mammifero onorario Università degli Studi di Milano Settore Didattico, via Celoria 20, Milano Laboratorio 105

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1 LIEVITO mammifero onorario Università degli Studi di Milano Settore Didattico, via Celoria 20, Milano Laboratorio 105

2 Indice 1. Conoscenze preliminari p Terminologia e concetti di base della genetica classica p Le leggi di Mendel p Interazioni tra alleli p La mitosi p La meiosi p Importanza degli organismi modello nella ricerca biologica p Il lievito Saccharomyces cerevisiae come organismo modello p Classificazione dei lieviti p Utilizzo del lievito in biotecnologie tradizionali p Il ciclo vitale del lievito Saccharomyces cerevisiae p Il controllo del sesso in S. cerevisiae p Il ciclo cellulare di S. cerevisiae p Nomenclatura dei geni di lievito p Isolamento ed utilizzo di mutanti di lievito temperatura-sensibili p La scoperta dei mutanti cdc per lo studio del ciclo cellulare p Cenni di biologia molecolare del lievito p Il genoma del lievito S. cerevisiae p Clonaggio di un gene di lievito p La distruzione dei geni e l analisi dei loro fenotipi p La coltivazione dei lieviti in laboratorio p Strumentazione e materiali a disposizione p Principali prefissi e unità di misura usati in biologia cellulare e molecolare p Protocolli sperimentali p Esperimento di complementazione p Norme di lavoro p Coniugazione di cellule di lievito di sesso opposto p Replica-plating modificato p Osservazione al microscopio di cellule di lievito selvatiche e di mutanti cdc bloccati in diverse fasi del ciclo cellulare p Norme di sicurezza in laboratorio p Domande di autovalutazione p Glossario p Bibliografia e siti web utili p Concorso Una settimana da ricercatore p. 32 2

3 1. Conoscenze preliminari 1.1 Terminologia e concetti di base della genetica classica Ogni cromosoma può essere immaginato come una successione lineare di geni o loci (singolare, locus). Un gene è il determinante di una caratteristica di un organismo; in genere, codifica per una proteina o un RNA. Si definisce locus il sito specifico su un cromosoma in cui è localizzato un certo gene (Fig ). Uno stesso gene può esistere in più forme alternative, dette alleli. Ogni coppia di cromosomi omologhi contiene la stessa successione di geni, ma non necessariamente la stessa successione di alleli. Ad esempio, il gene che controlla il colore del pelo può esistere in due forme alternative (alleli), uno che determina pelo nero, l'altro pelo marrone. Quindi, se su un cromosoma in un dato locus è presente l allele che determina pelo nero, sul cromosoma omologo nel locus corrispondente sarà presente lo stesso gene (gene per il colore del pelo), ma l allele può essere diverso. Ad es. può esservi l allele che determina pelo marrone. Se i due alleli di uno stesso gene sono uguali, l individuo è omozigote (ad es. ha genotipo AA oppure aa). Se i due alleli sono diversi, l individuo è eterozigote (ad es. il genotipo è Aa). Un individuo omozigote produce un solo tipo di gamete relativamente a quel locus (A oppure a). Un individuo eterozigote produce due tipi di gameti (A e a) in ugual quantità, cioè in rapporto 1:1. Il genotipo è la costituzione genetica di un organismo. Il fenotipo è la manifestazione visibile o in qualche modo evidenziabile di Fig Fenotipo, genotipo e ambiente. Il fenotipo è la risultante dell interazione di tre fattori: il genotipo, l azione di altri geni e dei loro prodotti: (ad es. gli ormoni) e l ambiente (ad es. l alimentazione). Fig Definizione di locus, allele ed altri termini di genetica (vedi testo e didascalie all interno della Figura) un carattere genetico. Il fenotipo è determinato dal genotipo, dall azione di altri geni e dei loro prodotti e dalla sua interazione con l ambiente (Fig ). Ad es. la diversa colorazione del pelo dei gatti siamesi nelle regioni del corpo più esposte al raffreddamento (come zampe, orecchie), è dovuta all influenza dell ambiente (temperatura più bassa). In genetica, l accoppiamento tra due individui è detto incrocio ed è rappresentato con il simbolo x. 1.2 Le leggi di Mendel Gregor Mendel a metà dell Ottocento scoprì le leggi che governano la trasmissione ereditaria dei caratteri monofattoriali (controllati da un singolo gene, detti anche caratteri mendeliani semplici). Le leggi di Mendel, che trovano la loro base biologica nel processo della meiosi (vedi più avanti), sono le seguenti: - I legge di Mendel o legge dell uniformità della prima generazione ibrida. Essa afferma che l incrocio tra individui della generazione parentale (o generazione P), ciascuno omozigote per due alleli diversi di uno stesso gene (ad es. BB x bb) e che quindi differisce dall altro genitore per una caratteristica (ad es. pelo nero o marrone), dà una progenie (detta generazione F 1 o prima generazione filiale), costituita da individui tutti identici tra loro (tutti eterozigoti; ad es. Bb) (Fig ). 3

4 Fig Prima e seconda legge di Mendel. Per la spiegazione, vedi il testo. eterozigote, produce 1/2 gameti B e 1/2 b. Ne consegue che in F 2 nasceranno ad es. figli BB con frequenza 1/2 x 1/2 = 1/4. - III legge di Mendel o legge dell assortimento indipendente. Essa afferma che nell incrocio tra individui che differiscono per due caratteri controllati ciascuno da coppie alleliche localizzate su cromosomi diversi (ad es., BbSs x BbSs), le due coppie di alleli si assortiscono indipendentemente. Si formano quindi da ogni genitore gameti BS, Bs, bs e bs, ciascuno con frequenza 1/4 (25%). Si ottiene quindi una progenie con fenotipi BS, Bs, bs e bs in rapporto di 9:3:3:1 (Fig ). La base fisica della III legge di Mendel consiste nel fatto che l assortimento (segregazione) di una coppia di cromosomi omologhi è casuale e indipendente dalla segregazione di un altra coppia di cromosomi omologhi. Ciascun genitore della generazione parentale è una linea pura, cioè è omozigote per quel carattere (ad es. AA). Una linea pura è, infatti, un insieme di individui, il cui incrocio (ad es. AA x AA) dà origine ad individui sempre con lo stesso carattere dei genitori. La base fisica dell uniformità degli individui della F 1 è costituita dal fatto che i due genitori BB e bb, essendo omozigoti, producono, il primo, solo gameti B e, il secondo, solo gameti b. Ne consegue che gli individui della F 1 sono tutti eterozigoti Bb, quindi tutti uguali tra loro. - II legge di Mendel o legge della segregazione. Essa afferma che l incrocio tra individui eterozigoti (Bb x Bb) dà una progenie (detta generazione F 2 o seconda generazione filiale), in cui compaiono genotipi diversi in rapporti genotipici definiti e costanti: 1/4 BB, 1/2 Bb e 1/4 bb (Fig ). La base fisica della II legge di Mendel è data dal fatto che nell'individuo eterozigote Bb i due alleli (B e b) si separano (segregano) l uno dall altro durante la formazione dei gameti. Ogni individuo della F 1 quindi, essendo 1.3 Interazione tra alleli (dominanza completa, incompleta, codominanza) Fig Terza legge di Mendel. Per la spiegazione, vedi il testo. Dato che di uno stesso gene possono esistere due o più alleli e che in un individuo possono essere presenti due alleli diversi di uno stesso gene, il fenotipo risultante dipenderà dalla interazione tra i due alleli. Le interazioni tra alleli possono essere di: - dominanza completa, quando un allele, detto allele dominante, maschera completamente l espressione dell altro allele, detto allele recessivo. Ne deriva che il fenotipo dell individuo omozigote dominante (AA) è indistinguibile da quello dell eterozigote (Aa). Ad es. gli individui della F 1, in caso di dominanza completa, hanno lo stesso fenotipo di uno dei due genitori, cioè fra i due caratteri che si incontrano, uno solo prevale. In caso di dominanza completa, nella II legge di Mendel si ottengono rapporti di segregazione fenotipica (fenotipi A e a) di 3:1. - codominanza, quando in un eterozigote (Aa) entrambi gli alleli si manifestano fenotipicamente, cioè vengono espressi entrambi. Un esempio classico si ha nel caso degli alleli I A e I B del gruppo sanguigno ABO. - dominanza incompleta o dominanza intermedia, quando il fenotipo dell individuo eterozigote (Aa) è intermedio tra quello dei due omozigoti (AA e aa). Un esempio classico è il colore del fiore Bella di notte 4

5 (Fig ). In caso di dominanza intermedia, i rapporti di segregazione fenotipica in F 2 non sono di 3:1, ma di 1:2:1 (1/4 dei fenotipi è uguale a quello di un parentale, 1/2 a quello degli individui della F 1 e 1/4 all'altro parentale). La teoria cromosomica dell ereditarietà dei caratteri stabilisce che i geni sono localizzati sui cromosomi. Quindi la trasmissione dei geni da una cellula somatica ad un'altra oppure da una generazione all'altra è dovuta alla trasmissione dei cromosomi. Da qui, l importanza di studiare i cromosomi e il loro comportamento durante la mitosi e la meiosi. 1.4 La mitosi Il ciclo cellulare è il programma genetico che sovrintende la divisione delle cellule (Fig ). Il ciclo cellulare è costituito da 4 fasi: la fase G1 (G = Gap = intervallo) che prepara alla replicazione dei cromosomi che avviene nella fase S; la fase G2 che prepara alla mitosi. Quindi la mitosi (fase M) é una fase del ciclo cellulare, anche se spesso si parla di ciclo mitotico. Fig Dominanza intermedia. In caso di dominanza intermedia (detta anche incompleta), l individuo eterozigote ha un fenotipo intermedio tra quello dei due parentali. In questo esempio, i fiori della generazione parentale sono rossi (individuo RR) o bianchi (individuo rr; gli individui eterozigoti (Rr) hanno fiori rosa. Fig Le varie fasi del ciclo cellulare di una cellula eucariotica. La mitosi è la fase del ciclo cellulare in cui i cromosomi vengono segregati nelle due cellule figlie che si generano ad ogni divisione cellulare. Ogni cromosoma viene duplicato durante la fase S, per cui, all inizio della mitosi ogni cromosoma è costituito da due copie identiche (dette cromatidi fratelli ed uniti attraverso il centromero), che si distribuiscono nelle due cellule figlie al termine della mitosi (Fig ). Nella mitosi si distinguono 4 sottofasi, chiamate profase, metafase, anafase e telofase. Gli eventi caratteristici della mitosi visti nel contesto del ciclo cellulare sono riassunti nella Fig La mitosi termina con la citochinesi, ovvero la divisione del citoplasma. La mitosi porta alla produzione di cellule che sono geneticamente identiche tra loro e alla cellula da cui si sono originate. La mitosi quindi è una divisione cellulare che non genera, normalmente, variabilità genetica. Fig Cromatidi fratelli. Ogni cromosoma viene duplicato durante la fase S dell interfase, che precede la mitosi. All inizio della mitosi ogni cromosoma è pertanto costituito da due copie identiche, dette cromatidi fratelli, unite in corrispondenza del centromero. Al termine della mitosi, vi è la distribuzione di ciascun cromatidio in ciascuna cellula figlia. Ciò fa sì che le cellule figlie siano geneticamente uguali tra loro e alla cellula madre. 5

6 Fig La mitosi. Sono riassunti schematicamente gli eventi che accadono in un ciclo mitotico in una ipotetica cellula contenente due coppie di cromosomi e, quindi 4 molecole di DNA per cellula. I cromosomi si duplicano nella fase S e quindi il numero di molecole di DNA diventa 8 e sin dall inizio (profase) della mitosi ciascun cromosoma è costituito da due cromatidi fratelli. In metafase ciascun cromosoma si allinea sulla piastra metafasica ed i due cromatidi fratelli si separano, migrano ai poli opposti della cellula in anafase e si separano nelle due cellule figlie dopo la citochinesi (notate la differenza con la I divisione meiotica in Fig ). Alla fine del processo mitotico il numero di molecole di DNA e di cromosomi rimane costante. 1.5 La meiosi La meiosi è il processo di divisone cellulare che porta alla formazione di cellule germinali o gameti. Essa è costituita da due successive divisioni cellulari (la I divisione meiotica e la II divisione meiotica), precedute da una sola duplicazione del DNA, che avviene nella fase S che precede la I divisione meiotica. Gli eventi della meiosi sono presentati in Fig Fig Principali eventi genetici della meiosi. Essi sono: 1) la duplicazione del DNA che avviene una volta sola, prima che inizi la I divisione meiotica; 2) la separazione dei cromosomi omologhi alla meiosi I e 3) la separazione dei cromatidi fratelli alla meiosi II. Notare l'appaiamento dei cromosomi omologhi alla meiosi I con possibilità di scambio di parti tra essi (crossing-over). Gli eventi che caratterizzano la prima divisione meiotica sono unici tra tutte le divisioni cellulari. Dopo la replicazione del DNA cromosomico durante la fase S, un aspetto chiave della I divisione meiotica consiste nel fatto che i centromeri che uniscono i cromatidi fratelli rimangono intatti per tutta la durata della divisione e non si separano come accade in mitosi. Con il procedere della divisione i cromosomi omologhi di ciascuna coppia si allineano sul piano equatoriale della cellula e, attraverso meccanismi di ricombinazione (crossing-over) si scambiano delle parti generando variabilità genetica. Successivamente, 6

7 i due cromosomi omologhi (ognuno costituito dai due cromatidi fratelli) vengono tirati ai poli opposti della cellula generando, dopo la citochinesi, due cellule con un numero ridotto (la metà) di cromosomi. Per tale motivo, la I divisione meiotica è anche detta divisione riduzionale. Prima della II divisione meiotica non si ha duplicazione del DNA, e solo al termine della II divisione meiotica avviene la separazione dei cromatidi fratelli di ciascun cromosoma. Alla fine dell intero processo, il numero dei cromosomi si è ridotto alla metà, per cui partendo da cellule diploidi si sono originate cellule aploidi: i gameti. 2. Importanza degli organismi modello nella ricerca biologica Uno degli obiettivi principali della ricerca biologica è certamente quello di comprendere le basi molecolari dei processi che controllano la divisione e proliferazione cellulare ed ancora più in generale la fisiologia di una cellula. Alterazioni in questi meccanismi determinano fenomeni patologici che sappiamo essere la causa di molte malattie nell uomo. La ricerca biomedica ha quindi lo scopo di comprendere questi processi biologici per poter migliorare la salute ed il benessere, principalmente, della specie umana. Tuttavia, l uomo non è l organismo più idoneo per la sperimentazione biologica. Una regola fondamentale della ricerca è quella di saper scegliere l organismo più semplice ed opportuno per affrontare il problema scientifico a cui si cerca di trovare una risposta. Per questo motivo, i biologi molecolari hanno focalizzato la loro attenzione su alcuni organismi modello che sono particolarmente utili nella ricerca: tra i più importanti ci sono: il batterio Escherichia coli, il lievito Saccharomyces cerevisiae, il nematode Caenorhabditis elegans, il moscerino della frutta Drosophila melanogaster, il pesce Dania rerio (zebrafish), il topo Mus musculus, la pianta Arabidopsis thaliana. E oggi scientificamente dimostrato che i meccanismi molecolari che controllano l espressione dei geni sono molto simili, e spesso identici, in organismi evolutivamente molto distanti tra di loro. Gran parte degli studi di biologia molecolare dei geni sono, quindi, eseguiti sugli organismi modello e la scelta del modello più appropriato dipende dalle domande alle quali gli scienziati cercano una risposta. Jacques Monod, premio Nobel nel 1965, a chi gli chiedeva quale fosse la rilevanza generale dei suoi studi sul controllo dell espressione dei geni nel batterio Escherichia coli, era solito rispondere: quello che è vero per E. coli è quasi sicuramente vero anche per un elefante. Gli organismi modello più utilizzati non sono molti; devono infatti rispondere ad una serie di requisiti pratici e teorici affinché ad essi possano essere applicate le tecnologie della moderna ricerca biologica: 1) il loro utilizzo deve essere economico; 2) devono poter essere tenuti in condizioni controllate di laboratorio occupando il minor spazio possibile; 3) devono avere un ciclo di riproduzione rapido; 4) devono originare una progenie numerosa; 5) la sequenza del loro genoma deve essere nota; 6) devono avere caratteristiche che permettano l applicazione delle più moderne tecnologie genetiche e molecolari. 2.1 Il lievito come organismo modello nelle ricerca biologica Il lievito di birra Saccharomyces cerevisiae è uno degli organismi modello più utilizzati per tutta una serie di caratteristiche che descriveremo in questa dispensa, al punto tale che qualche hanno fa nell ambito di una importante manifestazione scientifica è stato nominato mammifero onorario!!! Tuttavia, altre specie di lievito sono utilizzate in laboratorio per studi di Genetica e Biologia Molecolare. Tra queste, il lievito Schizosaccharomyces pombe. A differenza di S. cerevisiae che si divide per gemmazione, S. pombe si divide per scissione mediana (Fig ). Il primo ha una forma elissoidale, il secondo ha una forma a bastoncino. Fig Fotografie al microscopio del lievito gemmante (budding) Saccharomyces cerevisiae e del lievito Schizosaccharomyces pombe. 7

8 2.2 Classificazione dei lieviti Sono state catalogate più di mille specie di lieviti. La maggior parte appartengono al gruppo degli Ascomiceti: sono quindi dei funghi unicellulari. Il fatto di essere un eucariote unicellulare rappresenta la caratteristica più rilevante del suo successo come organismo modello. Infatti, tali organismi offrono numerosi vantaggi come modello per la sperimentazione: hanno genomi piccoli rispetto ad altri eucarioti e, quindi, un altrettanto piccolo numero di geni (vedi più avanti); vengono cresciuti in laboratorio in modo molto semplice, analogamente a quanto si può fare con i batteri; nonostante la loro semplicità, le cellule di S. cerevisiae hanno le stesse caratteristiche generali di eucarioti multicellulari (Fig.2.2.1). I lieviti hanno un nucleo distinto circondato da una membrana nucleare ed il loro citoplasma è dotato dell intero corredo di organelli cellulari (mitocondri, vacuoli, apparato di Golgi etc.) presenti in altre cellule eucariotiche. Il lievito S. cerevisiae, oltre che da una tipica membrana cellulare, è circondato all esterno da una parete cellulare piuttosto resistente. Come si può osservare dall albero filogenetico mostrato in Fig , il lievito S. cerevisiae è evolutivamente più vicino all uomo di Fig Schema della struttura di una cellula del lievito S. cerevisiae. Si può notare che, nonostante il lievito sia un eucariote unicellulare, mantiene tutte le strutture e gli organelli presenti negli eucarioti multicellulari, quali i mammiferi. altri eucarioti e, infatti, gran parte delle scoperte scientifiche fatte utilizzando il lievito come organismo modello si sono dimostrate vere anche per i mammiferi, incluso l uomo. Fig Albero filogenetico che suddivide gli organismi nei tre regni dei BATTERI, ARCHEOBATTERI ed EUCARIOTI. Si può notare la vicinanza evolutiva del lievito (Saccharomyces) e dell uomo (Homo). 8

9 2.3 Utilizzo del lievito in biotecnologie tradizionali Da migliaia di anni il lievito S. cerevisiae è stato "addomesticato" dall uomo per la produzione di pane, vino e birra. È quindi un organismo utilizzato per una serie di processi biotecnologici naturali di cui oggi si conoscono i meccanismi chimici e molecolari. Mentre alcuni lieviti utilizzano esclusivamente la respirazione aerobica, altri, in assenza di ossigeno, possono passare ad un processo di respirazione anaerobica, chiamato fermentazione. I lieviti fermentanti producono energia convertendo gli zuccheri in anidride carbonica ed etanolo. Nella fermentazione delle bevande è utile la produzione dell'etanolo, mentre nella lievitazione del pane l'anidride carbonica gonfia la pasta e l'alcool (etanolo) evapora. Un esempio con un substrato di glucosio: C 6 H 12 O 6 (glucosio) 2C 2 H 5 OH + 2CO 2 I produttori di birra classificano i lieviti come top-fermenting e bottom-fermenting. I lieviti top-fermenting (così chiamati perché galleggiano sulla superficie della birra) producono maggiori concentrazioni di alcool e preferiscono temperature più alte. Ad esempio S. cerevisiae, produce una birra più fruttata e dolce, denominata ale. I lieviti bottom-fermenting trasformano con la fermentazione una maggior quantità di zuccheri lasciando un sapore più "croccante" e lavorano bene a basse temperature. Fra questi: Saccharomyces uvarum e Saccharomyces carlsbergensis usati per produrre birre tipo lager. I produttori di vino usano differenti varietà di lieviti a seconda del tipo di vino e delle condizioni dell'uva. Troppo zucchero o un'eccessiva concentrazione di alcool rallenta la crescita del lievito, perciò per uve con molto zucchero sono necessari lieviti che ben sopportano elevate concentrazioni zuccherine. Alcuni lieviti sono selezionati in base agli aromi che tendono a sviluppare. Lieviti naturali sono già presenti sulla superficie degli acini d'uva, perciò il succo d'uva tenderà spontaneamente a fermentare a meno che i lieviti non vengano fermati con temperature basse o con solfati. Nonostante la maggior parte dei lieviti rendano la vita dell uomo più piacevole (essendo utilizzati per produrre pane, birra, vino etc.), un certo numero di specie di lieviti, come la Candida albicans, possono causare infezioni nell'uomo (in particolare malattie della pelle). 2.4 Il ciclo vitale del lievito Saccharomyces cerevisiae. Le cellule del lievito S. cerevisiae sono di forma ellissoidale con un diametro di circa 5 micron e si dividono per gemmazione, una caratteristica che ha reso tale lievito molto utile per studi sui meccanismi di divisione cellulare (vedi più avanti). S. cerevisiae può crescere sia in uno stato aploide (cioè con una copia di ciascun cromosoma e quindi, in genere, con una copia di ciascun gene) che in uno stato diploide (cioè con due copie di ciascun cromosoma). La conversione tra lo stato aploide a quello diploide è mediata dall accoppiamento e quella dallo stato diploide ad aploide da un processo chiamato sporificazione (Fig ). Esistono, inoltre, due tipi sessuali di lievito detti a ed alfa (α). Ceppi di lievito, chiamati eterotallici, di tipo sessuale a o alfa possono essere fatti crescere come ceppi stabili per indefinite generazioni. Solo se i due tipi sessuali opposti a e alfa vengono fatti crescere insieme, le cellule di sesso opposto si accoppiano generando una cellula diploide a/alfa che può dividersi indefinitamente in tale stato. Ceppi di lievito, detti omotallici, Fig Il ciclo vitale del lievito Saccharomyces cerevisiae. I due ceppi aploidi (a e alfa) possono coniugare e formare il ceppo diploide a/alfa che, in condizioni limitanti di nutrienti, va incontro a sporificazione rigenerando nel processo meiotico spore aploidi. 9

10 cambiano spontaneamente di sesso e, quindi, è molto difficile tenerli allo stato aploide, in quanto cellule di sesso opposto e capaci di accoppiarsi generando una cellula diploide, si formano spontaneamente senza la necessità di mescolare deliberatamente ceppi di sesso opposto. Ceppi di lievito diploidi possono esseri fatti sporificare se vengono messi in condizioni limitanti di nutrienti necessari per la crescita. In tali condizioni, le cellule che stavano dividendosi mitoticamente iniziano invece il processo della meiosi, alla fine del quale vengono prodotte 4 cellule aploidi, due di sesso a e due di sesso alfa, che sono i gameti chiamati anche, in questo caso, spore. Le 4 spore sono contenute all interno di una struttura visibile al microscopio chiamata asco, che racchiude quindi i gameti prodotti da una singola meiosi (Fig ) (riflettete su quanto succede nell uomo e traete le vostre conclusioni). Fig Un asco che contiene le 4 spore aploidi prodotte durante il processo meiotico. Fig Un microscopio con micromanipolatore utilizzato per la dissezione degli aschi. Il processo di sporificazione ed il fatto che i prodotti di ciascuna meiosi siano contenuti in un unica struttura è di vitale importanza per l analisi genetica della segregazione dei caratteri in cellule di lievito. Infatti, i gameti prodotti in ogni processo meiotico possono essere prelevati con un apparecchio, chiamato micromanipolatore (Fig ), che è un microscopio con attaccato un ago che si può muovere in modo controllato così da andare a rompere gli aschi e prelevare le singole spore (gameti) in esso contenute. Le spore vengono poi posizionate su terreni di coltura solidi (capsule di Petri, vedi più avanti) e ciascun gamete aploide si dividerà generando una colonia di cellule. Tutte le cellule che formano la colonia hanno lo stesso genotipo ed è così possibile, utilizzando opportuni terreni e condizioni di crescita, valutare come un certo carattere ha segregato durante la meiosi (RIPASSARE LE LEGGI DI MENDEL!!! e vedere più avanti). 2.5 Il controllo del sesso in S. cerevisiae Il locus che controlla il sesso del lievito S. cerevisiae viene chiamato MAT. Nel locus MAT, che si trova sul cromosoma III, possono trovarsi due alleli alternativi dello stesso gene, chiamati, rispettivamente, MATa e MATalfa. Il sesso di ceppi di lievito aploidi sarà a o alfa a seconda che al locus MAT ci sia l allele MATa o MATalfa, che vengono trascritti a partire dal promotore presente nel locus stesso (Fig. Fig Il meccanismo della determinazione del sesso in S. cerevisiae. L allele presente al locus MAT determina il sesso di una cellula di lievito. Mediante meccanismi di ricombinazione è possibile che un ceppo di lievito possa cambiare sesso (vedere testo per i dettagli). 10

11 2.5.1). Oltre al gene presente sul locus MAT e che determina il sesso, tutte le cellule di S. cerevisiae posseggono ulteriori copie dell allele a e dell allele alfa, in regioni sul cromosoma III che fiancheggiano a destra e a sinistra il locus MAT. Queste due copie dei geni sono però silenti, cioè non espresse perché i corrispondenti geni non vengono trascritti. È però possibile che il taglio da parte di una endonucleasi (che si chiama HO) a livello del locus MAT induca un evento di trasposizione per cui il gene di sesso opposto a quello presente sul locus MAT viene prima duplicato e poi traslocato sul locus MAT stesso determinando la sostituzione dell allele (di sesso opposto) che era precedentemente presente in quella posizione (Fig ). Ciò determina un cambiamento del sesso di lievito!!! Questo meccanismo è anche denominato meccanismo a cassetta, poiché i geni a o alfa che fiancheggiano il locus MAT ricordano delle musicassette che sono lette solo se inserite nel registratore (il locus MAT), e sostituibili l una all altra. I geni a e alfa che possono essere presenti al locus MAT codificano per dei fattori trascrizionali, cioè per delle proteine che controllano la trascrizione di altri geni. A seconda del fattore trascrizionale prodotto nelle cellule aploidi a o alfa (o la presenza di entrambi i fattori in cellule diploidi), si determina il sesso delle cellule aploidi o il mantenimento dello stato diploide. Ad esempio, cellule di sesso a, producono un piccolo peptide detto feromone-a ed il recettore per il feromone-alfa. Viceversa, cellule di sesso alfa, producono il feromone-alfa ed il recettore per il feromone-a. La produzione dei rispettivi feromoni, e la presenza dei recettori, sono alla base del fenomeno della coniugazione tra ceppi aploidi di lievito di sesso opposto. La coniugazione dei ceppi aploidi di lievito avviene nella fase G1 del ciclo cellulare (vedi più avanti); l aggiunta del feromone di sesso opposto a quello di un certo ceppo di lievito (ad esempio l aggiunta del feromone-alfa a cellule di sesso a) blocca quelle cellule nella fase G1 del ciclo cellulare, permettendo la coniugazione in presenza di cellule del sesso opposto. L aggiunta di feromone-alfa a cellule di lievito di sesso a, è, per esempio, un ottimo sistema per bloccare le cellule nella fase G1 e sviluppare, quindi, metodi di sincronizzazione delle cellule che sono un pre-requisito per studi sui meccanismi molecolari che controllano la progressione del ciclo cellulare. 2.6 Il ciclo cellulare di S. cerevisiae Abbiamo già visto che per dividersi e proliferare, tutte le cellule eucariotiche devono eseguire correttamente un programma genetico, definito ciclo cellulare, che sovrintende la corretta replicazione e segregazione del materiale ereditario nelle cellule figlie. I cromosomi di una cellula eucariotica vengono duplicati in un ristretto intervallo temporale del ciclo cellulare, definito fase S, e segregano nelle cellule figlie in mitosi (fase M). La fase S e la fase M sono separate da due altre fasi, chiamate G1 e G2 G1 M S G2 Fig Il ciclo cellulare del lievito S. cerevisiae. Pannello a. Il ciclo cellulare mitotico di lievito è diviso nelle 4 fasi caratteristiche di tutte le cellule eucariotiche. Pannello b. Le cellule di S. cerevisiae si dividono per gemmazione. Durante il ciclo cellulare di lievito, la dimensione della gemma, la duplicazione ed il posizionamento del centro di organizzazione del fuso ed altri parametri morfologici permettono di determinare, attraverso la semplice osservazione al microscopio, lo stadio del ciclo cellulare in cui si trovano le cellule di lievito. 11

12 (G=Gap=intervallo) (Fig ). La duplicazione dei cromosomi e la loro separazione nelle cellule figlie sono processi periodici estremamente precisi ed ogni alterazione in questi processi provoca conseguenze catastrofiche in quanto, alterando il numero o l integrità dei cromosomi, si modifica l informazione genetica della cellula. Molte malattie nell uomo, soprattutto i tumori, sono causate da alterazioni nei meccanismi di controllo del ciclo e della proliferazione cellulare. Per questo, gli studi tesi a comprendere i meccanismi molecolari che controllano il ciclo cellulare sono stati (e sono) una frontiera della ricerca biologica. I lieviti S. cerevisae e S. pombe sono stati particolarmente utili per comprendere tali meccanismi, tanto che due studiosi (Leland Hartwell e Paul Nurse) che hanno lavorato sul ciclo cellulare dei lieviti hanno ottenuto il Premio Nobel per la Fisiologia e la Medicina nel Perché lo studio del ciclo cellulare del lievito S. cerevisiae è stato così importante? Il primo motivo è legato proprio alla modalità con cui tale lievito si divide. Infatti, S. cerevisiae si divide per gemmazione ed è possibile distinguere facilmente in che fase del ciclo cellulare una cellula si trovi, semplicemente osservando la morfologia della cellula stessa. Come potete osservare nella Fig b, in fase G1 le cellule di lievito hanno la caratteristica forma ellissoidale; quando entrano nella fase S incominciano ad emettere la gemma che diventa sempre più grossa. Quando le cellule entrano nella fase G2 il nucleo singolo presente nella cellula madre, si posiziona tra madre e figlia, si allunga poi tra le due cellule e viene segregato e separato in mitosi. Se si considerano altri particolari, per esempio il centro dell organizzazione del fuso (equivalente al cinetocoro nelle cellule di mammifero) e la lunghezza delle fibre del fuso mitotico (visibili in Fig b), si riescono a posizionare le cellule durante il ciclo cellulare con ancora maggior precisione. Alla fine della divisione si generano due cellule figlie di dimensioni un po diverse: la madre che è più grossa e la figlia (che deriva dalla gemma) più piccola. Ogni madre può generare più figlie e, ad ogni parto, rimane una cicatrice sulla superficie della cellula madre in corrispondenza di dove si è staccata la gemma. Tale cicatrice si può colorare ed è visibile al microscopio, così che contando le cicatrici si può determinare quante figlie ha fatto una madre ed, in parte, calcolarne l età!!! (Fig ). Un altro aspetto per cui S. cerevisiae è stato particolarmente utile per studi sul ciclo cellulare è legato al fatto che le cellule di lievito sono facilmente sincronizzabili. Se si vogliono studiare i meccanismi che controllano la progressione del ciclo cellulare è importante avere a disposizione una coltura di cellule che attraversano il ciclo in modo sincronizzato. Non è per niente facile sincronizzare le cellule. In lievito, come abbiamo già accennato, questo è relativamente semplice. Una coltura asincrona di cellule di sesso a, in cui le cellule sono presenti in tutte le possibili fasi del ciclo, può essere bloccata in un momento specifico della fase G1 aggiungendo il feromone del sesso opposto (feromone-alfa). Se si tengono le cellule in presenza di tale sostanza per un paio di divisioni cellulari (circa 3 ore), tutte le cellule si troveranno in G1, come allineate ai blocchi di partenza. Se adesso si raccolgono le cellule e si lava Fig Fotografie al microscopio a fluorescenza di cellule di lievito S. cerevisiae. Quando la cellula figlia si stacca dalla cellula madre, su quest ultima viene lasciato un anello di una sostanza chiamata chitina. L anello di chitina può essere visualizzato con un colorante fluorescente chiamato calcofluor. L anello di chitina indica, quindi, dove si trovava la gemma e contando gli anelli di chitina su ogni cellula madre si possono contare il numero di cellule figlie generate per gemmazione. via il feromone, tutte le cellule partono dallo stesso punto e nello stesso momento, come allo sparo della partenza di una corsa. Si muovono in modo sincrono per un paio di generazioni, poi la sincronia viene via via perduta, ma questo procedimento ha permesso di raccogliere man mano cellule che si trovano a diversi stadi del ciclo cellulare. L ultimo aspetto rilevante, riguarda l utilizzo di mutanti di lievito alterati nella funzionalità di specifici geni che controllano la progressione del ciclo cellulare, ma questi verranno descritti più avanti. 12

13 2.7 Nomenclatura di geni di lievito Nel lievito S. cerevisiae i geni vengono indicati con tre lettere dell alfabeto seguite da un numero e sono scritti in carattere italico. Per es., il gene TRP1 codifica per un enzima richiesto per il primo passaggio nella via biosintetica che porta alla sintesi dell amminoacido triptofano e così il gene LEU2 codifica per il secondo enzima nella via che porta alla sintesi dell amminoacido leucina, etc. etc. Geni che portano mutazioni recessive nei geni in oggetto sono indicati con le lettere minuscole (trp1, leu2 etc.). I fenotipi selvatici o mutanti sono invece spesso indicati, rispettivamente, come Trp + / Trp oppure Leu + / Leu. Con + si indica la capacità di sintetizzare triptofano e/o leucina e, quindi capacità, di crescere in assenza di tali amminoacidi nel terreno di coltura: organismi prototrofi; con meno, si indica l incapacità di sintetizzare gli amminoacidi in oggetto e, quindi, gli organismi che portano tali mutazioni sono detti mutanti auxotrofici, e possono crescere solo se il triptofano e/o la leucina vengono aggiunti da noi al terreno di coltura. 2.8 Isolamento ed utilizzo di mutanti di lievito temperatura-sensibili Altri mutanti estremamente importanti nell analisi genetica formale sono i mutanti letali condizionali. Vengono così chiamati mutanti capaci di crescere in una certa condizione (detta permissiva) ma incapaci di crescere in una condizione alternativa (detta non-permissiva o restrittiva). Tra i mutanti letali condizionali più utilizzati ci sono i mutanti temperatura-sensibili che sono capaci di crescere ad una certa temperatura (in lievito normalmente 30 C), ma non ad una temperatura più alta (37 C). Perché ciò avviene? Qui dobbiamo ricordarci che cosa è una mutazione. La mutazione è un cambiamento ereditabile nella sequenza nucleotidica di un gene, per cui il gene mutato può non essere in grado di svolgere la funzione tipica del gene selvatico e quindi mostra un fenotipo alterato. Ricordando gli esperimenti di Mendel, l allele che determinava il colore giallo del seme del pisello era indicato come Y (maiuscolo), mentre quello che determinava il colore verde era indicato come y (minuscolo). Poiché il pisello è un organismo diploide e quindi contiene due copie di quel gene possiamo avere tre possibili situazioni: YY, Yy, yy. Il colore del seme è giallo sia nella situazione YY (omozigote) che in quella Yy (eterozigote) e questo perché l allele Y (giallo) è dominante, mentre l allele y (verde) è recessivo per cui le piante verdi possono essere solo di genotipo yy. I grandi vantaggi dell utilizzo del lievito nell analisi genetica classica sono essenzialmente due: 1) si può passare dallo stato aploide a quello diploide (e viceversa) con grande facilità; 2) i prodotti di ogni meiosi (gameti) sono racchiusi in una struttura (asco), per cui è possibile analizzare il genotipo di ciascun gamete e, quindi, è più facile seguire la segregazione di un dato carattere. Facciamo un esempio pratico. Per prima cosa vogliamo selezionare una mutazione (ad esempio una mutazione temperatura-sensibile o ts) e controllare se quella mutazione è dominante o recessiva valutando come il fenotipo associato a quella mutazione segreghi durante la meiosi. Per individuare dei mutanti temperatura-sensibili si procede con la tecnica del replica-plating (Fig ). Si parte da un ceppo di lievito selvatico aploide e lo si sottopone al trattamento con un agente che causi mutazioni (mutageno) al fine di aumentare la probabilità di trovare i mutanti che cerchiamo. I mutageni più utilizzati per tali trattamenti sono, solitamente, sostanze chimiche che causano alterazioni nelle basi azotate del DNA. Dopo il trattamento di mutagenesi, un numero adeguato di cellule (di solito diverse migliaia) vengono piastrate su capsule Petri contenenti terreno di coltura solido (piastre madri in Fig ), così che ogni cellula dopo un paio di giorni dia origine ad una colonia. Si appoggia poi su ciascuna piastra madre un tampone ricoperto da un panno di velluto sterile (Fig ) su cui rimangono attaccate cellule corrispondenti alle diverse colonie ed il velluto viene appoggiato su due nuove piastre (dopo esserci ricordati di orientare le piastre in modo appropriato), che sono poi incubate alla temperatura permissiva (30 C) o non permissiva (37 C). Dopo un paio di giorni, quando sono cresciute nuove colonie, si confrontano le colonie cresciute sulla piastre tenute alle due differenti temperature. Un mutante temperatura-sensibile sarà in grado di formare una colonia a 30 C, ma non a 37 C. Operando in questo modo su un numero elevato di cellule avremo ottenuto una collezione di mutanti temperatura-sensibili. Dato che eravamo partiti da un ceppo selvatico aploide la mutazione temperatura-sensibile è in grado di generare il fenotipo incapacità di crescere a 37 C anche se la mutazione è recessiva (come lo sono la maggior parte delle mutazioni temperatura-sensibili). 13

14 Fig La tecnica del replica-plating per individuare mutazioni temperatura-sensibili in lievito (vedi testo per i dettagli). La stessa tecnica è utilizzata per individuare analoghe mutazioni anche nei batteri. Come facciamo a verificare che la mutazione è davvero recessiva? Dato che stiamo lavorando con il lievito ciò è molto semplice: basterà incrociare il ceppo mutante con un ceppo selvatico di sesso opposto e si genererà così un ceppo diploide. Se la mutazione è recessiva, il ceppo diploide sarà in grado di crescere a 37 C. Se invece la mutazione fosse dominante ciò non avverrebbe. Possiamo domandarci anche come segrega il carattere temperatura sensibile durante la meiosi. Trattandosi di un carattere monofattoriale, controllato da un singolo gene, ci aspettiamo che l eterozigote (cioè il ceppo diploide formato dalla coniugazione tra un aploide selvatico ed un aploide ts) dia origine a gameti selvatici e mutanti in rapporto 1:1. Come facciamo a verificare questa ipotesi? Come mostrato in Fig , facciamo sporificare un certo numero di cellule diploidi eterozigoti. Con un microscopio Fig Un replicatore con il panno di velluto utilizzato nell esperimento del replica-plating. munito di micromanipolatore procediamo alla dissezione di un certo numero di aschi e disponiamo le 4 spore di ciascun asco in linee verticali su una capsula Petri contenente terreno solido che incubiamo alla temperatura permissiva (30 C). Come si può vedere nel pannello 1 della Fig tutte le spore sono in grado di formare colonia eccetto nei due casi in cui durante la procedura abbiamo perso la spora in esame. Facciamo poi un replica-plating della piastra mostrata nel pannello 1 su una nuova piastra (Fig , pannello 2) che viene incubata a 37 C. Si può notare che solo 2 delle 4 spore di ciascun asco sono in grado di crescere a 37 C (le due spore selvatiche), dimostrando che il carattere temperatura-sensibile segrega in rapporto 1:1 in meiosi (2 spore selvatiche e 2 spore temperatura-sensibili). 14

15 1 2 Le 4 spore che derivano da 10 aschi (linee verticali) sono state messe su capsule Petri. Ciascuna spora (dopo alcuni giorni) genera una colonia. In 2 casi (III e ultima fila, una spora è andata perduta durante la procedura. È stato fatto un replica-plating delle colonie cresciute nella piastra mostrata nel pannello A. La nuova piastra è stata incubata per alcuni giorni a 37 C. Potete notare che in tutti gli aschi con 4 spore solo 2 sono in grado di crescere a 37 C, dimostrando che il carattere in esame segrega in rapporto 1:1 in meiosi. Fig La segregazione delle spore di un diploide contenente allo stato eterozigote una mutazione temperatura-sensibile e l analisi del fenotipo delle spore ci permette di verificare che il fenotipo temperatura-sensibile segrega in rapporto 1:1 durante la meiosi. 2.9 La scoperta dei mutanti cdc per lo studio del ciclo cellulare Tra la fine degli anni 60 e l inizio degli anni 70, Leland Hartwell e Paul Nurse iniziarono un lavoro pionieristico teso all individuazione dei geni che controllano la progressione del ciclo cellulare nei lieviti S. cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe. Poichè l incapacità di progredire attraverso il ciclo cellulare è letale, Hartwell e Nurse cercarono mutazioni che bloccassero la progressione del ciclo cellulare solo in particolari condizioni, quindi, mutazioni temperatura-sensibili, come abbiamo descritto sopra, così da poterne studiare le conseguenze trasferendo i mutanti da condizioni permissive a condizioni nonpermissive (in genere 37 C). I geni che controllano il ciclo cellulare vennero chiamati geni CDC (le iniziali di Cell Division Cycle). Come mostrato in Fig , l individuazione di mutanti cdc in S. cerevisiae era facilitata dal fatto che questo lievito possiede una serie di parametri morfologici che possono essere facilmente seguiti durante il ciclo cellulare. Mutazioni temperatura-sensibili nei geni CDC che controllano uno specifico passaggio del ciclo cellulare sono identificabili perchè le cellule mutanti si arrestano tutte con la stessa morfologia (fenotipo terminale), dopo il trasferimento alle condizioni non-permissive, in quanto non sono capaci di eseguire una funzione richiesta per il passaggio da uno stadio all altro del ciclo cellulare. Combinando poi nello stesso ceppo due mutazioni cdc ed osservando il fenotipo terminale si riesce a stabilire l ordine temporale d azione dei diversi geni CDC (Fig ). Il lavoro iniziale di Hartwell (Fig ) ha portato all identificazione di circa 70 geni CDC in S. cerevisiae, ma questo numero è risultato sottostimato in quanto numerosi geni di lievito sono ridondanti e svolgono funzioni simili e vicariabili tra di loro. Fig Mutanti cdc bloccati in diverse fasi del ciclo cellulare. Il gene CDC28 codifica per una funzione richiesta per il passaggio dalla fase G1 alla fase S. Infatti, tutte le cellule cdc28 mutanti si bloccano con la morfologia tipica di cellule in G1 (senza gemma) dopo trasferimento alla temperatura non-permissiva. Il gene CDC7 codifica per una funzione richiesta per la fase S. Infatti, tutte le cellule mutanti cdc7 hanno la stessa morfologia (una gemma più piccola della cellula madre, tipica di cellule in fase S). Cellule che portano entrambe le mutazioni si bloccano con la morfologia tipica dei mutanti cdc28 e non di mutanti cdc7, indicando che il gene CDC28 agisce temporalmente prima del gene CDC7. 15

16 A Fig Fotografie tratte da uno dei lavori originali che hanno fruttato ad Hartwell l assegnazione del premio Nobel. Nel pannello A, si vedono cellule selvatiche che, anche dopo trasferimento alla temperatura non-permissiva, hanno cellule senza gemma o con gemma di diverse dimensioni ad indicare che si trovano in diversi stadi del ciclo cellulare. Nel pannello B è mostrato un mutante cdc dopo trasferimento alla temperatura non-permissiva. Si può notare che, in questo esempio, tutte le cellule hanno una gemma più o meno della stessa dimensione. Le cellule di lievito in sospensione sono appiccicose per cui si vedono spesso coppie di cellule. B La caratterizzazione dei mutanti cdc di lievito ha permesso di stabilire un punto estremamente importante nel controllo del ciclo cellulare: l esecuzione di eventi tardivi del ciclo dipende dalla corretta esecuzione degli eventi precedenti. Per esempio, una mutazione che blocca la sintesi del DNA determina l arresto del ciclo cellulare nella fase S e previene l entrata delle cellule in mitosi e la successiva divisione cellulare. Ne deriva che la mitosi e la divisione cellulare richiedono il precedente completamento della fase S: le fasi del ciclo sono quindi organizzate in una serie lineare di eventi tra loro interdipendenti. La visione del ciclo cellulare come una cascata di eventi tra loro interconnessi è risultata applicabile non solo al lievito, ma anche agli altri eucarioti. 3. Cenni di biologia molecolare del lievito 3.1 Il genoma del lievito S. cerevisiae Al lievito sono applicabili sofisticate tecniche di tipo genetico, e la conoscenza molecolare dell organizzazione del suo genoma è avanzatissima; il lievito presenta, inoltre, ulteriori caratteristiche che lo rendono un modello eccezionale per lo studio della funzione molecolare dei geni. Il lievito S. cerevisiae è il primo organismo di cui è stata determinata la sequenza nucleotidica dell intero genoma. La dimensione del genoma di lievito è di 12 megabasi (1.2 x 10 7 paia di basi), circa 3 volte più grande del genoma del batterio Escherichia coli, ma circa 260 volte più piccolo del genoma dell uomo. Proprio per questo motivo, i cromosomi del lievito sono di dimensioni ridotte e poco adatti ad una analisi citogenetica al microscopio; sono, però, analizzabili con tecniche molecolari più analitiche. Infatti, gli interi cromosomi di lievito possono essere separati ed analizzati mediante particolari tipi di elettroforesi. Il numero totale dei geni di lievito è circa 6.000, nell uomo sembrano essere di un numero compreso tra e , mentre nel vermicello Caenorhabditis elegans circa La semplice comparazione di questi numeri fa sorgere una serie di problematiche: se ci limitiamo, infatti, a paragonare il numero dei geni in diversi organismi, l uomo sembra essere poco più complicato di un piccolo nematode lungo 1 mm (C. elegans) e circa 4 o 5 volte più complesso di una cellula di lievito. Il numero dei geni non è, quindi, un parametro sufficiente a spiegare la diversa complessità evolutiva degli organismi. Il lievito può contenere dei plasmidi, come quello denominato 2 micron (dalle sue dimensioni), che sono stati il punto di partenza per la costruzione di vettori di clonaggio che possono essere mantenuti all interno di cellule di lievito. È importante sottolineare un altro punto: il sequenziamento del genoma di lievito e lo sviluppo di tecnologie genetiche in tale organismo ha permesso l identificazione di tutti gli elementi strutturali importanti per la dinamica di un cromosoma, quali le origini di replicazione del DNA, i centromeri ed i telomeri. È così oggi possibile costruire e mantenere in cellule di lievito dei veri e propri cromosomi artificiali, chiamati YAC, le iniziali di Yeast Artificial Chromosome. Tali cromosomi artificiali sono uno strumento molto importante per il clonaggio e l analisi del genoma di organismi complessi, incluso l uomo. Per studi di biologia molecolare sulla funzionalità dei geni di un certo organismo è essenziale che tale organismo sia trasformabile. Abbiamo discusso in dettaglio il problema della trasformazione nell opuscolo Bianco o Blu. In breve, con il termine trasformazione si intende la possibilità di introdurre DNA esogeno all interno dell organismo in esame. La maggior parte delle cellule, con l esclusione di alcuni batteri, non sono normalmente trasformabili, ma possono diventarlo se si trattano le cellule stesse con reagenti che alterano la permeabilità della membrana e/o della parete cellulare, senza uccidere le cellule. Alternativamente, il DNA può essere introdotto all interno di una cellula mediante trattamenti fisici (ad es. uno shock elettrico), iniettando direttamente il DNA all interno della cellula o, addirittura, sparando con delle vere e proprie pistole molecolari delle microsfere di metallo sulla cui superficie sono adsorbite molecole di DNA. 16

17 Il lievito non è normalmente trasformabile, ma esistono semplici protocolli sperimentali che, alterandone la permeabilità, permettono l introduzione di molecole di DNA al suo interno con alta efficienza. Isolamento di un gene Fig Per clonare un gene dobbiamo inserire il frammento di DNA che lo contiene in un vettore di clonaggio (es. un plasmide) ed introdurre il plasmide ricombinante così generato in un ospite (ad es. E. coli o lievito) capace di replicarlo. Plasmidi in cui sono state inserite molecole di DNA esogeno (Fig e vedere l opusculo Bianco o blu per ulteriori dettagli) possono essere mantenuti come molecole in grado di replicarsi autonomamente all interno di cellule di lievito se contengono nel plasmide stesso un origine di replicazione del DNA di lievito (Fig ). Se poi il plasmide contiene anche un centromero ed i telomeri, si potrà comportare come un cromosoma artificiale non solo replicandosi in fase S, ma segregando correttamente nelle cellule figlie sia in mitosi che in meiosi. Fig Schema di un plasmide in grado di replicarsi sia in lievito che in E. coli. Il plasmide può replicarsi in cellule di E. coli perché contiene un origine di replicazione (ori) riconosciuta da quell organismo ed in cellule di lievito perché contiene l origine di replicazione del plasmide di lievito denominato 2 micron (2 micron ori). Il plasmide contiene anche un marcatore per la selezione in E. coli (Amp r, che conferisce resistenza all ampicillina) ed un marcatore per la selezione in lievito (URA3 che conferisce la capacità a cellule Ura - di crescere in assenza di uracile nel terreno). 3.2 Clonaggio di un gene di lievito È possibile costruire dei plasmidi in cui siano stati clonati pezzi di DNA, che nel loro insieme, rappresentano tutto il genoma di lievito. Tale concetto prende il nome di libreria o banca o genoteca di DNA. Che cos è, quindi una libreria di DNA di un certo organismo? Una libreria di DNA è una popolazione di vettori identici, ma ognuno contenente un inserto diverso del DNA di quell organismo così che l intera popolazione di plasmidi ricombinanti sia rappresentativa dell intero genoma (Fig ). 17

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