Espressione della variante III dell EGFR nel Glioblastoma multiforme: significato prognostico ed influenza sulla risposta alla temozolomide.

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1 UNIVERSITÀ CATTOLICA DEL SACRO CUORE FACOLTÀ DI MEDICINA E CHIRURGIA A. GEMELLI ISTITUTO DI NEUROCHIRURGIA Progetto di ricerca dal titolo: Espressione della variante III dell EGFR nel Glioblastoma multiforme: significato prognostico ed influenza sulla risposta alla temozolomide. Proponente del progetto: Dr. Quintino Giorgio D Alessandris Medico Specializzando Istituto di Neurochirurgia Università Cattolica del Sacro Cuore Largo A. Gemelli Roma Telefono: Cellulare: Fax: giorgiodal@hotmail.it - 1 -

2 Centri e Ricercatori coinvolti Università Cattolica del Sacro Cuore, Facoltà di Medicina e Chirurgia A. Gemelli, Roma Istituto di Neurochirurgia - Dr. Roberto Pallini - Dr. Quintino Giorgio D Alessandris Istituto di Anatomia Patologica - Prof. Luigi Maria Larocca - Dott. Maurizio Martini Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento di Ematologia, Oncologia e Medicina Molecolare, Roma - Dott.ssa Lucia Ricci-Vitiani Breve presentazione dell oggetto di studio Con il presente progetto si intende studiare la rilevanza dell espressione della variante III del recettore per il fattore di crescita epiteliale (EGFRvIII) nel Glioblastoma multiforme (GBM). In particolare, se ne intende valutare l espressione nel tumore primario e nella recidiva, l impatto sulla prognosi, la correlazione con le altre variabili cliniche e biomolecolari, l influenza sulla sensibilità alla chemioterapia con temozolomide

3 Status questionis Il recettore del fattore di crescita epiteliale (EGFR) è un recettore tirosin-kinasico di 170 kda il cui gene è localizzato sul cromosoma 7p11.2. Si tratta di un recettore transmembrana con un dominio extracellulare, i cui ligandi sono il fattore di crescita epiteliale (EGF) ed il transforming growth factor alfa (TGF- ), ed un dominio intracellulare con attività protein-kinasica. Il legame dell EGF al suo recettore ne causa la dimerizzazione, che a sua volta attiva la via di segnalazione che coinvolge la fosfatidilinositolo-3 kinasi (PI3K), il fosfatidilinositolo trifosfato (PIP 3 ) ed infine attiva Akt, una tirosinkinasi fondamentale nella sopravvivenza cellulare e nella resistenza all apoptosi (van den Bent et al, 2007). L amplificazione del gene per l EGFR è l alterazione genetica più comune nel GBM primario, con una frequenza di circa il 40% (Gan et al, 2008). Una percentuale variabile di GBM che overesprimono EGFR (63-75%) presenta inoltre delle mutazioni del gene stesso, fra le quali la più frequente è la cosiddetta variante III, nella quale vengono deleti gli esoni dal 2 al 7, causando la perdita di 267 aminoacidi nel dominio extracellulare. Questo recettore mutato, incapace di legarsi al fattore di crescita, risulta però costitutivamente attivato, più resistente ai processi di degradazione intracellulari e probabilmente capace di attivare una maggior numero di vie di segnalazione intracellulari, per l abilità di formare omodimeri o eterodimeri non solo con l EGFR wild-tipe ma anche con altri membri della superfamiglia ErbB (Gan et al, 2008). Infatti, diversi studi sia in vitro che in vivo hanno evidenziato una maggiore capacità di invasione, proliferazione e tumorigenesi nelle cellule EGFRvIII positive (Nikishawa, 1994; Huang, 1997). Ciò premesso, tuttavia, dagli studi clinici su pazienti affetti da GBM non emerge un dato univoco sul significato prognostico dell espressione dell EGFRvIII nel tumore. In alcuni lavori i pazienti affetti da GBM EGFRvIII positivi sembrano avere una prognosi peggiore (Pelloski et al, 2007); in altri il dato è statisticamente non significativo (Brown et al, 2009); in altri ancora l espressione di EGFRvIII, in associazione con PTEN, una fosfatasi - 3 -

4 importante nell antagonizzare PI3K, appare un fattore predittivo positivo per la risposta ad Erlotinib, un farmaco inibitore tirosin-kinasico (Mellinghoff et al, 2005). Inoltre, dopo lo studio di Stupp et al del 2005, la terapia adiuvante con temozolomide è diventata uno standard di cura nel GBM, ma non è ancora chiaro se l espressione di EGFRvIII sia un fattore predittivo di risposta al farmaco. Originalità e rilevanza del progetto in ambito locale ed in ambito internazionale Sulla base di quanto su esposto, il presente studio si propone di analizzare l espressione dell EGFRvIII in pazienti sottoposti ad intervento di asportazione di GBM presso l Istituto di Neurochirurgia dell Università Cattolica del Sacro Cuore - Policlinico Universitario A. Gemelli in Roma. Tale dato sarà messo in relazione agli altri parametri clinici, terapeutici e biopatologici del singolo paziente. Sarà inoltre condotto uno studio in vitro per valutare l azione della temozolomide su cellule staminali di GBM isolate dai campioni tumorali e l effetto citostatico della temozolomide sarà correlato con il grado di espressione dell EGFRvIII. Il dato così ottenuto portà fornire una risposta sul significato prognostico e predittivo dell espressione dell EGFRvIII nel GBM, e sulla sua eventuale associazione con altri dati clinici, radiologici, patologici. Ciò avrà da un lato un importanza significativa per i singoli pazienti coinvolti nello studio, per i quali sarà possibile ottimizzare ed individualizzare il percorso terapeutico. D altra parte, i risultati dello studio saranno essenziali alla comprensione dei meccanismi biomolecolari del GBM e contribuiranno allo sviluppo di quella targeted therapy che è l obiettivo attuale dei ricercatori in neuro-oncologia (Krakstad et al, 2010). Descrizione delle tecniche e delle metodologie utilizzate Criteri di arruolamento: I pazienti verranno operati presso l Istituto di Neurochirurgia dell Università Cattolica del Sacro Cuore - Policlinico Universitario A

5 Gemelli in Roma. Verranno inclusi nello studio i pazienti alla prima diagnosi di GBM o i pazienti con recidiva di GBM per i quali siano disponibili i campioni di tessuto neoplastico prelevati al primo intervento. La diagnosi di GBM verrà stabilita secondo i criteri WHO Verrà acquisito un consenso informato per ogni paziente. Raccolta dei dati clinici: Di ogni singolo paziente verranno registrati i seguenti dati: età, sesso, sede e dimensioni del tumore, Karnofsky performance status pre e postoperatorio, durata della sintomatologia dall esordio alla chirurgia, tipo di intervento (asportazione totale, subtotale, parziale, biopsia), modalità e durata delle terapie adiuvanti, tempo e sede di recidiva, durata del follow-up, eventuale causa del decesso. La sopravvivenza globale (SG) sarà calcolata dalla diagnosi patologica di GBM al decesso o alla fine del follow-up. La progression-free survival (PFS) sarà calcolata dalla diagnosi patologica di GBM alla recidiva clinica o radiologica. Analisi dell espressione dell EGFRvIII: verrà eseguita mediante la tecnica della RT-PCR su sezioni deparaffinizzate di 10 m di spessore. Dopo l estrazione dell RNA, il cdna verrà sintetizzato come precedentemente descritto (Martini et al, 2008). I primer e le condizioni di PCR saranno analoghe a quelle utilizzate da Yoshimoto et al (2008). Nei pazienti per i quali saranno disponibili il campione tissutale primario e la recidiva, verrà eseguita un analisi quantitativa dell espressione dell EGFRvIII mediante Real- Time RT-PCR su campioni tissutali microdissezionati con laser. Analisi della metilazione di MGMT: verrà eseguita l estrazione del DNA da sezioni deparaffinizzate di 10 m di spessore e quindi una PCR metilazione-specifica per MGMT, come precedentemente descritto (Pallini et al, 2008). Analisi dell espressione di Ki67 and PTEN: verrà utilizzata una tecnica immunoistochimica utilizzando il complesso avidina-biotina-perossidasi, come precedentemente descritto (Falchetti et al, 2003)

6 Analisi della sensibilità in vitro alla temozolomide. Per questa analisi verranno utilizzate cellule staminali tumorali ottenute da campioni tissutali di GBM coltivati in medium privo di siero con l aggiunta dei fattori di crescita EGF e bfgf, come descritto in un precedente lavoro (Pallini et al, 2008). Le colture saranno saggiate per l espressione di EGFRvIII con metodica PCR. Verranno quindi aggiunte concentrazioni crescenti di temozolomide alle colture. La vitalità cellulare sarà testata come descritto da Eramo et al (2006). Obiettivi, risultati attesi e modalità di monitoraggio: Obiettivi Indicatori di risultato Risultati attesi a metà progetto Risultati attesi al termine del progetto Tecniche di analisi dei dati Positività dell analisit RT- PCR per EGFRvIII. Correlazione status EGFRvIII-PFS e SG. Valutazione dell impatto dello status di EGFRvIII sulla prognosi Registrazione delle terapie adiuvanti Registrazione periodica delle condizioni cliniche e delle modalità di recidiva Correlazione preliminare EGFRvIII-PFS Correlazione status EGFRvIII e modalità di recidiva Correlazione EGFRvIII e risposta alle terapie. Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier; logrank test. Valutazione degli eventuali fattori clinici che influenzano la prognosi Registrazione per ogni paziente dei dati clinici come indicato sopra Identificazione preliminare dei dati clinici prognosticamente significativi Identificazione dei dati clinici significativi. Valutazione della correlazione fra questi dati e lo status di EGFRvIII Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier; logrank test. Analisi multivariata (Cox proportional hazards model) - 6 -

7 Valutazione degli eventuali fattori biomolecolari che influenzano la prognosi Positività della PCR metilazionespecifica per MGMT. Positività immunoistochimica per PTEN. Percentuale di cellule positive per Ki67 Identificazione preliminare dei dati biomolecolari prognosticamente significativi. Identificazione dei dati biomolecolari significativi. Valutazione della correlazione fra questi dati e lo status di EGFRvIII Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier; logrank test. Analisi multivariata (Cox proportional hazards model) Valutazione della diversa espressione di EGFRvIII nel tumore primario e nella recidiva Positività assoluta della RT-PCR per EGFRvIII e determinazione quantitativa di EGFRvIII nel tumore primario e nella recidiva. Valutazione iniziale di un eventuale variazione dell espressione di EGFRvIII nelle recidive. Valutazione della variazione di EGFRvIII nella recidiva. Correlazione fra la variazione di EGFRvIII e sopravvivenza dei pazienti Analisi di regressione lineare Valutazione dell influenza della terapia con temozolomide sulla prognosi dei pazienti in dipendenza dallo status dell EGFRvIII Vitalità in vitro di cellule staminali tumorali di GBM, EGFRvIII positive e negative, dopo esposizione alla temozolomide Identificazione del corretto dosaggio della temozolomide Correlazione preliminare fra la sensibilità alla temozolomide delle cellule staminali di GBM e lo status dell EGFRvIII Correlazione fra la sensibilità alla temozolomide delle cellule staminali di GBM elo status dell EGFRvIII Comparazione fra il risultato in vitro e l impatto prognostico dell EGFRvIII come emerso dallo studio clinico Test di comparazione fra due popolazioni Aspetti innovativi della ricerca Studio sistematico del ruolo di EGFRvIII nella storia naturale del GBM: della sua importanza prognostica, del ruolo nella resistenza alle terapie adiuvanti, in particolare alla temozolomide, del ruolo nelle modalità e nel timing dello sviluppo di recidive

8 Rispetto agli studi precedenti, in molti dei quali la determinazione di EGFRvIII era effettuata con metodica immunoistochimica, l uso della RT-PCR standard o quantitativa (real-time) rappresenta un elemento di importante innovazione, per la sua superiore sensibilità e specificità, come chiaramente dimostrato da Yoshimoto et al (2008). Nel nostro studio, inoltre, combineremo indicatori clinici e biomolecolari, sul tumore primario e sulla recidiva, ed incroceremo questi dati con risultati in vitro da esperimenti su cellule staminali di GBM. È noto che le cellule staminali tumorali conservano le proprietà della neoplasia di origine e sono in grado di ricapitolarla: risultano pertanto un modello sperimentale più affidabile rispetto alle tradizionali linee cellulari immortalizzate di GBM (Pallini et al, 2008). L analisi della vitalità di cloni di cellule staminali di GBM, con differente espressione di EGFRvIII, dopo esposizione alla temozolomide, rappresenta pertanto il modello in vitro più attendibile per studiare il valore predittivo di risposta alla chemioterapia dello status di EGFRvIII. Fattibilità Lo stretto follow-up clinico e neuroradiologico dei pazienti con GBM è già una realtà nel nostro Istituto da diversi anni. I laboratori collegati all Istituto di Neurochirurgia dell Università Cattolica del Sacro Cuore Policlinico Universitario A. Gemelli sono provvisti degli strumenti necessari per realizzare l analisi oggetto del presente lavoro. In particolare, la creazione di linee di cellule staminali tumorali di GBM dal tessuto primario è una pratica consolidata nella nostra Struttura (Pallini et al, 2008). La collaborazione con l Istituto Superiore di Sanità in campo neuro-oncologico è attestata dai numerosi studi effettuati in comune negli ultimi anni (Pallini et al, 2010; Pallini et al, 2008; Ricci-Vitiani et al, 2008; Falchetti et al, 2008; Ricci-Vitiani et al, 2006; Eramo et al, 2006; Eramo et al, 2005.) - 8 -

9 Ricadute applicative L analisi delle correlazioni fra status di EGFRvIII, parametri clinici e biomolecolari, tipologia e durata delle terapie adiuvanti, timing e modalità della recidiva tumorale, analisi della sensibilità alla temozolomide, potrà contribuire a migliorare il percorso di cura dei pazienti affetti da GBM, fornendo informazioni più attendibili sulla prognosi e sull efficacia dei diversi trattamenti. Nella nostra Istituzione l analisi biomolecolare del GBM è lo standard neuro-oncologico, in linea con i principi della medicina cosiddetta traslazionale. I risultati di questo studio contribuiranno a giustificare i costi di un simile approccio in termini di miglioramento della cura globale del paziente. Continuità e replicabilità Il passo successivo di questo studio potrà essere la valutazione dell efficacia dei farmaci inibitori specifici dell EGFR o delle tirosin-kinasi in dipendenza dallo status di EGFRvIII (Mellinghoff et al del 2005). Tali farmaci potranno essere usati anche in associazione ad altri chemioterapici. Questo lavoro potrà essere eseguito in vivo su modelli animali o come sperimentazione clinica di fase II o III. Le analisi che verranno praticate nei nostri Laboratori sono conformi a quanto già viene realizzato in altre Istituzioni, pertanto non vi sono dubbi sulla replicabilità del presente studio

10 Bibliografia Brown PD, Krishnan S, Sarkaria JN, Wu W, Jaeckle KA, Uhm JH, Geoffroy FJ, Arusell R, Kitange G, Jenkins RB, Kugler JW, Morton RF, Rowland KM Jr, Mischel P, Yong WH, Scheithauer BW, Schiff D, Giannini C, Buckner JC; North Central Cancer Treatment Group Study N0177. Phase I/II trial of erlotinib and temozolomide with radiation therapy in the treatment of newly diagnosed glioblastoma multiforme: North Central Cancer Treatment Group Study N0177. J Clin Oncol Dec 1;26(34): Epub 2008 Oct 27. Eramo A, Ricci-Vitiani L, Zeuner A, Pallini R, Lotti F, Sette G, Pilozzi E, Larocca LM, Peschle C, De Maria R. Chemotherapy resistance of glioblastoma stem cells. Cell Death Differ Jul;13(7): Epub 2006 Feb 3. Eramo A, Pallini R, Lotti F, Sette G, Patti M, Bartucci M, Ricci-Vitiani L, Signore M, Stassi G, Larocca LM, Crinò L, Peschle C, De Maria R. Inhibition of DNA methylation sensitizes glioblastoma for tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligandmediated destruction. Cancer Res Dec 15; 65(24): Falchetti ML, Mongiardi MP, Fiorenzo P, Petrucci G, Pierconti F, D'Agnano I, D'Alessandris G, Alessandri G, Gelati M, Ricci-Vitiani L, Maira G, Larocca LM, Levi A, Pallini R. Inhibition of telomerase in the endothelial cells disrupts tumor angiogenesis in glioblastoma xenografts. Int J Cancer 2008 Mar 15; 122(6): Falchetti ML, Pierconti F, Casalbore P, Maggiano N, Levi A, Larocca LM, Pallini R. Glioblastoma induces vascular endothelial cells to express telomerase in vitro. Cancer Res 2003;63:

11 Gan, HK, Kaye AH and Luwor RB. The EGFRvIII variant in glioblastoma multiforme. J Clin Neurosci 2009; 16: Hegi ME, Diserens AC, Gorlia T, Hamou MF, de Tribolet N, Weller M, Kros JM, Hainfellner JA, Mason W, Mariani L, Bromberg JE, Hau P, Mirimanoff RO, Cairncross JG, Janzer RC, Stupp R. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N Engl J Med 352: , 2005 Huang HS, Nagane M, Klingbeil CK, Lin H, Nishikawa R, Ji XD, Huang CM, Gill GN, Wiley HS, Cavenee WK. The enhanced tumorigenic activity of a mutant epidermal growth factor receptor common in human cancers is mediated by threshold levels of constitutive tyrosine phosphorylation and unattenuated signaling. J Biol Chem Jan 31; 272(5): Krakstad C and Chekenya M. Survival signalling and apoptosis resistance in glioblastomas: opportunities for targeted therapeutics. Mol cancer 2010 Jun 1; 9:135 Martini M, Pallini R, Luongo G, Cenci T, Lucantoni C, Larocca LM. Prognostic relevance of SOCS3 hypermethylation in patients with glioblastoma multiforme. Int J Cancer 123: , 2008 Mellinghoff IK, Wang MY, Vivanco I, Haas-Kogan DA, Zhu S, Dia EQ, Lu KV, Yoshimoto K, Huang JH, Chute DJ, Riggs BL, Horvath S, Liau LM, Cavenee WK, Rao PN, Beroukhim R, Peck TC, Lee JC, Sellers WR, Stokoe D, Prados M, Cloughesy TF, Sawyers CL, Mischel PS. Molecular determinants of the response of glioblastomas to EGFR kinase inhibitors. N Engl J Med Nov 10;353 (19):

12 Nishikawa R, Ji XD, Harmon RC, Lazar CS, Gill GN, Cavenee WK and Huang H-JS A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity. Proc Natl Acad Sci U S A 1994; 91: Pallini R, Ricci-Vitiani L, Montano N, Mollinari C, Biffoni M, Cenci T, Pierconti F, Martini M, De Maria R, Larocca LM. Expression of the stem cell marker CD133 in recurrent glioblastoma and its value for prognosis. Cancer 2010 Aug 30. [Epub ahead of print] Pallini R, Ricci-Vitiani L, Banna GL, Signore M, Lombardi D, Todaro M, Stassi G, Martini M, Maira G, Larocca LM, De Maria R. Cancer stem cell analysis and clinical outcome in patients with glioblastoma multiforme. Clin Cancer Res Dec 15;14(24): Pelloski CE, Ballman KV, Furth AF, Zhang L, Lin E, Sulman EP, Bhat K, McDonald JM, Yung WK, Colman H, Woo SY, Heimberger AB, Suki D, Prados MD, Chang SM, Barker FG 2nd, Buckner JC, James CD, Aldape K. Epidermal growth factor receptor variant III status defines clinically distinct subtypes of glioblastoma. J Clin Oncol Jun 1;25(16): Ricci-Vitiani L, Pallini R, Larocca LM, Lombardi DG, Signore M, Pierconti F, Petrucci G, Montano N, Maira G, De Maria R. Mesenchymal differentiation of glioblastoma stem cells. Cell Death Differ 2008 Sep; 15(9): Ricci-Vitiani L, Pierconti F, Falchetti ML, Petrucci G, Maira G, De Maria R, Larocca LM, Pallini R. Establishing tumor cell lines from aggressive telomerase-positive chordomas of the skull base. Technical note. J Neurosurg 2006 Sep; 105(3):

13 Stupp R, Mason WP, van den Bent MJ, Weller M, Fisher B, Taphoorn MJ, Belanger K, Brandes AA, Marosi C, Bogdahn U, Curschmann J, Janzer RC, Ludwin SK, Gorlia T, Allgeier A, Lacombe D, Cairncross JG, Eisenhauer E, Mirimanoff RO; European Organisation for Research and Treatment of Cancer Brain Tumor and Radiotherapy Groups; National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for patients with newly diagnosed glioblastoma. N Engl J Med 352: , 2005 van den Bent MJ and Kros JM. Predictive and Prognostic Markers in Neuro- Oncology. J Neuropathol Exp Neurol 2007 Dec; 66(12): Yoshimoto K, Dang J, Zhu S, Nathanson D, Huang T, Dumont R, Seligson DB, Yong WH, Xiong Z, Rao N, Winther H, Chakravarti A, Bigner DD, Mellinghoff IK, Horvath S, Cavenee WK, Cloughesy TF, Mischel PS. Development of a real-time RT-PCR assay for detecting EGFRvIII in glioblastoma samples. Clin Cancer Res 14: ,