni Monitoraggio Alcolisti in Trattamento 500 ng\ml Ingestione di Alcol 100 ng\ml Totale astinenza da Alcol

71 SALIVA Il metodo è rapido non invasivo e correlabile al BAC La scarsa quantità ricavabile crea problemi per la determinazione in alcune strumentazioni e per la conservazione di eventuale controcampionatura Passaggio etanolo da sangue a ghiandole salivari L andamento nel tempo è simile a quello nel sangue La concentrazione più elevata è dovuta al tenore acqueo (990g/L vs 850g/L) Rapporto indicativo 1.082

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73 ALCOLEMIA DA VIVENTE E ALCOLEMIA DA CADAVERE: COSA CAMBIA E COME CAMBIA

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76 Per la diagnostica differenziale tra produzione di alcol indotta da proliferazione batterica e assunzione impropria ante mortem è stato sviluppato un metodo che contempla l utilizzo della PCR (polymerase chain reaction) per il rilievo rapido di Escherichia Coli, Proteus Vulgaris e Candida Albicans Ovviamente non è un approccio utilizzabile in qualsiasi laboratorio!! Farmaci assunti prima del decesso

77 Soluzioni possibili: Utilizzare il prelievo da Umor Vitreo! Matrice ideale per l interpretazione dell alcolemia post mortem? Ambiente protetto da invasione dei batteri, da traumi. in alternativa si potrebbe utilizzare il tessuto muscolare.

78 Utilizzare preferenzialmente la vena femorale.

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80 Ciò che si vede è il risultato di come si guarda Kierkegaard Grazie per l attenzione