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1 PRINCIPALI TIPI DI PCR a) RT-PCR: serve a valutare l espressione di un gene tramite l amplificazione dell mrna da esso trascritto PCR COMPETITIVA: serve a valutare la concentrazione iniziale di DNA o RNA attraverso l amplificazione in contemporanea con un DNA standard, aggiunto in quantità nota alla miscela di reazione. Il campione standard si amplifica con la stessa coppia di inneschi del DNA di interesse. PRINCIPALI TIPI DI PCR b) NESTED PCR: serve ad ottenere una maggiore specificità del prodotto di amplificazione utilizzando in successione due coppie di inneschi: la prima più esterna mentre la seconda più interna rispetto al segmento di DNA di interesse MULTIPLEX PCR: consente di amplificare contemporaneamente diversi segmenti dello stesso gene di interesse utilizzando coppie di inneschi differenti (es. Distrofia duchenne) PCR REAL TIME: consente sia di monitorare in tempo reale l andamento della reazione di PCR utilizzando sostanze fluorescenti e sia di misurare le quantità assolute di molecole di partenza

2 PRINCIPALI TIPI DI PCR a) RT-PCR: serve a valutare l espressione di un gene tramite l amplificazione dell mrna da esso trascritto PCR ASIMMETRICA: serve ad ottenere DNA a singolo filamento utilizzando uno dei due inneschi in quantità molto ridotta rispetto all altro ADIPOCITA, normale OSTEOCITA, normale Profili di espressione genica Nella cellula di un tessuto sono presenti tutti i geni del genoma, ma solo quelli caratteristici di un tessuto sono attivi. Il profilo di espressione genica o pattern di espressione è l insieme dei geni attivati in un tessuto. In figura è riportato un esempio di due cellule normali appartenenti a tessuti diversi: sebbene contengano mrna e proteine comuni (geni costitutivi), ciascuna di esse ha mrna e proteine peculiari (rappresentate con colori diversi).

3 OSTEOCITA normale OSTEOCITA tumorale Profili di espressione genica nei tumori E possibile misurare le differenze tra un tessuto normale ed uno tumorale dello stesso tipo, analizzandone l espressione genica. Mentre cellule normali di uno stesso tessuto presentano un identico profilo di espressione, quando insorge un tumore tale profilo varia. Le alterazioni dell espressione genica possono causare variazioni nella produzione delle proteine o nella loro reciproca interazione. Proteine fondamentali potrebbero non essere più disponibili, altre essere prodotte in eccesso. Le cellule tumorali derivano quindi da una combinazione di più variazioni a livello genico e proteico. MISURA DEL LIVELLO DI ESPRESSIONE (TRASCRIZIONE) DI UN GENE: RT-PCR Per misurare il livello di mrna trascritto da un determinato gene e quindi avere indicazioni sul suo livello di espressione (es. tessuto, organo, batteri, cellule in coltura, etc.) è necessario: 1) Estrarre l RNA totale dal campione biologico che si vuole esaminare 2) Trasformare il pool di RNA (che conterrà anche l mrna trascritto dal gene di interesse) in cdna tramite la reazione di trascrizione inversa 3) Evidenziare il cdna di interesse tramite la reazione di PCR utilizzando una coppia di primers specifici.

4 TRASCRIZIONE INVERSA (oligo dt) 1. La reazione di TRASCRIZIONE INVERSA consente di produrre una molecola di cdna (DNA complementare) a partire da mrna (RNA messaggero). 2. L enzima che catalizza questa reazione è la trascrittasi inversa, una DNA polimerasi RNAdipendente. 3. Questo enzima è stato inizialmente identificato nei retrovirus (ad esempio il virus HIV). 4. Le due trascrittasi inverse più utilizzate in laboratorio sono la AMV (isolata dall Avian Myeloblastosis Virus) e la MoMLV (isolata dal Moloney Murine Leukemia Virus). 5. Il pool di cdna ottenuto dalla reazione di trascrizione inversa è utilizzato per misurare il livello di espressione di un gene mediante la tecnica PCR RT-PCR=REVERSE TRANSCRIPTASE PCR Esameri RANDOM La RT-PCR amplifica un RNA convertendolo prima in cdna (o DNA complementare all RNA) tramite l enzima trascrittasi inversa, e poi amplificandolo tramite PCR con inneschi specifici per la sequenza di interesse. La RT-PCR viene utilizzata, ad esempio, per valutare il livello di espressione di un gene misurando la quantità di mrna da esso trascritto. La trascrittasi inversa viene utilizzata dai retrovirus (o virus ad RNA, es HIV).

5 ANALISI SU GEL DI AGAROSIO DI PRODOTTI DI RT-PCR PRINCIPALI TIPI DI PCR a) RT-PCR: serve a valutare l espressione di un gene tramite l amplificazione dell mrna da esso trascritto PCR COMPETITIVA: serve a valutare la concentrazione iniziale di DNA o RNA attraverso l amplificazione in contemporanea con un DNA standard, aggiunto in quantità nota alla miscela di reazione. Il campione standard si amplifica con la stessa coppia di inneschi del DNA di interesse.

6 PCR COMPETITIVA La sequenza in esame (es. genoma virale) viene amplificata insieme ad una sequenza nucleotidica che funge da controllo interno (standard) e che possiede un elevata omologia con la sequenza del DNA virale. Nella reazione di coamplificazione si avrà competizione tra la sequenza bersaglio ed il controllo interno: utilizzando concentrazioni scalari note del controllo interno sarà possibile risalire alla quantità di acido nucleico (virus) presente nel campione. PCR COMPETITIVA Controllo interno bersaglio INCOGNITO

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8 PRINCIPALI TIPI DI PCR b) NESTED PCR: serve ad ottenere una maggiore specificità del prodotto di amplificazione utilizzando in successione due coppie di inneschi: la prima più esterna mentre la seconda più interna rispetto al segmento di DNA di interesse MULTIPLEX PCR: consente di amplificare contemporaneamente diversi segmenti dello stesso gene di interesse utilizzando coppie di inneschi differenti (es. Distrofia duchenne) PCR REAL TIME: consente sia di monitorare in tempo reale l andamento della reazione di PCR utilizzando sostanze fluorescenti e sia di misurare le quantità assolute di molecole di partenza NESTED PCR 1 a PCR 2 a PCR Amplificato bp Amplificato 2 65 bp Il vantaggio di questa reazione e di aumentare la specificita e la sensibilita dell amplificazione.

9 PRINCIPALI TIPI DI PCR b) NESTED PCR: serve ad ottenere una maggiore specificità del prodotto di amplificazione utilizzando in successione due coppie di inneschi: la prima più esterna mentre la seconda più interna rispetto al segmento di DNA di interesse MULTIPLEX PCR: consente di amplificare contemporaneamente diversi segmenti dello stesso gene di interesse utilizzando coppie di inneschi differenti (es. Distrofia duchenne) PCR REAL TIME: consente sia di monitorare in tempo reale l andamento della reazione di PCR utilizzando sostanze fluorescenti e sia di misurare le quantità assolute di molecole di partenza MULTIPLEX PCR DNA

10 PRINCIPALI TIPI DI PCR b) NESTED PCR: serve ad ottenere una maggiore specificità del prodotto di amplificazione utilizzando in successione due coppie di inneschi: la prima più esterna mentre la seconda più interna rispetto al segmento di DNA di interesse MULTIPLEX PCR: consente di amplificare contemporaneamente diversi segmenti dello stesso gene di interesse utilizzando coppie di inneschi differenti (es. Distrofia duchenne) PCR REAL TIME: consente sia di monitorare in tempo reale l andamento della reazione di PCR utilizzando sostanze fluorescenti e sia di misurare le quantità assolute di molecole di partenza Real Time PCR Tecnica che consente di monitorare in tempo reale l andamento di una reazione di amplificazione Tecnica basata sulla fluorescenza:l emissione di fluorescenza è direttamente correlata alla quantità di DNA amplificato.

11 halogen tungsten lamp filters intensifier detector 350,000 pixels excitation filters PIASTRA CAMPIONI

12 PCR: Curve di amplificazione Exponential phase Plateau phase

13 Cos è il ciclo soglia Ct? Rappresenta il ciclo di ciascuna reazione di amplificazione in corrispondenza del quale la fluorescenza del campione supera un valore soglia 2 1,6 1,2 Threshold Baseline Sample 0,8 0, Cos è il ciclo soglia Ct?

14 Come quantizzare un campione di DNA Standard curve

15 Real Time PCR CHIMICA utilizzata Agenti intercalanti EtBr (bromuro di etidio) SYBR Green, agente intercalante dotato di una maggiore sensibilità (200 volte più sensibile)

16 Agenti intercalanti Primers d. NTPs ID Intercalation Dyes Thermal Stable DNA Polymerase Taq λ ID Denaturazione Annealing Agenti intercalanti ID ID Taq Estensione Taq ID ID ID λ λ λ ID ID ID ID Taq ID λ λ Taq

17 halogen tungsten lamp filters intensifier detector 350,000 pixels excitation filters PIASTRA CAMPIONI TaqMan Probes

18 TaqMan Probes

19 TaqMan TM probe PRIMA DEL TAGLIO R Q DOPO IL TAGLIO R Q TaqMan TM Primers d. NTPs Thermal Stable DNA Polymerase R Probe Q Reaction Tube Taq λ R Q Denaturation Annealing

20 TaqMan TM Q R R Q R Taq R Extension Step 1. Strand Displacement Q Taq 2. Cleavage Taq Q Q Taq R λ R 3. Polymerization Complete 4. Detection

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