Prof. Nelson MARMIROLI Dipartimento di Scienze Ambientali Università degli Studi di Parma

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1 Metodi avanzati di tracciabilità a supporto delle normative Europee sulla etichettatura dei prodotti contenenti o derivati da OGM. Dai centri di ricerca ai laboratori di analisi Prof. Nelson MARMIROLI Dipartimento di Scienze Ambientali Università degli Studi di Parma LA COESISTENZA TRA ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI E NON: UNA SFIDA POSSIBILE?

2 OGM e legislazione specifica L immissione sul mercato di prodotti OGM o consistenti di materiale derivato da piante transgeniche, ad esempio per coltivazione, importazione o processamento in prodotti industriali, è gestita dalla Direttiva 2001/18/EC L immissione sul mercato di OGM per alimenti e mangimi o prodotti alimentari che contengono, consistono di o sono prodotti da OGM è gestita dal Regolamento (EC)1829/2003 Se un prodotto alimentare contiene o consiste di OGM ci sono due possibilità: È soggetto solamente al Regolamento (EC) 1829/2003 per l autorizzazione al rilascio ambientale di OGM per l uso dell OGM nei prodotti alimentari È soggetto sia alla Direttiva 2001/18/EC che al Regolamento (EC) 1829/2003 I prodotti alimentari devono anche rispondere alle esigenze di tracciabilità e etichettatura, delineati nel Regolamento (EC) 1829/2003 e (EC) 1830/2003

3 Etichettatura I prodotti che consistono di OGM (o contengono OGM) devono essere etichettati I regolamenti 1829 e 1839/03 stabiliscono la soglia minima di tolleranza alla presenza di OGM pari a 0,9% per alimenti e mangimi che contengono OGM già autorizzati, se la presenza è accidentale o tecnicamente inevitabile La soglia è dello 0,5% per la presenza di OGM non autorizzati, in via transitoria In Italia la vigilanza sull osservanza delle norme si riferisce alla direttiva 2001/18 ed spetta all autorità nazionale competente (Ministero ambiente), a regioni e province autonome, a enti locali (attuazione D.lgs.224 dell )

4 Etichettatura negli USA In Europa la necessità di etichettatura subentra se nella preparazione dell alimento sono stati impiegati OGM, tenendo conto della soglia per la contaminazione ritenuta accidentale Negli USA l etichettatura è praticamente volontaria e si basa sulla sostanziale differenza dell alimento dalla sua controparte tradizionale, se causa preoccupazioni per i rischi alla salute

5 Scopo dell etichettatura Facilitare l adozione di scelte consapevoli e impedire che i consumatori siano tratti in inganno Informare sulle caratteristiche che rendono alimenti o mangimi diversi dalla versione tradizionale Promuovere la correttezza delle transazioni tra venditore e acquirente

6 Alcune definizioni Evento: è uno specifico evento di ricombinazione da cui è stata generata la pianta transgenica. E identificato da un abbreviazione (es. Bt11, MON 863) Costrutto genico:unità funzionale necessaria per il trasferimento e l espressione del gene di interesse Transgene: un gene preso da un organismo e trasferito in un diverso organismo mediante ingegneria genetica

7 Situazione in un evento specifico giunzione promotore giunzione enhancer terminatore transgene costrutto

8 Supporto all etichettatura Si basa sulla valutazione, qualitativa e quantitativa, della presenza di materiale di origine transgenica negli ingredienti e nelle componenti dell alimento Nel 2004 si è deciso che la concentrazione sia espressa come rapporto tra un bersaglio eventospecifico e un bersaglio di riferimento speciespecifico in termini di genoma aploide (Raccomandazione 2004/787/EC) Questo rapporto deve essere stabilito per ogni specie ed ogni gene Diversi progetti di ricerca si stanno occupando di chiarire e migliorare queste precisazioni (es. COETRA)

9 Specificità del metodo Attualmente il dibattito sull etichettatura in ambiente normativo e scientifico si riferisce alla specificità dei metodi analitici Per essere altamente specifico, il metodo deve avere come bersaglio una caratteristica unica dell evento in questione Se il bersaglio è basato sul COSTRUTTO o sul TRANSGENE rischia di dare risultati positivi anche per altri eventi transgenici: ad esempio, il caso del mais Bt10, non autorizzato, contenente lo stesso costrutto del mais autorizzato Bt11 La legislazione EC richiede perciò che il metodo abbia un bersaglio specifico per l EVENTO: in caso di inserzioni, si tratta delle GIUNZIONI tra costrutto e genoma del ricevente

10 Metodologie analitiche Secondo il Regolamento EC 882/2004 i metodi analitici per il controllo di alimenti e mangimi devono essere validati da laboratori specializzati (Community Reference Laboratory) Secondo i Regolamenti 1829/2003 e 641/2004, la validazione di metodi analitici per l analisi di OGM è richiesta per l autorizzazione di un alimento o mangime OGM nella UE: la ditta che chiede l autorizzazione deve sottoporre a validazione il metodo analitico corrispondente

11 Analisi di proteine Metodi particolarmente diffusi negli USA si basano su saggi immunocromatografici (lateral flow assay) per l analisi qualitativa. Il test può rispondere anche a 0,1% di OGM (1 seme su 1000)

12 Metodi per analisi di DNA Si basano sulla complementarietà delle eliche di DNA, in saggi di ibridazione o di amplificazione con PCR. Un prerequisito è una quantità minima del gene bersaglio e una conoscenza accurata della modificazione genetica. In tutti i casi il passaggio critico è l estrazione e purificazione del DNA dal campione. Southern blot PCR qualitativa PCR quantitativa all end-point (QC-PCR) PCR Real-time quantitativa

13 Laboratorio di riferimento Il sito Internet del CRL elenca lo stato di validazione dei dossier sui protocolli che sono stati sottoposti. Attualmente risultano validati metodi per circa 25 eventi specifici. Si riferiscono a mais, riso, barbabietola da zucchero, cotone.

14 Indici di prestazione Applicabilità a diversi materiali e concentrazioni Praticità, che comprende facilità di esecuzione ed efficacia, i costi e i tempi richiesti Specificità, essere evento-specifico Range dinamico di concentrazioni in cui vale la linearità, da 0,09 a 4,5% (soglia a 0,9%) Accuratezza, entro il 25% dal valore di riferimento Efficienza di amplificazione Coefficiente di correlazione, superiore a 0,98 Ripetibilità, su almeno 15 prove Limite di quantificazione, inferiore a 0,09% (soglia a 0,9%) Limite di rilevazione, inferiore a 0,045% (soglia a 0,9%) Robustezza, non essere influenzato da deviazioni nella procedura sperimentale

15 Estrazione del DNA La crescente severià del trattamento diminuisce la probabilità di recuperare DNA ad alto peso molecolare SEMI FARINA POLENTA CRACKER TACO TRATTAMENTO Meccanico Termico Chimico AMPLIFICAZIONE 133 bp 277 bp 485 bp 1105 bp 1578 bp 1956 bp / / / / / / / /

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17 RealTime uniplex Mon1930 MON 810 plasmid std curve b Mean Ct Value a Per una quantificazione diretta dell evento OGM le metodologie di PCR Real-Time sono le uniche in grado di dare un risultato affidabile y = x R2 = a: Real-time PCR di diverse diluizioni del bersaglio; b: regressione lineare delle diluizioni. 2 3 log quantity 4 5 6

18 PCR Real Time duplex Dopo l ottimizzazione di primer e sonde si può eseguire la PCR RealTime con due bersagli contemporaneamente. Poichè il bersaglio corrispondente al gene endogeno di riferimento ha una concentrazione molto più elevata del bersaglio specifico, la sua amplificazione si ottiene precocemente.

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20 PCR multiplex Si possono amplificare simultaneamente fino a 7 bersagli in una unica reazione. Due sono geni di controllo, zeina per mais e lectina per soia

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22 Microarrays Due sonde diverse per ogni amplicone vengono utilizzate, una di circa 40 nt e una di 60. L efficienza di ibridazione cambia nei due casi. Tutte le sonde riconoscono il bersaglio corrispondente e il riconoscimento è specifico. Zeina e lectina sono i geni endogeni di riferimento per mais e soia rispettivamente

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25 Un esempio di metodo validato PCR quantitativa in RealTime per la determinazione del contenuto relativo dell evento GA21 di mais. Il bersaglio specifico è un frammento di 112 bp della regione di giunzione tra costrutto e genoma vegetale Come gene endogeno di riferimento si usa adh1, amplificando un frammento di 70 bp Le reazioni vengono eseguite separatamente su 200 ng di DNA Il limite di quantificazione è pari a 0,1% Il limite di rilevabilità è pari a 0,1% Il range di concentrazioni per cui è stato validato va da 0,1 a 4,26% di contenuto GM

26 Il ruolo della ricerca La Commissione Europea e diversi enti nazionali e internazionali hanno finanziato diversi progetti di ricerca per lo studio di nuove strategie e approcci alla rilevazione degli OGM I risultati di tali progetti sono stati alla base di innovazioni in strumentazioni, progettazione di sonde, scelta di bersagli e hanno portato anche a importanti modificazioni legislative e normative

27 Progetti di ricerca conclusi PRIN2000: Tracciabilita' di frammenti di DNA e proteine lungo la filiera alimentare e mangimistica con metodi applicabili alla etichettatura volontaria (EC 1139/98) CNR Agenzia 2000: Applicazione della genomica e della proteomica alla qualita' alimentare: tracciabilita' di LMO (OGM) nei nuovi alimenti e nelle filiere agro-alimentari CE Framework V, Quality of Life and Management of Living Resources: Traceability of DNA fragments throughout the food chain by DNA/PNA technologies. Application to novel foods (DNA-TRACK) MURST Fondo speciale per lo sviluppo della ricerca di interesse strategico (FIST): Applicazioni della genomica e della proteomica alla determinazione della qualità, salubrità e sicurezza della produzione alimentare

28 Progetti attualmente in corso CE Framework VI, Food Quality and Safety: dal 2005 GM and non-gm supply chains: their CO-Existence and TRAceability (COETRA) CE Framework VI, Food Quality and Safety: dal 2006 Promoting European Traceability Excellence & Research (PETER) CE Framework VI, Food Quality and Safety: dal 2007 Integrated System for a Reliable Traceability of Food Supply Chains (TRACEBACK)

29 E in particolare Studio triennale di fattibilità sulla coesistenza di tre diverse filiere agroalimentari basate su un agricoltura con coltivazioni convenzionali, organiche e GM UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PARMA Consorzio Interuniversitario Nazionale Scienze Ambientali COOP-ITALIA-BOLOGNA

30 PRRIITT: dal 2005 Laboratorio Regionale per la Sicurezza e la Qualità degli Alimenti (SIQUAL) Un progetto finanziato dalla Regione EmiliaRomagna per un laboratorio che rappresenti un punto di riferimento per quanto riguarda la sicurezza e la qualità degli alimenti per imprese ed enti di controllo

31 Conclusioni Grazie agli sforzi della CE, l Europa è attualmente leader nella salvaguardia dei consumatori, con una legislazione basata sul principio di precauzione Negli anni recenti le tecniche per la rilevazione di OGM hanno subito un enorme progresso, grazie alle attività di ricerca e alla validazione di metodologie di analisi sempre più specifiche e affidabili

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