Guida del sistema HiSeq X

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1 Guida del sistema HiSeq X Solo a uso di ricerca. Non usare in procedimenti diagnostici. DI PROPRIETÀ DI ILLUMINA N. codice Rev. E ITA Luglio 2015 N. di catalogo SY DOC Personalizzare una breve guida al flusso di lavoro completo con Custom Protocol Selector support.illumina.com/custom-protocol-selector.html

2 Questo documento e il suo contenuto sono di proprietà di Illumina, Inc. e delle aziende a essa affiliate ("Illumina") e sono destinati esclusivamente a uso contrattuale da parte dei clienti di Illumina per quanto concerne l'utilizzo dei prodotti qui descritti con esclusione di qualsiasi altro scopo. Questo documento e il suo contenuto non possono essere usati o distribuiti per altri scopi e/o in altro modo diffusi, resi pubblici o riprodotti in alcun modo, senza preventiva approvazione scritta da parte di Illumina. Mediante questo documento Illumina non trasferisce alcuna licenza sui propri diritti su brevetti, marchi di fabbrica, copyright, o diritti secondo il diritto consuetudinario, né alcun diritto similare di alcun terzo. Al fine di assicurare un uso sicuro e corretto dei prodotti qui descritti, le istruzioni riportate in questo documento devono essere scrupolosamente ed esplicitamente seguite da personale qualificato e adeguatamente addestrato. Leggere e comprendere a fondo tutto il contenuto di questo documento prima di usare tali prodotti. LA LETTURA INCOMPLETA DEL CONTENUTO DEL PRESENTE DOCUMENTO E IL MANCATO RISPETTO DI TUTTE LE ISTRUZIONI IVI CONTENUTE PUÒ CAUSARE DANNI AL PRODOTTO, LESIONI PERSONALI A UTENTI E TERZI E DANNI MATERIALI. ILLUMINA NON SI ASSUME ALCUNA RESPONSABILITÀ DERIVANTE DALL USO IMPROPRIO DEL/DEI PRODOTTO/I QUI DESCRITTI (INCLUSI SOFTWARE O PARTI DI ESSO) Illumina, Inc. Tutti i diritti riservati. Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cbot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium, iscan, iselect, MiSeq, NeoPrep, Nextera, NextBio, NextSeq, Powered by Illumina, SeqMonitor, SureMDA, TruGenome, TruSeq, TruSight, Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, il colore arancione zucca e il design del fluire delle basi sono marchi o marchi registrati di Illumina, Inc. negli Stati uniti e/o in altri paesi. Tutti gli altri nomi, loghi e altri marchi di fabbrica sono di proprietà dei rispettivi titolari. ii N. codice Rev. E ITA

3 Cronologia revisioni N. codice Revisione Data Descrizione della modifica _ITA E Luglio 2015 Aggiornate le descrizioni del software per HiSeq X Control Software v3.3: Aggiornato il protocollo del lavaggio di manutenzione. Un lavaggio con Tween 20 e ProClin 300 sostituisce il lavaggio in tre fasi con NaOH. Sulla schermata Flow Cell Setup (Impostazione della cella a flusso), sostituito il tipo di cella a flusso HiSeq X HD v2 con il tipo di cella a flusso HiSeq X. Aggiunte le informazioni relative all'indicatore di rilevamento che mostra lo stato del trasferimento dei dati per il software RunCopyService. Aggiunte le istruzioni per la preparazione dei reagenti e dei primer di sequenziamento utilizzati nella risintesi paired-end e di indicizzazione. Aggiunta la sezione chiamata Differenze nel flusso di lavoro per SeqLab Illumina, che descrive dove trovare le istruzioni per la preparazione dei reagenti e per il sequenziamento se si sta utilizzando SeqLab Illumina. Aggiunti i numeri di catalogo per i kit HiSeq X v2.5 e aggiornato il numero di catalogo per il kit di reibridazione. Aggiunte le istruzioni per le corse scaglionate sulla cella a flusso A e sulla cella a flusso B. Sostituite le descrizioni sulle impostazioni del sistema con le istruzioni per le impostazioni del sistema personalizzate. Spostate le informazioni relative alla risoluzione dei problemi nell'appendice A e le informazioni sul software Real-Time Analysis (RTA) nell'appendice B. Rimossi i file di offset e i file della determinazione delle fasi (phasing) dall'elenco degli output del sequenziamento. RTA v2 non crea più questi file. Rimossa la Guida all'allestimento del laboratorio e alla preparazione della sede di installazione di HiSeq X Five (n. codice ) dalle Risorse addizionali. Le informazioni sull'allestimento del laboratorio e sulla preparazione della sede di installazione per HiSeq X Ten, HiSeq X Five e SeqLab Illumina sono disponibili nella Guida all'allestimento del laboratorio e alla preparazione della sede di installazione di HiSeq X (n. codice ). Guida del sistema HiSeq X iii

4 N. codice Revisione Data Descrizione della modifica _ITA D Gennaio _ITA C Ottobre 2014 Corretto il numero di identificazioni delle basi sotto 0,6 consentite nei primi 25 cicli da 2 a 1. Aggiornato l'elenco dei kit di reagenti HiSeq X da includere nei kit di reagenti HiSeq X Ten e nei kit di reagenti HiSeq X Five. Cambiato il nome del kit in confezione da 20 a kit in confezione da 10. Solo il nome è cambiato, il contenuto non è stato modificato. Aggiunta la Guida all'allestimento del laboratorio e alla preparazione della sede di installazione di HiSeq X Five (n. codice ) alle Risorse addizionali. Aggiornate le descrizioni software per HiSeq X Control Software v3.1: Aggiunto il tipo di cella a flusso HiSeq X HD v2 alla schermata Flow Cell Setup (Impostazione cella a flusso). Aggiunta l'opzione per eseguire un lavaggio di manutenzione o un lavaggio con acqua dopo ciascuna corsa. Un lavaggio di manutenzione è raccomandato dopo ciascuna corsa, ma non è più richiesto. Non è più richiesta la sostituzione delle guarnizioni durante ciascuna manutenzione; sostituire piuttosto le guarnizioni prima di avviare il lavaggio di manutenzione richiesto ogni 10 giorni. Aggiunta l'opzione per lavare solo le posizioni dei reagenti SBS. Rimosso l'id Indexing Reagent Kit dalla schermata Reagents (Reagenti). I reagenti di indicizzazione sono confezionati con i reagenti paired-end nei kit di reagenti HiSeq X HD. Aggiornato il comando Sequence (Sequenziamento) nella schermata Welcome (Benvenuto). Annotato che la cella a flusso HiSeq X HD (v1) e la cella a flusso HiSeq X HD v2 possono essere sequenziate contemporaneamente come Flow Cell A (Cella a flusso A) e Flow Cell B (Cella a flusso B). Annotato che è richiesto indicare una cartella di output anche quando si è connessi a BaseSpace per l'archiviazione e l'analisi. Aggiunto un promemoria per capovolgere ciascun flacone diverse volte prima di sostituire i cappucci e caricare i reagenti SBS. Aggiornato il n. di catalogo VWR per le salviette imbevute di alcool a Aggiornato l'url per le schede di sicurezza (SDS) all'indirizzo support.illumina.com/sds.html. iv N. codice Rev. E ITA

5 N. codice Revisione Data Descrizione della modifica _ITA B Maggio _ITA A Marzo 2014 Aggiornate le informazioni seguenti: Aggiunta la descrizione dei cluster che attraversano il filtro in base alle caratteristiche di una cella a flusso preconfigurata (patterned). Aggiunta la descrizione del raggruppamento dei punteggi qualitativi. Aggiornati i requisiti per lo spazio su disco disponibile. Annotato che il tempo di attesa per l'inizializzazione dei dispositivi dello strumento è di almeno 1 minuto. Aggiunte le pratiche migliori per eseguire una formattazione veloce dell'unità O:\ dopo ciascuna corsa. Corretto il numero di codice della Guida di riferimento per HiSeq X HD Reagent Kit sul diagramma del flusso di lavoro a Versione iniziale. Cronologia revisioni Guida del sistema HiSeq X v

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7 Sommario Cronologia revisioni Sommario iii vii Capitolo 1 Descrizione generale 1 Introduzione 2 Risorse addizionali 3 Componenti dello strumento 4 Panoramica sui materiali di consumo per il sequenziamento 9 Capitolo 2 Informazioni preliminari 11 Avvio di HiSeq X 12 Impostazioni del sistema personalizzate 13 Visualizzazione e invio dei dati dello strumento 14 Materiali di consumo forniti dall'utente 15 Capitolo 3 Preparazione dei reagenti di sequenziamento 17 Introduzione 18 Preparazione dei reagenti SBS 19 Preparazione dei reagenti PE e di indicizzazione 20 Capitolo 4 Esecuzione di una corsa di sequenziamento 21 Introduzione 22 Flusso di lavoro per il sequenziamento 23 Inserimento dei parametri della corsa 24 Caricamento e priming dei reagenti 27 Caricamento della cella a flusso per il sequenziamento 32 Monitoraggio della corsa 36 Rimozione e pesatura dei reagenti 37 Esecuzione di un lavaggio con acqua 38 Esecuzione di una formattazione veloce dell'unità di output 39 Capitolo 5 Manutenzione 41 Introduzione 42 Esecuzione di un lavaggio di manutenzione 43 Porre lo strumento nello stato inattivo (idling) 46 Spegnimento dello strumento 47 Appendice A Risoluzione dei problemi 49 Introduzione 50 Possibili problemi d'impostazione della corsa 51 Esecuzione di una verifica della fluidica 52 Mettere in pausa o terminare una corsa su HiSeq X 53 Corse scaglionate sulla cella a flusso A e sulla cella a flusso B 55 Possibile reibridazione primer Lettura 1 56 Appendice B Real-Time Analysis (RTA) 57 Introduzione 58 Descrizione generale di RTA v2 59 Guida del sistema HiSeq X vii

8 Flusso di lavoro di Real-Time Analysis 61 File di output del sequenziamento 66 Numerazione delle tile 67 Indice 69 Assistenza tecnica 73 viii N. codice Rev. E ITA

9 Capitolo 1 Descrizione generale Descrizione generale Introduzione 2 Risorse addizionali 3 Componenti dello strumento 4 Panoramica sui materiali di consumo per il sequenziamento 9 Capitolo 1 Guida del sistema HiSeq X 1

10 Descrizione generale Introduzione Caratteristiche Il sistema HiSeq X unisce una progettazione innovativa con la tecnologia SBS e la potenza per permettere il sequenziamento dell'intero genoma umano su scala di popolazione. } Imaging a doppia superficie: HiSeq X utilizza un sistema a epifluorescenza a due videocamere e quattro sensori con tecnologia di scansione all'avanguardia per consentire l'imaging a doppia superficie. } Cella a flusso preconfigurata (patterened): HiSeq X usa una cella a flusso preconfigurata (patterned) che permette la generazione di cluster di sequenziamento in un modo ordinato, per aumentare le letture di output e i dati generati. } Ampio vano refrigerato per i reagenti: lo scomparto reagenti è un ampio vano refrigerato che contiene reagenti sufficienti per l'intera corsa di sequenziamento. } Fluidica integrata per corse paired-end: la fluidica integrata paired-end fornisce i reagenti dallo scomparto reagenti alla cella a flusso per la risintesi Lettura 2 e per il sequenziamento indicizzato. } Opzioni dei controlli dell'interfaccia: l'interfaccia software dello strumento fornisce varie opzioni per l'impostazione della corsa e per il funzionamento dello strumento utilizzando il monitor touch screen o la tastiera integrata. } Identificazione delle basi in tempo reale: il software dello strumento estrae le intensità dalle immagini ed esegue l'identificazione delle basi qualitativamente valutate sul computer dello strumento, il che permette di monitorare le metriche di qualità durante la corsa e di risparmiare tempo prezioso durante la successiva analisi dei dati. L'analisi a valle dei dati di sequenziamento può essere eseguita con il software di analisi Illumina o software di terze parti su una infrastruttura personalizzata. } Connettività BaseSpace: HiSeq X dispone di un'opzione per inviare i dati relativi al sequenziamento e alla salute dello strumento tramite la soluzione genomica sul cloud di BaseSpace in tempo reale per semplificare il controllo della qualità e l'analisi dello strumento. Considerazioni relative alla sicurezza Per informazioni importanti sugli aspetti relativi alla sicurezza, vedere la Guida sulla sicurezza e conformità di HiSeq X (n. codice ). Differenze nel flusso di lavoro per SeqLab Illumina Se HiSeq X viene utilizzato come un componente di SeqLab Illumina, il flusso di lavoro è diverso rispetto ai flussi di lavoro descritti nella presente guida a causa delle differenze introdotte da Clarity LIMS X Edition. Questo incide su tutte le fasi dalla preparazione delle librerie fino al sequenziamento. Visitare la pagina di supporto di SeqLab Illumina sul sito Web Illumina per generare una guida al flusso di lavoro personalizzato per la strumentazione in uso. 2 N. codice Rev. E ITA

11 Risorse addizionali È possibile scaricare la documentazione seguente dal sito Web Illumina. Risorsa Guida all'allestimento del laboratorio e alla preparazione della sede di installazione di HiSeq X (n. codice ) Guida sulla sicurezza e conformità di HiSeq X (n. codice ) Descrizione Fornisce le specifiche relative ai locali del laboratorio, ai requisiti elettrici e ambientali. Fornisce informazioni su etichettatura dello strumento, certificazioni di conformità e aspetti relativi alla sicurezza. Risorse addizionali Guida di riferimento per HiSeq X Ten Reagent Kit v2 (n. codice ) Guida di riferimento per HiSeq X Five Reagent Kit v2 (n. codice ) Lista di controllo per HiSeq X Reagent Kit v2 (confezione da 10) (n. codice ) Modulo di monitoraggio del laboratorio di HiSeq X (n. codice ) Fornisce una descrizione dei contenuti dei kit e istruzioni per preparare i materiali di consumo prima di una corsa di sequenziamento. Fornisce un elenco interattivo da utilizzare quando si toglie dalla confezione e si conserva il kit di reagenti in confezione da 10 per i kit di reagenti HiSeq X Ten o HiSeq X Five. Fornisce un sunto interattivo di tipo di corse, numeri di lotto dei reagenti, pesi dei reagenti e volumi di erogazione per una corsa a doppia cella a flusso. Consultare la pagina di supporto di HiSeq X sul sito Web Illumina per accedere alla documentazione, ai download del software, ai training online e alle domande frequenti (FAQ). Per informazioni specifiche su SeqLab Illumina, consultare la pagina di supporto di SeqLab Illumina. Guida del sistema HiSeq X 3

12 Descrizione generale Componenti dello strumento Il sistema HiSeq X include lo strumento, un monitor, un computer di controllo dello strumento e accessori quali una tastiera, un mouse e uno scanner per codici a barre. Lo strumento include quattro scomparti principali: modulo ottica, scomparto della cella a flusso, scomparto della fluidica e scomparto reagenti. Lo stato operativo dello strumento è indicato da una barra di stato illuminata. Figura 1 Componenti esterni A B C D E Modulo ottica: contiene componenti ottici che consentono l'imaging a doppia superficie della cella a flusso, per l'acquisizione contemporanea di A, C, G e T mediante epifluorescenza. Il fascio laser di eccitazione passa attraverso l'obiettivo e la fluorescenza viene raccolta simultaneamente attraverso lo stesso obiettivo. Scomparto della cella a flusso: contiene il piano portacelle a depressione, che tiene in posizione la cella a flusso durante le corse di sequenziamento. Scomparto della fluidica: contiene le pompe della fluidica che erogano i reagenti alla cella a flusso e poi al contenitore per gli scarti. Barra di stato: utilizza tre colori per indicare lo stato dello strumento. Il blu indica che lo strumento è in esecuzione, l'arancione indica che lo strumento necessita attenzione e il verde indica che lo strumento è pronto a iniziare la corsa successiva. Scomparto reagenti: contiene i rack che contengono i reagenti per le corse di sequenziamento e la soluzione di lavaggio per i lavaggi dello strumento. Scomparto della cella a flusso Lo scomparto della cella a flusso contiene il piano portacelle, le stazioni termiche, il sistema del vuoto e le connessioni della fluidica a ciascuna cella a flusso. 4 N. codice Rev. E ITA

13 Figura 2 Piano portacelle con due celle a flusso A Cella a flusso A B Cella a flusso B C Leva della cella a flusso A D Leva della cella a flusso B Componenti dello strumento La cella a flusso A si trova a sinistra, la cella a flusso B a destra. Ciascuna cella a flusso è posizionata sul piano portacelle, che si sposta dentro e fuori il modulo ottica come indicato dal software di controllo. Il piano portacelle deve essere nella posizione più anteriore per aprire lo sportello dello scomparto della cella a flusso e caricare o rimuovere una cella a flusso. La cella a flusso è posizionata nel vano portacella con le porte di ingresso e di uscita rivolte verso il basso ed è tenuta in posizione da una pompa a vuoto sotto ciascuna cella a flusso. La leva della cella a flusso illuminata di fronte a ciascun vano portacella controlla la pompa a vuoto. La leva della cella a flusso diventa verde quando la tenuta del vuoto è corretta. Scomparto reagenti Lo scomparto reagenti è un ampio vano refrigerato per i reagenti che contiene tre rack reagenti: due per i reagenti SBS e uno per i reagenti di indicizzazione e i reagenti PE. Le maniglie dei pettini di aspirazione abbassano i pescanti nei flaconi di reagente. } Rack reagenti SBS: contiene flaconi conici da 250 ml. Il rack reagenti per la cella a flusso A si trova nella posizione centrale e il rack reagenti per la cella a flusso B si trova nella posizione all'estrema destra. Ciascun rack reagenti dispone di posizioni numerate che corrispondono ai collegamenti sulla valvola di selezione interna dei reagenti. } Rack reagenti di indicizzazione e reagenti PE: posizionato a sinistra. Dispone di due righe di posizioni numerate che contengono flaconi conici da 15 ml contenenti reagenti PE e reagenti di indicizzazione. La riga a sinistra è per la cella a flusso A e la riga a destra è per la cella a flusso B. } Vano refrigerato per i reagenti: il vano refrigerato per i reagenti alloggia i rack reagenti e mantiene una temperatura interna compresa tra 2 C e 8 C. Guida del sistema HiSeq X 5

14 Descrizione generale Figura 3 Scomparto reagenti A B C D Maniglie dei pettini di aspirazione Rack reagenti per i reagenti di indicizzazione e i reagenti PE Rack reagenti SBS per la cella a flusso A Rack reagenti SBS per la cella a flusso B Software HiSeq X Sul computer dello strumento sono installate tre applicazioni software. } HiSeq X Control Software: l'interfaccia HiSeq X Control Software guida l'utente lungo l'intera procedura di impostazione di una corsa di sequenziamento. Durante la corsa, il software di controllo controlla l'hardware dello strumento, controlla la fluidica, imposta le temperature e fornisce un riepilogo visivo delle statistiche di qualità. } Software Real-Time Analysis (RTA): integrato con il software di controllo, Real-Time Analysis (RTA) esegue l'identificazione delle basi e assegna un punteggio qualitativo a ciascuna base per ciascun ciclo. Per maggiori informazioni, vedere Real-Time Analysis (RTA) a pagina 57. } Software Sequencing Analysis Viewer: Sequencing Analysis Viewer (SAV) fornisce statistiche dettagliate sulla qualità. Icone di stato Le icone di stato posizionate nell'angolo superiore destro di ciascuna schermata segnalano cambiamenti nelle condizioni operative, errori o avvertenze durante le fasi di impostazione della corsa e durante l'esecuzione della corsa. Icona di stato Nome dello stato Stato OK Informazione Descrizione Nessun cambiamento. Le condizioni del sistema sono normali. Solo a fini informativi. Non si richiede alcun intervento. Attenzione Informazione che richiama l'attenzione dell'utente. 6 N. codice Rev. E ITA

15 Icona di stato Nome dello stato Avvertenza Errore Descrizione Le avvertenze non provocano l'arresto della corsa, ma possono subordinarne il proseguimento a un intervento dell'utente. In genere gli errori provocano l'arresto della corsa, che potrà continuare solo dopo un intervento dell'utente. Quando si verifica un cambiamento nelle condizioni operative, l'icona associata lampeggia per avvertire l'utente. } Selezionare l'icona per aprire la finestra di stato e visualizzare una descrizione della condizione. } Selezionare Acknowledge (Accetta) per confermare di aver letto il messaggio e Close (Chiudi) per chiudere la finestra di dialogo. Indicatori di attività e di rilevamento La schermata Welcome (Benvenuto) contiene nell'angolo inferiore destro una serie di icone che indicano l'attività dello strumento e lo stato di componenti specifici in base ai sensori dello strumento. Componenti dello strumento Figura 4 Indicatori di attività Da sinistra a destra, gli indicatori di attività rappresentano i motori X, Y e Z, la funzionalità dell'elettronica, la videocamera, il sistema di fluidica e le funzioni di elaborazione. Figura 5 Indicatori di rilevamento Da sinistra a destra, gli indicatori di rilevamento rappresentano la temperatura della cella a flusso A, la temperatura del vano refrigerato per i reagenti, lo stato del trasferimento dei dati, lo stato del cloud computing di BaseSpace e la temperatura della cella a flusso B. Stato del trasferimento dei dati Uno degli indicatori di rilevamento, stato del trasferimento dei dati, mostra lo stato di RunCopyService, che gestisce il trasferimento dei dati alla cartella di output. Lo stato del trasferimento incide sulla possibilità di avviare una nuova corsa o di formattare in sicurezza l'unità di output. Icona di stato Descrizione I dati sono in fase di trasferimento. Non formattare l'unità di output fino al termine del trasferimento. I dati sono in fase di trasferimento ma la connessione di rete è lenta. Non impostare una corsa di sequenziamento o formattare l'unità di output fino al termine del trasferimento. Guida del sistema HiSeq X 7

16 Descrizione generale Icona di stato Descrizione RunCopyService è spento. RunCopyService è acceso ma non trasferisce dati. 8 N. codice Rev. E ITA

17 Panoramica sui materiali di consumo per il sequenziamento I kit di reagenti Illumina sono richiesti per il sequenziamento su HiSeq X. Ciascuna kit contiene i reagenti per la generazione di cluster usati su cbot e i reagenti SBS, i reagenti di indicizzazione e i reagenti PE usati su HiSeq X. } Kit a singola confezione: ciascun kit comprende i materiali di consumo per il sequenziamento di due celle a flusso o di una corsa con doppia cella a flusso. I materiali di consumo sono confezionati in due set completi, ciascun set supporta una cella a flusso. } Kit in confezione da 10: ciascun kit comprende i materiali di consumo per il sequenziamento di venti celle a flusso o di corse con dieci doppie celle a flusso. I materiali di consumo sono confezionati per supportare quattro celle a flusso alla volta. Nome del kit HiSeq X HiSeq X Ten Reagent Kit v2.5 (300 cicli) HiSeq X Ten Reagent Kit v2.5 (300 cicli), confezione da 10 HiSeq X Five Reagent Kit v2.5 (300 cicli) HiSeq X Five Reagent Kit v2.5 (300 cicli), confezione da 10 HiSeq X Ten Reagent Kit v2 (300 cicli) HiSeq X Ten Reagent Kit v2 (300 cicli), confezione da 10 HiSeq X Five Reagent Kit v2 (300 cicli) HiSeq X Five Reagent Kit v2 (300 cicli), confezione da 10 N. di catalogo FC FC FC FC FC FC FC FC Panoramica sui materiali di consumo per il sequenziamento Guida del sistema HiSeq X 9

18 Descrizione generale Cella a flusso preconfigurata (patterned) HiSeq X utilizza una cella a flusso (patterned) con miliardi di nano pozzetti ordinati all'interno del vetro della cella a flusso. L'organizzazione ordinata aumenta il numero di letture di output e la quantità di dati di sequenziamento generati. La cella a flusso (patterned) è fornita in HiSeq X Reagent Kit. Figura 6 Esempi di cluster su una cella a flusso preconfigurata (patterned) 10 N. codice Rev. E ITA

19 Capitolo 2 Informazioni preliminari Informazioni preliminari Avvio di HiSeq X 12 Impostazioni del sistema personalizzate 13 Visualizzazione e invio dei dati dello strumento 14 Materiali di consumo forniti dall'utente 15 Capitolo 2 Guida del sistema HiSeq X 11

20 Informazioni preliminari Avvio di HiSeq X 1 Avviare il computer di controllo dello strumento. 2 Accedere al sistema operativo usando il nome utente e la password predefiniti. Nome utente: sbsuser Password: sbs123 Attendere che il caricamento giunga a termine. Se i valori predefiniti non funzionano, consultare l'amministratore della struttura per individuare il nome utente e la password specifici per la struttura. 3 Portare l'interruttore principale in posizione ON. Quando si sta di fronte allo strumento, l'interruttore si trova sul lato sinistro. 4 Attendere almeno 1 minuto per la configurazione corretta dei dispositivi dello strumento e per l'inizializzazione dell'unità dello strumento denominata "DoNotEject" (Non espellere). Alla conclusione dell'inizializzazione dell'unità si apre una finestra. Chiudere la finestra. Se la finestra non si apre, usare MyComputer per verificare l'unità DoNotEject. NOTA Non espellere mai l'unità di tipo flash denominata "DoNotEject" posta all'interno del telaio dello strumento ed evitare di modificare i file su tale unità. Questa unità contiene file della configurazione hardware e si inizializza ogni volta che lo strumento viene acceso. 5 Per garantire uno spazio su disco adeguato, archiviare in rete i dati che si trovano sul computer dello strumento e provengono dalle analisi precedenti. 6 Aprire HiSeq X Control Software mediante l'icona di collegamento sul desktop del computer. Per l'inizializzazione del software di controllo, sono necessari alcuni minuti. Una volta inizializzato il software, si apre la schermata Welcome (Benvenuto) e nella parte inferiore destra della schermata appare l'icona di inizializzazione Pratiche migliori per gestire lo strumento e il computer di controllo } Non accendere il computer quando lo strumento è in funzione. Accendere sempre il computer prima di accendere lo strumento. } Non spegnere lo strumento quando il software di controllo dello strumento è in esecuzione. } Dopo aver spento lo strumento, attendere un minuto prima di accenderlo di nuovo. } Prima di accendere il computer, collegare i cavi USB per lo strumento, il monitor e la tastiera alla parte posteriore del computer. } Collegare lo scanner per codici a barre e il mouse alle porte USB nella parte anteriore del computer. 12 N. codice Rev. E ITA

21 Impostazioni del sistema personalizzate Il software di controllo include le impostazioni del sistema personalizzate per le cartelle della corsa e per le preferenze LIMS. La finestra Menu Options (Opzioni di menu) fornisce le impostazioni per definire il modello del nome della corsa, le posizioni delle cartelle predefinite, se inviare le informazioni sulla salute dello strumento a Illumina e un server, nome utente e password LIMS. Per personalizzare la visualizzazione dell'interfaccia del software di controllo, selezionare Menu View (Menu Visualizza). È possibile visualizzare l'interfaccia a schermo intero o in una finestra, o minimizzare l'interfaccia. Definizione delle impostazioni delle cartelle della corsa 1 Dalla schermata Welcome (Benvenuto), selezionare Menu Tools Options (Menu Strumenti Opzioni) per aprire la finestra Menu Options (Opzioni di menu). 2 Per personalizzare la convenzione usata per generare i nomi per le cartelle della corsa, modificare le impostazioni nel campo Run ID Template (Modello nome corsa). Selezionare Reset (Reimposta) per annullare il campo. 3 Per impostare le posizioni di output predefinite, immettere una posizione per ciascuna cartella seguente: Default Output Folder (Cartella di output predefinita): la posizione della cartella di output predefinita per le corse sulla cella a flusso A. Default Output Folder2 (Cartella di output predefinita 2): la posizione della cartella di output predefinita per le corse sulla cella a flusso B. NOTA Illumina raccomanda una posizione di rete per le cartelle di output. Tuttavia, è possibile specificare una posizione sull'unità O:\ solo se la posizione è diversa dalla cartella HiSeq Temp (HiSeq temporanea). Non utilizzare l'unità S:\ o l'unità C:\. L'unità S:\ è riservata per le operazioni dello strumento e l'unità C:\ è troppo piccola. 4 Per impostare una posizione per i moduli campione LIMS, immettere una posizione nel campo Run Setup Folder (Cartella impostazione corsa). 5 Selezionare OK (Ok) per salvare il lavoro e chiudere la finestra Menu Options (Opzioni di menu). Selezionare Cancel (Annulla) per chiudere senza salvare. Impostazioni del sistema personalizzate Impostazione delle preferenze per LIMS 1 Dalla schermata Welcome (Benvenuto), selezionare Menu Tools Options (Menu Strumenti Opzioni) per aprire la finestra Menu Options (Menu delle opzioni). 2 Immettere le impostazioni seguenti per LIMS: LIMS Server (Server LIMS): il nome del server per l'interazione con i file LIMS supportati da Illumina. LIMS User Name (Nome utente LIMS): il nome utente usato per l'autenticazione a LIMS Illumina. LIMS Password (Password LIMS): la password usata per l'autenticazione dei file LIMS Illumina. 3 Selezionare OK (Ok) per salvare il lavoro e chiudere la finestra Menu Options (Opzioni di menu). Selezionare Cancel (Annulla) per chiudere senza salvare. Guida del sistema HiSeq X 13

22 Informazioni preliminari Visualizzazione e invio dei dati dello strumento Il pulsante Menu (Menu) sulla schermata Welcome (Benvenuto) e la finestra Menu Options (Opzioni di menu) forniscono opzioni per visualizzare e inviare i dati dello strumento. } Per visualizzare le informazioni su hardware dello strumento, versioni del software e su come mettersi in contatto con l'assistenza tecnica, selezionare Menu About (Menu Informazioni su). } Per permettere allo strumento di inviare informazioni a BaseSpace per ciascuna corsa (raccomandato), selezionare Menu Tools Options (Menu Strumenti Opzioni) e selezionare la casella di controllo Send instrument health data to Illumina to help Illumina improve its products (Invia dati sulla salute dello strumento a Illumina per migliorare i prodotti). Tutte le informazioni rimangono confidenziali. 14 N. codice Rev. E ITA

23 Materiali di consumo forniti dall'utente Per un elenco completo dei materiali di consumo forniti dall'utente, vedere la Guida all'allestimento del laboratorio e alla preparazione della sede di installazione di HiSeq X (n. codice ). Materiale di consumo Fornitore Scopo Salviettine imbevute di alcol isopropilico al 70% o etanolo al 70% Damigiana, da almeno 6 litri Fornitore di laboratorio generico VWR, n. di catalogo Fornitore di laboratorio generico Corning, n. di catalogo Pulizia della cella a flusso e del piano portacelle. Per la preparazione della soluzione di lavaggio di manutenzione. Guanti, privi di polvere Fornitore di laboratorio generico Uso generale. Panno da laboratorio a VWR, n. di catalogo Pulizia del vano portacella. bassissimo rilascio di particelle ProClin 300, 50 ml Sigma-Aldrich, n. di catalogo Lavaggio di manutenzione U Provette, centrifuga, da 250 ml Fornitore di laboratorio generico Corning, n. di catalogo Lavaggio dello strumento. Rack reagenti SBS, posizioni contenenti PW1. Provette, coniche, da 15 ml Fornitore di laboratorio generico Corning, n. di catalogo Raccolta e misura del volume degli scarti. Rack reagenti PE, posizioni contenenti PW1. Lavaggio di manutenzione. Tween 20, liquido viscoso, 100 ml Sigma-Aldrich, n. di catalogo P7949 Pinzette di plastica con punta McMaster-Carr, n. di catalogo Rimozione delle guarnizioni quadrata 7003A22 della cella a flusso. Acqua, da laboratorio,18 M Ohm Millipore Lavaggio con acqua. Rack reagenti SBS e PE, posizioni contenenti PW1. Materiali di consumo forniti dall'utente Guida del sistema HiSeq X 15

24 16 N. codice Rev. E ITA

25 Capitolo 3 Preparazione dei reagenti di sequenziamento Preparazione dei reagenti di sequenziamento Introduzione 18 Preparazione dei reagenti SBS 19 Preparazione dei reagenti PE e di indicizzazione 20 Capitolo 3 Guida del sistema HiSeq X 17

26 Preparazione dei reagenti di sequenziamento Introduzione Prima di impostare la corsa, preparare tutti i reagenti per il sequenziamento: reagenti SBS, reagenti di indicizzazione e reagenti PE. Le istruzioni per la preparazione dei reagenti sono le stesse indipendentemente della versione del kit. Durante l'impostazione della corsa, quando indicato dal software, caricare tutti i reagenti. Durante la corsa, non è necessario tornare allo strumento per caricare i reagenti. I reagenti possono essere preparati durante la generazione di cluster. Per istruzioni su come preparare la cella a flusso, preparare i reagenti per la generazione di cluster ed eseguire la generazione di cluster, vedere la Guida del sistema cbot (n. codice ). 18 N. codice Rev. E ITA

27 Preparazione dei reagenti SBS Utilizzare le istruzioni seguenti per scongelare e ispezionare i reagenti SBS: PSM, PIM e PCM. Utilizzare PB1 e PB2 direttamente dalla temperatura di conservazione. Preparare il numero corretto di flaconi di reagenti SBS. Reagente Per una cella a flusso (corsa con singola cella a flusso) Per due celle a flusso (corsa con doppia cella a flusso) Per quattro celle a flusso (corsa con due doppie celle a flusso) PB PB PCM PIM PSM Scongelamento dei reagenti SBS 1 Rimuovere PSM, PIM e PCM dalla temperatura di conservazione compresa tra -25 C e -15 C e scongelarli a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C per circa 16 ore. In alternativa, scongelare PSM e PIM in un bagno d'acqua deionizzata a temperatura ambiente per circa 90 minuti. Scongelare PCM in un bagno d'acqua separato. Sostituire i guanti dopo aver maneggiato PCM. 2 Capovolgere ciascun flacone per miscelare. Ispezionare per assicurarsi che i reagenti siano scongelati e privi di cristalli di ghiaccio. 3 Ispezionare PSM che non siano visibili movimenti a vortice. 4 Mettere PSM e PIM da parte su ghiaccio fino a quando non si è pronti a caricare i reagenti. Mettere PCM da parte su ghiaccio separatamente per impedire la contaminazione incrociata. Sostituire i guanti dopo aver maneggiato PCM. Preparazione dei reagenti SBS Guida del sistema HiSeq X 19

28 Preparazione dei reagenti di sequenziamento Preparazione dei reagenti PE e di indicizzazione I reagenti PE e di indicizzazione sono utilizzati durante la fase di risintesi di Lettura 2 di una corsa di sequenziamento paired-end. Preparare il numero corretto di provette per ciascun reagente PE e di indicizzazione. Reagente Quantità per una cella a flusso (corsa con cella a flusso singola) Quantità per due celle a flusso (corsa con doppia cella a flusso) Quantità per quattro celle a flusso (corse con due doppie celle a flusso) PRM PLM PAM PPM PDR HP HP AVVERTENZA Questo set di reagenti contiene formammide, una ammide alifatica che è una probabile tossina riproduttiva. L'inalazione, l'ingestione, il contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali. Indossare equipaggiamento protettivo, inclusi protezione per gli occhi, guanti e indumento da laboratorio. Manipolare i reagenti usati come rifiuti chimici e smaltirli in base agli standard di sicurezza governativi locali. Per ulteriori informazioni su ambiente, salute e sicurezza, vedere le SDS per questo kit, all'indirizzo support.illumina.com/sds.html. Scongelamento dei reagenti PE e di indicizzazione 1 Rimuovere i reagenti seguenti dalla temperatura di conservazione compresa tra -25 C e -15 C: PRM, PLM2, PAM, PPM, PDR, HP11 e HP12. NOTA HP12 non è richiesto per le librerie non indicizzate. 2 Scongelare i reagenti a temperatura ambiente in un bagno d'acqua deionizzata per circa 20 minuti o fino allo scongelamento dei reagenti. 3 Collocare PRM, PLM2 e PAM su ghiaccio. Preparazione di PRM, PLM2, PAM, PPM, PDR, HP11 e HP12 1 Capovolgere ciascuna provetta diverse volte per miscelare. 2 Centrifugare a 1000 rpm per 1 minuto. 3 Per PRM, PLM2 e PAM: mettere da parte su ghiaccio. Per PPM, PDR, HP11 e HP12: mettere da parte a temperatura ambiente. 20 N. codice Rev. E ITA

29 Capitolo 4 Esecuzione di una corsa di sequenziamento Esecuzione di una corsa di sequenziamento Introduzione 22 Flusso di lavoro per il sequenziamento 23 Inserimento dei parametri della corsa 24 Caricamento e priming dei reagenti 27 Caricamento della cella a flusso per il sequenziamento 32 Monitoraggio della corsa 36 Rimozione e pesatura dei reagenti 37 Esecuzione di un lavaggio con acqua 38 Esecuzione di una formattazione veloce dell'unità di output 39 Capitolo 4 Guida del sistema HiSeq X 21

30 Esecuzione di una corsa di sequenziamento Introduzione Per eseguire una corsa su HiSeq X, preparare tutti i reagenti e attenersi ai suggerimenti del software per impostare la corsa. I passaggi per l'impostazione della corsa includono l'inserimento dei parametri della corsa, il caricamento e il priming dei reagenti, il caricamento della cella a flusso e una verifica della fluidica. Per informazioni relative alla durata della corsa e altre specifiche delle prestazioni, visitare la pagina delle specifiche HiSeq X sul sito Web Illumina. Corse scaglionate È possibile avviare una nuova corsa sulla cella a flusso A o sulla cella a flusso B quando una corsa sulla cella a flusso adiacente è in fase di elaborazione. Per maggiori informazioni, vedere Corse scaglionate sulla cella a flusso A e sulla cella a flusso B a pagina N. codice Rev. E ITA

31 Flusso di lavoro per il sequenziamento Preparare la cella a flusso e i reagenti per la corsa. Vedere Preparazione dei reagenti di sequenziamento a pagina 17. Utilizzando le informazioni indicate sull'interfaccia del software di controllo, immettere i parametri della corsa. Pesare i reagenti. Caricare i reagenti SBS per Lettura 1 e Lettura 2, i reagenti di indicizzazione (se applicabile) e i reagenti PE. Con una cella a flusso usata, confermare il flusso corretto. Eseguire il priming dei reagenti SBS e misurare gli scarti del priming. Caricare una cella a flussohiseq X con cluster e confermare il flusso corretto. Avviare la corsa di sequenziamento. [Opzionale] Dopo il ciclo 2, ispezionare First Base Report (Report sulla prima base) e quindi proseguire la Lettura 1. Flusso di lavoro per il sequenziamento Al termine della corsa, rimuovere e pesare i reagenti. Eseguire un lavaggio dello strumento. Guida del sistema HiSeq X 23

32 Esecuzione di una corsa di sequenziamento Inserimento dei parametri della corsa Nella schermata Welcome (Benvenuto), selezionare Sequence (Sequenziamento). L'interfaccia del software di controllo guida l'utente attraverso le fasi di impostazione della corsa. Le fasi di impostazione della corsa sono organizzate in tre schede: Run Configuration, Pre-Run Setup e Initiate Run (Configurazione corsa, Impostazioni pre-corsa e Avvio corsa). } Le schermate di configurazione della corsa contengono elenchi a tendina o campi di testo per i parametri della corsa. Usare lo scanner portatile per codici a barre per scansionare l'id della cella a flusso o del kit di reagenti, oppure inserire l'id utilizzando la tastiera del touch screen. L'icona della tastiera si trova a destra dei campi per il testo. } Selezionare Next (Avanti) per passare alla schermata successiva o selezionare Back (Indietro) per tornare alla schermata precedente. } In qualunque momento durante le fasi di impostazione della corsa, è possibile selezionare Cancel (Annulla) per uscire dall'impostazione della corsa e ritornare alla schermata Welcome (Benvenuto). Schermata Storage (Archiviazione) 1 Selezionare Connect to BaseSpace (Collegarsi a BaseSpace) per collegare la corsa a BaseSpace. 2 Selezionare un'impostazione per BaseSpace: Storage and Analysis (Archiviazione e analisi): invia i dati della corsa a BaseSpace per il monitoraggio remoto e l'analisi dei dati. Con questa opzione è richiesto un foglio campioni. NOTA Assicurarsi che la connessione di rete corrisponda ai requisiti minimi per il trasferimento dei dati a BaseSpace. Per maggiori informazioni, vedere la Guida all'allestimento del laboratorio e alla preparazione della sede di installazione di HiSeq X (n. codice ). Run Monitoring Only (Solo monitoraggio corsa): invia solo i file InterOp a BaseSpace, che permettono di monitorare la corsa in remoto. NOTA Per valore predefinito, il software comprime in formato zip i file per l'identificazione delle basi (BCL) e raggruppa i punteggi qualitativi per ridurre lo spazio di archiviazione. Per maggiori informazioni, vedere Raggruppamento dei punteggi qualitativi a pagina Accedere a BaseSpace con l' e la password dell'account MyIllumina. 4 Selezionare Browse (Sfoglia) e andare alla posizione della cartella di output prescelta. 5 Confermare che l'impostazione per le immagini in miniatura sia Save All Thumbnails (Salva tutte le immagini in miniatura). Il software salva automaticamente tutte le immagini in miniatura. Un'immagine in miniatura è una campionatura di immagini da diverse tile in ciascuna colonna di tile o striscia, combinata in un'immagine in miniatura. 6 Selezionare Next (Avanti). 24 N. codice Rev. E ITA

33 Schermata Flow Cell Setup (Impostazione cella a flusso) La schermata Flow Cell Setup (Impostazione cella a flusso) registra le informazioni sulla cella a flusso usata per la corsa. Sono richiesti tutti i campi. 1 Sottoporre a scansione o inserire l'id della cella a flusso (numero di codice a barre) per la quale si desidera eseguire il sequenziamento. 2 Confermare che il tipo di cella a flusso sia HiSeq X o HiSeq X HD. NOTA Una cella a flusso HiSeq X e una cella a flusso HiSeq X HD possono essere sequenziate contemporaneamente come cella a flusso A e cella a flusso B. 3 Immettere il nome dell'esperimento da visualizzare in ciascuna schermata per permettere di identificare la corsa in fase di elaborazione. 4 Immettere un nome utente. 5 Selezionare Next (Avanti). Schermata Advanced (Avanzato) 1 [Opzionale] Selezionare la casella di controllo Confirm First Base (Conferma prima base). Un report sulla prima base viene generato automaticamente per ciascuna corsa dopo il ciclo 2 e posizionato nel livello base della cartella della corsa. La selezione di questa opzione permette di confermare il report sulla prima base prima di procedere con la corsa. In caso contrario, la corsa continua senza mostrare la casella di dialogo di conferma. 2 [Opzionale] Dall'immagine della cella a flusso, selezionare qualsiasi corsia che si desidera rimuovere dalla corsa. Tutte le corsie sono incluse come valore predefinito. L'allineamento del campione di controllo PhiX viene eseguito automaticamente per tutte le corsie. NOTA Una corsia di controllo dedicata non è richiesta o non rappresenta un'opzione. 3 Selezionare Next (Avanti). Inserimento dei parametri della corsa Schermata Recipe (Ricetta) Una ricetta viene generata automaticamente in base alle informazioni inserite sulla schermata Recipe (Ricetta). 1 Selezionare l'opzioni per Index Type (Tipo indice): No Index (Nessun indice): esegue una corsa paired-end non indicizzata. Single Index (Indice singolo): esegue una corsa paired-end con una lettura di indicizzazione da 8 bp. 2 Immettere il numero di cicli per Lettura 1 e Lettura 2 e per Lettura Indici, se applicabile. Guida del sistema HiSeq X 25

34 Esecuzione di una corsa di sequenziamento 3 Confermare le impostazioni seguenti, che vengono popolate automaticamente in base al tipo di indice selezionato. a SBS: HiSeq X SBS: mostra la chimica SBS usata per Lettura 1 e Lettura 2. b Indice: HiSeq X Sequencing Primer: mostra la chimica usata per le letture indice, se applicabile. c Inversione PE: HiSeq X PE: mostra la chimica usata per la risintesi paired-end. Schermata Sample Sheet (Foglio campioni) I fogli campioni sono opzionali fatta eccezione quando si usa BaseSpace per eseguire l'analisi dei dati. 1 Selezionare Browse (Sfoglia) e andare alla posizione del foglio campioni. 2 Selezionare Next (Avanti). Schermata Reagents (Reagenti) La schermata Reagents (Reagenti) registra informazioni sul kit di reagenti utilizzato per la corsa. 1 Nel campo SBS Reagent Kit ID (ID del kit di reagenti SBS), eseguire la scansione o immettere l'id del codice a barre del kit da qualsiasi delle seguenti scatole del kit SBS: Kit a singola confezione: SBS Kit, scatola 1 o 2 Kit in confezione da 10: SBS Kit, scatole A-F 2 Nel campo PE Reagent Kit ID (ID PE Reagent Kit), eseguire la scansione o immettere l'id del codice a barre del kit di reagenti PE da una scatola di PE Cluster Kit: Kit a singola confezione: PE Cluster Kit, scatola 2 Kit in confezione da 10: PE Cluster Kit, scatola C 3 Selezionare 300 Cycles (300 cicli). I cicli rimanenti rimangono al valore predefinito di 310 cicli. NOTA Il software conta il numero di cicli rimasti immessi dal campo Cycles Remaining (Cicli rimanenti). Quando il numero di cicli comincia a essere basso, il software chiede all'utente di caricare reagenti freschi. 4 Selezionare Prime SBS Reagents (Priming reagenti SBS) per eseguire il priming dei reagenti. Assicurarsi di eseguire il priming dei reagenti prima di caricare una cella a flusso con cluster. 5 Selezionare Next (Avanti). Schermata Review (Revisione) 1 Rivedere i parametri per la corsa sulla schermata Review (Revisione). 2 Selezionare Next (Avanti) per procedere o selezionare Back (Indietro) per modificare i parametri. 26 N. codice Rev. E ITA

35 Caricamento e priming dei reagenti Dopo aver immesso i parametri della corsa, caricare i reagenti SBS, di indicizzazione e PE per la corsa, quindi eseguire il priming dei reagenti nel sistema di fluidica. Il software guida l'utente in questo processo tramite una serie di schermate sulla scheda Pre-Run Setup (Impostazioni pre-corsa). Caricamento dei reagenti SBS 1 Capovolgere ciascun flacone di reagente diverse volte per miscelare. ATTENZIONE Manipolare PCM per ultimo, dopo aver caricato tutti i reagenti, per impedire la contaminazione incrociata. Dopo aver manipolato il flacone di PCM, smaltire i guanti e sostituirli con un nuovo paio. 2 Rimuovere il tappo da ciascun flacone e sostituirlo con un tappo a imbuto. 3 Registrare il peso di ciascun reagente sul modulo di monitoraggio del laboratorio. NOTA La pesatura dei reagenti prima e dopo la corsa di sequenziamento conferma l'erogazione appropriata dei reagenti. 4 Aprire lo sportello dello scomparto reagenti. 5 Sollevare i pettini di aspirazione per il rack reagenti per il sequenziamento come indicato di seguito. a Tirare la maniglia del pettine di aspirazione verso di sé, quindi sollevarla. b Rilasciare la maniglia nell'alloggiamento nella parte superiore della scanalatura. Assicurarsi che la maniglia sia posizionata correttamente nell'alloggiamento. 6 Far scorrere il rack reagenti fuori dallo scomparto reagenti. 7 Posizionare ciascun flacone di reagente sul rack nelle posizioni numerate associate. Assicurarsi che l'estremità conica del flacone sia posizionata nella tacca alla base del rack. Tabella 1 Posizioni dei reagenti SBS Posizione Reagente Descrizione 1 PIM Patterned Incorporation Mix 2 PW1 25 ml di PW1 o acqua da laboratorio 3 PSM Patterned Scan Mix 4 PB1 Patterned SBS tampone 1 5 PB2 Patterned SBS tampone 2 6 PB2 Patterned SBS tampone 2 7 PCM Patterned Cleavage Mix 8 PB2 Patterned SBS tampone 2 Caricamento e priming dei reagenti 8 Indossare un nuovo paio di guanti in lattice privi di polvere. 9 Far scorrere il rack reagenti nello scomparto reagenti, allineando il rack con la guida sollevata sulla parte inferiore dello scomparto. Guida del sistema HiSeq X 27

36 Esecuzione di una corsa di sequenziamento 10 Abbassare i pettini di aspirazione nei flaconi di reagente per il sequenziamento come segue. a Tirare la maniglia del pettine di aspirazione verso di sé, quindi abbassarla. b Ispezionare i pettini di aspirazione per assicurarsi che non si pieghino mentre si abbassano nei tappi a imbuto. c Rilasciare la maniglia nell'alloggiamento nella parte inferiore della scanalatura. Caricamento dei reagenti di indicizzazione e PE 1 Registrare il peso di ciascun reagente sul modulo di monitoraggio del laboratorio. 2 Sollevare i pescanti per il rack dei reagenti PE, effettuando i seguenti movimenti: a Tirare la maniglia verso di sé e quindi sollevare la maniglia. b Rilasciare la maniglia nell'alloggiamento nella parte superiore della scanalatura. Assicurarsi che la maniglia sia posizionata correttamente nell'alloggiamento. 3 Far scorrere il rack reagenti fuori dallo scomparto reagenti usando la maniglia del rack. 4 Posizionare provette coniche da 15 ml con 10 ml di PW1 o di acqua da laboratorio nelle posizioni 12, 18 e 19 sul rack dei reagenti PE. 5 Rimuovere i tappi da ciascuna provetta di reagente e posizionare la provetta sul rack nella posizione numerata associata o facendo corrispondere il colore dell'etichetta. Tabella 2 Posizioni dei reagenti PE Posizione Reagente Descrizione 10 PRM Patterned Resynthesis Mix 11 PLM2 Patterned Linearization Mix 2 12 PW1 10 ml di PW1 o acqua da laboratorio 13 PAM Patterned Amplification Mix 14 PPM Patterned Amp Premix 15 PDR Patterned Denaturation Mix (contiene formammide) 16 HP11 Miscela primer, Lettura 2 17 HP12* Miscela primer, Lettura Indice 1 18 PW1 10 ml di PW1 o acqua da laboratorio 19 PW1 10 ml di PW1 o acqua da laboratorio * HP12 è richiesto solo per le corse indicizzate. Se HP12 non è usato, caricare una provetta conica da 15 ml con 10 ml di PW1 o di acqua da laboratorio. 6 Far scorrere il rack reagenti nello scomparto reagenti, allineando il rack con la guida sollevata sulla parte inferiore dello scomparto. 7 Abbassare i pescanti nei flaconi di reagenti PE come segue: a Tirare la maniglia verso di sé e quindi abbassare la maniglia. b Ispezionare visivamente i pescanti per assicurarsi che non si pieghino mentre si abbassano nelle provette. c Rilasciare la maniglia nell'alloggiamento nella parte inferiore della scanalatura. 8 Selezionare la casella di controllo PW1 (25 ml) loaded in Position 2 (PW1-25 ml - caricato in posizione 2), quindi selezionare Next (Avanti). 28 N. codice Rev. E ITA

37 Priming dei reagenti La procedura per il priming dei reagenti include il caricamento di una cella a flusso per il priming, la conferma del flusso corretto e l'avvio del priming. Caricamento di una cella a flusso per il priming Dalla schermata Load Priming Flow Cell (Caricamento cella a flusso per il priming), caricare una cella a flusso usata, per eseguire la fase di priming. NOTA Usare la cella a flusso proveniente da una corsa precedente per il priming dei reagenti su una corsa successiva o per un lavaggio dello strumento post-corsa. 1 Se si sta utilizzando una cella a flusso usata da una provetta di tampone di conservazione, attenersi alle fasi successive per pulire e caricare la cella a flusso: a Lavare con acqua da laboratorio. b Asciugarla con un panno pulente per lenti o con un panno che non lascia residui. c Pulire con salviette imbevute di alcol e un panno pulente per lenti. 2 Collocare la cella a flusso sul vano portacella con le porte di ingresso e uscita rivolte verso il basso e il codice a barre a destra. Assicurarsi che la freccia sul bordo sinistro della cella a flusso, che indica la direzione del flusso, punti verso lo strumento. 3 Far scorrere delicatamente la cella a flusso verso i perni guida superiore e destro fino a quando non si blocca. NOTA Rimuovere la mano dalla cella a flusso prima di attivare l'interruttore della pompa a vuoto per prevenire possibili perdite di allineamento nel tempo. Caricamento e priming dei reagenti Figura 7 Cella a flusso posizionata sui perni guida superiore e destro A B Perno guida superiore Perni guida destri 4 Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 1 per attivare la pompa a vuoto e assicurare la cella a flusso in posizione. Quando la leva della cella a flusso lampeggia verde, la pompa a vuoto è posizionata correttamente. Se la leva non è verde, vedere Possibili problemi d'impostazione della corsa a pagina 51. Guida del sistema HiSeq X 29

38 Esecuzione di una corsa di sequenziamento Figura 8 Leva della cella a flusso in posizione 1 5 Attendere circa cinque secondi, quindi spostare lentamente la leva della cella a flusso nella posizione 2. Quando la leva della cella a flusso è verde fisso, i collettori sono in posizione e la cella è pronta per l'uso. Figura 9 Leva della cella a flusso in posizione 2 6 Assicurarsi che la casella di spunta Vacuum Engaged (Pompa a vuoto attiva) sia selezionata sulla schermata caricamento cella a flusso per il priming e poi selezionare Next (Avanti). Conferma del flusso corretto La verifica del flusso corretto conferma che la cella a flusso e le guarnizioni sono installate correttamente e che il collettore è posizionato correttamente. 1 Sottoporre a scansione o inserire l'id della cella a flusso per il priming (numero di codice a barre). 2 Selezionare la soluzione 2 (acqua da laboratorio) dall'elenco a tendina. ATTENZIONE Usare acqua per confermare il flusso corretto solo su una cella a flusso usata. 3 Confermare i valori predefiniti seguenti e quindi selezionare Pump (Pompa). Volume (Volume): 125 Aspirate Rate (Velocità di aspirazione): 250 Dispense Rate (Velocità di erogazione): Ispezionare la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie e di perdite vicino ai collettori. Se sono presenti bolle eccessive, verificare la presenza di ostruzioni nelle guarnizioni, ridurre la velocità di aspirazione a 100 e pompare altri 125 µl di acqua nella cella a flusso. Se il problema persiste, rimuovere la cella a flusso, ripetere le fasi di pulizia e ricaricare la cella a flusso. 30 N. codice Rev. E ITA

39 Posizionamento dei tubi e avvio del priming 1 Rimuovere i tubi di scarico per la cella a flusso dal contenitore per gli scarti. Figura 10 Posizionamento dei tubi 2 Collocare ciascun tubo in una provetta vuota separata da 15 ml. 3 Selezionare Start Prime (Avvia priming). 4 Monitorare l'avanzamento della fase di priming dall'apposita schermata. 5 Al completamento della fase di priming, misurare il volume di priming raccolto e confermare che il volume in ciascuna provetta sia 1,75 ml. Se i volumi di priming vengono raccolti in un flacone per ciascuna cella a flusso, confermare che il volume sia 14 ml. I volumi sono calcolati nel modo seguente: 250 µl per ciascuna posizione SBS, fatta eccezione per la posizione 2 (250 x 7 = 1,75 ml) 1,75 ml per ciascuna corsia (1,75 x 8 = 14 ml) 6 Registrare i risultati sul modulo di monitoraggio del laboratorio. 7 Riposizionare i tubi di scarico nel contenitore per gli scarti. 8 Selezionare Next (Avanti). Si è pronti per caricare la cella a flusso con cluster. Caricamento e priming dei reagenti Guida del sistema HiSeq X 31

40 Esecuzione di una corsa di sequenziamento Caricamento della cella a flusso per il sequenziamento Il caricamento della cella a flusso con cluster per il sequenziamento include la rimozione della cella a flusso usata per il priming, la pulizia del vano portacella, il caricamento della cella a flusso sullo strumento e la conferma del flusso corretto. Rimozione di una cella a flusso usata 1 Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 1 per sbloccare i collettori. Figura 11 Leva della cella a flusso in posizione 1 2 Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 0 per sbloccare la tenuta del vuoto e rilasciare la cella a flusso. Figura 12 Leva della cella a flusso in posizione 0 3 Sollevare la cella a flusso usata dal vano portacella. Pulizia del vano portacella 1 Indossare un nuovo paio di guanti in lattice privi di polvere. 2 Usando un panno che non lascia residui inumidito con acqua da laboratorio, pulire con attenzione la superficie del vano portacella. 3 Usando una salvietta imbevuta di alcol o un panno che non lascia residui, imbevuto di etanolo o isopropanolo, pulire la superficie del vano portacella. 32 N. codice Rev. E ITA

41 Figura 13 Ispezione dei fori della pompa a vuoto 4 Ispezionare il vano portacella per assicurarsi che sia privo di fibre e che i fori della pompa a vuoto siano privi di ostruzioni. Caricamento della cella a flusso per il sequenziamento 1 Collocare la cella a flusso sul vano portacella con le porte di ingresso e uscita rivolte verso il basso e il codice a barre a destra. Assicurarsi che la freccia sul bordo sinistro della cella a flusso punti verso lo strumento. 2 Far scorrere delicatamente la cella a flusso verso i perni guida superiore e destro fino a quando non si blocca. Figura 14 A B Cella a flusso posizionata sui perni guida superiore e destro Perno guida superiore Perni guida destri Caricamento della cella a flusso per il sequenziamento NOTA Rimuovere la mano dalla cella a flusso prima di attivare l'interruttore della pompa a vuoto per prevenire possibili perdite di allineamento nel tempo. 3 Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 1 per attivare la pompa a vuoto e assicurare la cella a flusso in posizione. Quando la leva della cella a flusso lampeggia verde, la pompa a vuoto è posizionata correttamente. Se la leva non è verde, vedere Possibili problemi d'impostazione della corsa a pagina 51. Guida del sistema HiSeq X 33

42 Esecuzione di una corsa di sequenziamento Figura 15 Leva della cella a flusso in posizione 1 4 Attendere circa cinque secondi, quindi spostare lentamente la leva della cella a flusso nella posizione 2. Quando la leva della cella a flusso è verde fisso, i collettori sono in posizione e la cella è pronta per l'uso. Figura 16 Leva della cella a flusso in posizione 2 5 Assicurarsi che la casella di spunta Vacuum Engaged (Pompa a vuoto attiva) sia selezionata sulla schermata Load Sequencing Flow Cell (Caricamento cella a flusso per il sequenziamento). Conferma del flusso corretto La verifica del flusso corretto conferma che la cella a flusso e le guarnizioni sono installate correttamente e che il collettore è posizionato correttamente. 1 Selezionare la soluzione 5 dall'elenco a tendina. 2 Immettere i valori seguenti e quindi selezionare Pump (Pompa). Volume (Volume): 250 Aspirate Rate (Velocità di aspirazione): 250 Dispense Rate (Velocità di erogazione): Ispezionare la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie o di perdite vicino ai collettori. Se sono presenti bolle eccessive, verificare la presenza di ostruzioni nelle guarnizioni dei collettori e ripetere il processo usando la soluzione 6 per evitare di esaurire la posizione 5. Ridurre la velocità di aspirazione a 100 e pompare altri 250 µl verso la cella a flusso. 4 Selezionare Next (Avanti). 5 Assicurarsi che la leva della cella a flusso sia verde e chiudere lo sportello dello scomparto della cella a flusso. 34 N. codice Rev. E ITA

43 6 Confermare che le caselle di spunta Vacuum Engaged (Pompa a vuoto attiva) e Door Closed (Sportello chiuso) siano selezionate e poi selezionare Next (Avanti). 7 Selezionare Start (Avvio) per avviare la corsa di sequenziamento. Caricamento della cella a flusso per il sequenziamento Guida del sistema HiSeq X 35

44 Esecuzione di una corsa di sequenziamento Monitoraggio della corsa Monitorare le metriche della corsa, la fluidica e l'imaging sulla schermata di panoramica della corsa. Figura 17 A B C D E F Report sulla prima base Schermata di panoramica della corsa Barra di avanzamento: per monitorare quanti cicli sono stati completati. Immagine della cella a flusso: per monitorare le corsie che sono state sottoposte a imaging. Grafico della fluidica: allargare la sezione della fluidica per monitorare le fasi della chimica. Configurazione della corsa: per rivedere i parametri per la corsa attuale. Grafico dell'analisi: per monitorare i punteggi qualitativi per ciclo. Grafico delle immagini: per monitorare le intensità per ciclo. Viene mostrata solo un'immagine in miniatura per ciascuna striscia sottoposta a scansione. Tutte le altre immagini non vengono visualizzate sull'interfaccia software. Se durante la procedura di impostazione è stata selezionata l'opzione Confirm First Base (Conferma prima base), viene visualizzata automaticamente la finestra di dialogo di conferma della prima base al termine dell'imaging del secondo ciclo. In questa fase la corsa si metterà in pausa. 1 Dalla finestra di dialogo di conferma, rivedere First Base Report (Report sulla prima base). 2 Se i risultati sono soddisfacenti, selezionare Continue (Continua). Sequencing Analysis Viewer (SAV) Il software Sequencing Analysis Viewer mostra le metriche generate durante la corsa di sequenziamento. Le metriche vengono visualizzate sotto forma di grafici, diagrammi e tabelle. Sequencing Analysis Viewer si apre automaticamente quando sono disponibili le metriche della corsa. Selezionare Refresh (Aggiorna) in qualsiasi momento durante la corsa per visualizzare le metriche aggiornate. Per ulteriori informazioni, vedere Guida per l'utente di Sequencing Analysis Viewer, (n. codice ). 36 N. codice Rev. E ITA

45 Rimozione e pesatura dei reagenti 1 Aprire lo sportello dello scomparto reagenti. 2 Sollevare i pettini di aspirazione per il rack SBS e il rack dei reagenti PE appropriato procedendo come segue: a Tirare la maniglia del pettine di aspirazione verso l'esterno. b Sollevare la maniglia del pettine di aspirazione mentre si tira verso l'esterno. c Rilasciare la maniglia nell'alloggiamento nella parte superiore della scanalatura. Assicurarsi che la maniglia sia posizionata correttamente nell'alloggiamento. 3 Far scorrere il rack reagenti fuori dallo scomparto reagenti usando la maniglia del rack. 4 Rimuovere ogni flacone dal rack reagenti e registrare il peso sul modulo di monitoraggio del laboratorio. AVVERTENZA Questo set di reagenti contiene formammide, una ammide alifatica che è una probabile tossina riproduttiva. L'inalazione, l'ingestione, il contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali. Indossare equipaggiamento protettivo, inclusi protezione per gli occhi, guanti e indumento da laboratorio. Manipolare i reagenti usati come rifiuti chimici e smaltirli in base agli standard di sicurezza governativi locali. Per ulteriori informazioni su ambiente, salute e sicurezza, vedere le SDS per questo kit, all'indirizzo support.illumina.com/sds.html. Rimozione e pesatura dei reagenti Guida del sistema HiSeq X 37

46 Esecuzione di una corsa di sequenziamento Esecuzione di un lavaggio con acqua Un lavaggio con acqua è richiesto dopo ciascuna corsa di sequenziamento, con l'opzione di eseguire un lavaggio di manutenzione al posto di un lavaggio con acqua (raccomandato). Per istruzioni sul lavaggio di manutenzione, vedere Esecuzione di un lavaggio di manutenzione a pagina 43. Se lo strumento è rimasto inattivo per uno o più giorni, eseguire un lavaggio con acqua prima di avviare una nuova corsa di sequenziamento. 1 Dalla schermata Welcome (Benvenuto), selezionare Wash Water (Lavaggio Acqua). 2 Selezionare Yes (Sì) se si sta eseguendo il lavaggio delle posizioni di reagenti PE. In caso contrario, selezionare No (No) per lavare solo le posizioni dei reagenti SBS. 3 Selezionare Next (Avanti). 4 Caricare lo strumento con acqua da laboratorio come segue. a Riempire otto flaconi SBS con 250 ml di acqua da laboratorio. b Riempire dieci provette PE con 12 ml di acqua da laboratorio. 5 Accertarsi che sia caricata una cella a flusso usata. Se necessario, caricare una cella a flusso usata. Selezionare Next (Avanti). 6 Eseguire una verifica della fluidica: a Selezionare la soluzione 2 dall'elenco a tendina. Accettare i valori predefiniti della pompa. b Selezionare Pump (Pompa). c Ispezionare la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie e di perdite vicino ai collettori. 7 Rimuovere i tubi di scarico per la cella a flusso appropriata dal contenitore per gli scarti. 8 Fissare assieme i tubi di scarico con parafilm. Assicurarsi che le estremità siano allo stesso livello. 9 Collocare le estremità dei tubi legati a un flacone da 250 ml. 10 Selezionare Next (Avanti) per avviare il lavaggio con acqua. Posizioni Otto posizioni SBS Otto posizioni SBS e dieci posizioni paired-end Tempo di esecuzione approssimativo 20 minuti 60 minuti 11 Al termine del lavaggio, misurare il volume erogato e registrarlo sul modulo di monitoraggio del laboratorio. Posizioni Volume totale erogato Otto posizioni SBS 32 ml 4 ml Otto posizioni SBS e dieci posizioni paired-end 72 ml 9 ml 12 Liberare i tubi di scarico e riposizionarli nel flacone degli scarti. Volume erogato per corsia 38 N. codice Rev. E ITA

47 Esecuzione di una formattazione veloce dell'unità di output Al termine del trasferimento dei dati, eseguire una formattazione veloce dell'unità di output (O:\). Una formattazione veloce libera l'unità per una corsa successiva senza rimuovere importanti file di sistema o di manutenzione dello strumento. Prima di poter avviare una corsa, è richiesto un minimo di 2 TB per una corsa con doppia cella a flusso. Se durante la corsa lo spazio su disco scende sotto la soglia di sicurezza, il software mette in pausa la corsa e pone la cella a flusso in uno stato sicuro. Dopo aver reso disponibile spazio su disco, la corsa riprende automaticamente. NOTA I registri di manutenzione dello strumento sono archiviati sull'unità C:\. Quindi, è sicuro eseguire una formattazione veloce dell'unità O:\ mentre si esegue un lavaggio dello strumento. 1 Da Windows, aprire Computer per mostrare l'elenco di unità sul computer. 2 Fare clic con il tasto destro del mouse sull'unità O:\ e selezionare Formatta. 3 Dalla finestra di dialogo Formatta, selezionare la casella di spunta Formattazione veloce. 4 Selezionare Start (Avvio). Esecuzione di una formattazione veloce dell'unità di output Guida del sistema HiSeq X 39

48 40 N. codice Rev. E ITA

49 Capitolo 5 Manutenzione Manutenzione Introduzione 42 Esecuzione di un lavaggio di manutenzione 43 Porre lo strumento nello stato inattivo (idling) 46 Spegnimento dello strumento 47 Capitolo 5 Guida del sistema HiSeq X 41

50 Manutenzione Introduzione Le procedure di manutenzione comprendono il lavaggio di manutenzione dello strumento ogni dieci giorni. Quando sono passati dieci giorni dall'ultimo lavaggio di manutenzione, il software chiede di eseguire un lavaggio di manutenzione. Dopo una corsa di sequenziamento, un lavaggio di manutenzione rappresenta un'ottima alternativa al lavaggio con acqua. L'esecuzione di lavaggi dello strumento regolari permette di mantenere le prestazioni dello strumento lavando il sistema di fluidica e impedendo l'accumulo dei sali e la contaminazione incrociata di reagenti e librerie. 42 N. codice Rev. E ITA

51 Esecuzione di un lavaggio di manutenzione Eseguire un lavaggio di manutenzione quando indicato dal software ogni dieci giorni, o facoltativamente dopo una corsa. Se la schermata Load Gasket (Caricamento guarnizioni) si apre prima di un lavaggio di manutenzione, sostituire le guarnizioni sulla parte anteriore e posteriore del collettore prima di procedere al lavaggio. Un lavaggio con acqua impiega circa un'ora e mezzo e consiste di un lavaggio del sistema con una soluzione preparata di Tween 20 e ProClin 300. Preparazione della soluzione per il lavaggio di manutenzione Preparare cinque litri di soluzione per il lavaggio di manutenzione da utilizzare con uno strumento. La soluzione può essere conservata fino a 30 giorni a temperatura ambiente e utilizzata fino a tre volte durante questo periodo. NOTA Smaltire la soluzione di lavaggio in base agli standard di sicurezza governativi locali. 1 Preparare 250 ml di Tween 20 10% combinando i volumi seguenti, aggiungendo per prima l'acqua. Acqua da laboratorio (225 ml) Tween 20 (25 ml) 2 Collocare una barra di agitazione in una damigiana da almeno 6 litri. 3 Combinare i volumi seguenti nella damigiana, aggiungendo per prima l'acqua. Acqua da laboratorio (750 ml) Tween 20 10% (250 ml) ProClin 300 (1,5 ml) Con questi volumi si otterrà una soluzione di circa Tween 20 2,5% e ProClin 300 0,15%. 4 Posizionare la damigiana su un agitatore e agitare fino a quando la soluzione è completamente miscelata. 5 Aggiungere alla soluzione 4 litri di acqua da laboratorio. Con questi volumi si otterrà una soluzione di lavaggio di circa Tween 20 0,5% e ProClin 300 0,03%. 6 Continuare ad agitare fino a quando la soluzione è completamente miscelata. 7 Mettere da parte in un contenitore chiuso a temperatura ambiente fino a quando si è pronti a riempire o rabboccare i flaconi e le provette di reagente con la soluzione di lavaggio. Esecuzione di un lavaggio di manutenzione Guida del sistema HiSeq X 43

52 Manutenzione Lavaggio con Tween 20 e ProClin Dalla schermata Welcome (Benvenuto), selezionare Wash Maintenance (Lavaggio Manutenzione). 2 Se la soluzione di lavaggio è stata conservata da una corsa precedente, rabboccare la soluzione conservata e capovolgere per miscelare. Altrimenti, preparare i componenti di lavaggio utilizzando una soluzione fresca nel modo seguente. a Riempire otto flaconi SBS con 250 ml di soluzione per il lavaggio di manutenzione. b Riempire dieci provette PE con 12 ml di soluzione per il lavaggio di manutenzione. c Assegnare a ciascun flacone e provetta una posizione sul rack reagenti e mantenere queste posizioni per ciascun lavaggio successivo. Mantenere le stesse posizioni per impedire di contaminare la soluzione di lavaggio con i reagenti presenti sui pettini di aspirazione. 3 Caricare i flaconi e le provette sullo strumento nelle posizioni del rack reagenti assegnate. 4 Selezionare Next (Avanti). 5 Rimuovere la cella a flusso dal piano portacelle e metterla da parte. 6 Indossare un nuovo paio di guanti in lattice privi di polvere. 7 Applicare una leggera pressione su un lato della guarnizione anteriore fino a quando si solleva l'altro lato. Utilizzare delle pinzette per afferrare e rimuovere la guarnizione. Ripetere per rimuovere la guarnizione posteriore. Figura 18 Rimozione delle guarnizioni dei collettori usate 8 Posizionare una nuova guarnizione in ciascun alloggiamento sul lato anteriore e posteriore del vano portacella. Premere leggermente fino a quando la guarnizione è in posizione. 9 Ricaricare la cella a flusso che era stata rimossa per installare le nuove guarnizioni. 10 Assicurarsi che la casella di controllo Vacuum Engaged (Pompa a vuoto attiva) sia selezionata e selezionare Next (Avanti). 11 Eseguire una verifica della fluidica: a Selezionare la soluzione 2 dall'elenco a tendina. b Accettare i valori predefiniti per la pompa e selezionare Pump (Pompa). c Ispezionare la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie e di perdite vicino ai collettori. Se si osserva una scia costante di bolle, sostituire la guarnizione e ripetere la verifica della fluidica. 44 N. codice Rev. E ITA

53 12 Rimuovere i tubi di scarico per la cella a flusso appropriata dal contenitore per gli scarti. 13 Fissare assieme gli otto tubi di scarico con parafilm. Assicurarsi che i tubi siano allo stesso livello. 14 Collocare le estremità dei tubi legati a un flacone da 250 ml. 15 Selezionare Next (Avanti) per avviare il lavaggio. 16 Al termine della corsa, selezionare Return to Start (Torna all'avvio). 17 Misurare il volume erogato. Posizioni Otto posizioni SBS Dieci posizioni paired-end Tutte le posizioni Volume erogato 80 ml 54 ml 16,75 ml per corsia NOTA Tutti i flaconi e le provette sono riempite del tutto per assicurarsi che i pescanti siano sciacquati. Tuttavia, il volume erogato per ciascuna posizione varia così i flaconi e le provette contengono volumi diversi al termine del lavaggio. 18 Liberare i tubi di scarico e riposizionarli nel contenitore per gli scarti. Esecuzione di un lavaggio di manutenzione Guida del sistema HiSeq X 45

54 Manutenzione Porre lo strumento nello stato inattivo (idling) Usare le istruzioni seguenti per preparare lo strumento e porlo nello stato inattivo fino a 10 giorni. Per periodi più lunghi di 10 giorni, vedere Spegnimento dello strumento a pagina Eseguire un lavaggio di manutenzione per lavare il sistema. Per maggiori informazioni, vedere Esecuzione di un lavaggio di manutenzione a pagina Lasciare la cella a flusso sul piano portacelle con la leva della cella a flusso in posizione 2. Questo lascia i collettori nella posizione sollevata. 3 Caricare 10 ml di acqua da laboratorio in ciascuna posizione del reagente nei rack reagenti. Abbassare i pettini di aspirazione. 4 Prima di utilizzare di nuovo lo strumento, eseguire un lavaggio con acqua. Per maggiori informazioni, vedere Esecuzione di un lavaggio con acqua a pagina N. codice Rev. E ITA

55 Spegnimento dello strumento Spegnere lo strumento solo se si prevede di non utilizzarlo entro i dieci giorni successivi o per un lasso di tempo superiore. Se si prevede di utilizzare lo strumento entro i dieci giorni, successivi, vedere Porre lo strumento nello stato inattivo (idling) a pagina 46. Attenersi alla seguente procedura per porre la fluidica in uno stato di sicurezza e per spegnere il sistema. 1 Eseguire un lavaggio di manutenzione per lavare il sistema. Per maggiori informazioni, vedere Esecuzione di un lavaggio di manutenzione a pagina Rimuovere la cella a flusso dal piano portacelle. 3 Usando una salvietta imbevuta di alcol o un panno che non lascia residui, imbevuto di etanolo o isopropanolo, pulire la superficie del vano portacella. ATTENZIONE Non far sgocciolare l'alcol nei fori della pompa a vuoto o intorno ai collettori. Se necessario, utilizzare un panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle per asciugare il piano. 4 Caricare 10 ml di acqua da laboratorio in ciascuna posizione dei reagenti nei rack reagenti. Abbassare i pettini di aspirazione. 5 Spegnere lo strumento. 6 Per riavviare lo strumento, caricare l'acqua in tutte le posizioni dei reagenti, accendere lo strumento ed eseguire un lavaggio con acqua. Per maggiori informazioni, vedere Esecuzione di un lavaggio con acqua a pagina 38. Spegnimento dello strumento Guida del sistema HiSeq X 47

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57 Appendice A Risoluzione dei problemi Risoluzione dei problemi Introduzione 50 Possibili problemi d'impostazione della corsa 51 Esecuzione di una verifica della fluidica 52 Mettere in pausa o terminare una corsa su HiSeq X 53 Corse scaglionate sulla cella a flusso A e sulla cella a flusso B 55 Possibile reibridazione primer Lettura 1 56 Appendice A Guida del sistema HiSeq X 49

58 Risoluzione dei problemi Introduzione File di registro La presente appendice descrive le possibili soluzioni in caso di problemi durante una corsa di sequenziamento e come eseguire una verifica della fluidica dalla schermata Welcome (Benvenuto) e come scaglionare, mettere in pausa e terminare una corsa. Il file di registro elenca qualsiasi errore verificatosi nel software di controllo. Utilizzare questo file per la risoluzione dei problemi. Dalla schermata Welcome (Benvenuto), selezionare Menu Tools Show Log File (Menu Strumenti Mostra file di registro). 50 N. codice Rev. E ITA

59 Possibili problemi d'impostazione della corsa Problema Possibile causa Intervento Il software non ha eseguito l'inizializzazione. La leva della cella a flusso è arancione. La leva della cella a flusso lampeggia arancione. La leva della cella a flusso lampeggia verde. Erogazione fluido scadente. Il software non è stato in grado di inizializzare i dispositivi hardware interni. La cella a flusso non è collocata correttamente. Si è persa la chiusura a vuoto. I collettori non si sono sollevati. Il vuoto è stato fornito ma non è adeguato. La pressione del vuoto è buona. Bolle potenziali nel sistema. Chiudere il messaggio d'errore e poi lanciare nuovamente il software dello strumento. Se il problema persiste, riavviare il computer dello strumento. Se si riavvia il computer, prima spegnere lo strumento per assicurarsi che il drive DoNotEject sia riconosciuto correttamente. Se il problema persiste dopo il riavvio del computer dello strumento, spegnere lo strumento, attendere almeno 60 secondi e poi riavviare lo strumento. Rimuovere la cella a flusso e ripetere le fasi di pulizia. Verificare che le guarnizioni siano presenti e posizionate correttamente. Riposizionare la cella a flusso. Se i passaggi sopra indicati non risolvono il problema, sostituire le guarnizioni e quindi caricare nuovamente la cella a flusso. Rimuovere la cella a flusso e ripetere le fasi di pulizia. Verificare che le guarnizioni siano presenti e posizionate correttamente. Riposizionare la cella a flusso. Se i passaggi sopra indicati non risolvono il problema, sostituire le guarnizioni e quindi caricare nuovamente la cella a flusso. Spostare la leva della cella a flusso in posizione 2. Riposizionare la cella a flusso e confermare che i fori siano rivolti verso il basso. Osservare se è presente del precipitato bianco attorno alle guarnizioni. Se è presente del precipitato, sostituire le guarnizioni. Prima del lavaggio di manutenzione dello strumento sostituire sempre le guarnizioni. Confermare che i gruppi dei pescanti siano completamente abbassati e che ciascun pescante sia a contatto con i reagenti. Possibili problemi d'impostazione della corsa Guida del sistema HiSeq X 51

60 Risoluzione dei problemi Esecuzione di una verifica della fluidica Il pulsante Check (Verifica) sulla schermata Welcome (Benvenuto) esegue una verifica della fluidica. Utilizzare questa opzione durante l'installazione dello strumento e durante la risoluzione dei problemi della fluidica. 1 Caricare sullo strumento una cella a flusso usata. 2 Caricare otto flaconi SBS con PW1 o con acqua da laboratorio e caricare i flaconi sul corrispondente rack reagenti. Caricare il rack sullo strumento. 3 Selezionare Check (Controllo) sulla schermata Welcome (Benvenuto). 4 Selezionare la soluzione 5 (PB2) dall'elenco a tendina. Se si sta eseguendo una verifica della fluidica con una cella a flusso usata, selezionare la soluzione 2, che è acqua. 5 Inserire i valori predefiniti seguenti: Volume (Volume): 250 Aspirate Rate (Velocità di aspirazione): 250 Dispense Rate (Velocità di erogazione): Selezionare Pump (Pompa). Per mettere in pausa la verifica della fluidica, selezionare Pause (Pausa). 7 Ispezionare la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie e di perdite vicino ai collettori. Se sono presenti bolle eccessive, verificare la presenza di ostruzioni nelle guarnizioni del collettore, ridurre la velocità di aspirazione a 100 e pompare altri 250 µl di acqua nella cella a flusso. 52 N. codice Rev. E ITA

61 Mettere in pausa o terminare una corsa su HiSeq X Le opzioni per mettere in pausa o terminare una corsa su HiSeq X sono diverse per ciascuno strumento HiSeq X. Quando si termina una corsa non viene fornita l'opzione per salvare i dati o riprendere la corsa. Mettere in pausa una corsa Dalla schermata Run Overview (Panoramica corsa) si può mettere in pausa una corsa. Potrebbe essere necessario mettere in pausa una corsa per verificarne i componenti o per impostare una corsa sulla cella a flusso adiacente. Per maggiori informazioni, vedere Corse scaglionate sulla cella a flusso A e sulla cella a flusso B a pagina 55. La messa in pausa temporanea di una corsa permette alla corsa di riprendere senza perdita di dati. RTA v2 riprende automaticamente quando viene ripresa una corsa messa in pausa. Per maggiori informazioni, vedere Real-Time Analysis (RTA) a pagina Dalla schermata Run Overview (Panoramica corsa), selezionare Pause (Pausa). Si apre il menu Pause (Pausa). Figura 19 Opzioni Pausa 2 Selezionare Normal Pause (Pausa normale). 3 Selezionare Yes (Sì) per confermare il comando pausa. Il software conclude il comando corrente e pone la cella a flusso in uno stato sicuro. 4 Selezionare Resume (Riprendi) per riprendere la corsa. Sostituzione dei reagenti durante una corsa Se si è iniziata la corsa con un volume di reagenti solo parziale, utilizzare la funzione Change Reagents (Cambia reagenti) per mettere in pausa la corsa e riempire i reagenti. 1 Dalla schermata Run Overview (Panoramica corsa), selezionare Pause (Pausa). Si apre il menu Pause (Pausa). 2 Selezionare Change Reagents (Cambia reagenti). 3 Selezionare Yes (Sì) per confermare il comando pausa. Il software conclude il comando corrente per la chimica o per l'imaging, pone la cella a flusso in uno stato sicuro e apre la schermata Reagents (Reagenti). 4 Sulla schermata Reagents (Reagenti), inserire i seguenti parametri del reagente: L'ID del kit di reagenti per i nuovi reagenti. Il numero di cicli per i quali si prevede che i reagenti dureranno. NOTA Sulla schermata Change Reagents (Cambia reagenti) la casella di spunta priming è disabilitata. Il priming non è necessario. 5 Selezionare Next (Avanti) per passare al caricamento dei reagenti. Mettere in pausa o terminare una corsa su HiSeq X Guida del sistema HiSeq X 53

62 Risoluzione dei problemi Terminare una corsa Se RTA v2 è stato terminato, il software non riprende l'elaborazione e i dati della corsa non vengono salvati. Non è quindi possibile riprendere una corsa che è stata arrestata. ATTENZIONE Quando si termina una corsa su HiSeq X questo passaggio è definitivo. 1 Per terminare la corsa, selezionare Abort (Annulla). Confermare o annullare il comando. Confermando la scelta, il comando apre la schermata Welcome (Benvenuto). 2 Passare alle procedure post-corsa. NOTA Se una corsa è stata arrestata durante la Lettura 1, è possibile eseguire la reibridazione primer su cbot. Dopo la reibridazione primer, avviare una nuova corsa su HiSeq X per sottoporre a sequenziamento la cella a flusso. 54 N. codice Rev. E ITA

63 Corse scaglionate sulla cella a flusso A e sulla cella a flusso B Quando si eseguono corse scaglionate sulla cella a flusso A e sulla cella a flusso B, viene impostata una nuova corsa e il software automaticamente mette in pausa o riprende la corsa sulla cella a flusso adiacente, se necessario. Il sistema viene messo automaticamente in uno stato sicuro. 1 Impostare una nuova corsa. NOTA Se la corsa adiacente sta completando una fase di imaging, il software mette in pausa la cella a flusso adiacente prima che l'utente possa caricare e sottoporre a priming i reagenti. 2 Dopo aver caricato la nuova cella a flusso di sequenziamento per la nuova corsa, chiudere lo sportello dello scomparto. 3 Selezionare Start (Avvio) per avviare la nuova corsa di sequenziamento. Corse scaglionate sulla cella a flusso A e sulla cella a flusso B Guida del sistema HiSeq X 55

64 Risoluzione dei problemi Possibile reibridazione primer Lettura 1 Se le metriche della corsa per Lettura 1 indicano un numero basso di cluster, intensità basse di cluster o altri problemi, è possibile eseguire una reibridazione primer Lettura 1 per salvare la cella a flusso. La reibridazione primer Lettura 1 viene eseguita su cbot e non danneggia i cluster sulla cella a flusso. L'ibridazione dei primer Lettura 1 su una cella a flusso preconfigurata (patterned) HiSeq X richiede i materiali di consumo Illumina seguenti: } HiSeq X HD cbot Multi-Primer Rehybridization Kit (n. di catalogo GD ) } Collettore HiSeq cbot (n. catalogo SY ) Per maggiori informazioni vedere Reibridazione primer Lettura 1 su una cella a flusso HiSeq X (n. codice ). 56 N. codice Rev. E ITA

65 Appendice B Real-Time Analysis (RTA) Real-Time Analysis (RTA) Introduzione 58 Descrizione generale di RTA v2 59 Flusso di lavoro di Real-Time Analysis 61 File di output del sequenziamento 66 Numerazione delle tile 67 Appendice B Guida del sistema HiSeq X 57

66 Real-Time Analysis (RTA) Introduzione Il software Real-Time Analysis esegue l'analisi delle immagini e l'identificazione delle basi integrate sullo strumento durante la corsa di sequenziamento, il che fa risparmiare tempo durante la successiva analisi dei dati. HiSeq X una nuova implementazione del software Real-Time Analysis (RTA) denominato RTA v2, che include importanti differenze nell'architettura e nelle caratteristiche seguenti: } I file di configurazione, i formati file di output e il flusso di lavoro di elaborazione differiscono dalle implementazioni precedenti del software. } Le impostazioni del file di configurazione utilizzati nelle implementazioni precedenti del software non sono compatibili con RTA v2. } Se RTA v2 è stato terminato, l'elaborazione non viene ripresa e i dati della corsa non vengono salvati. } Non sono calcolate le prestazioni in de-multiplex. Quindi, la scheda Index (Indice) in Sequencing Analysis Viewer (SAV) non viene popolata. 58 N. codice Rev. E ITA

67 Descrizione generale di RTA v2 RTA v2 viene eseguito sul computer dello strumento ed estrae le intensità dalle immagini, esegue l'identificazione delle basi e assegna un punteggio qualitativo all'identificazione delle basi. A differenza delle versioni precedenti del software Real-Time Analysis, RTA v2 e il software di controllo comunicano mediante un'interfaccia HTTP sul Web e condividono file di memoria. Se RTA v2 è stato terminato, RTA v2 non riprende l'elaborazione e i dati della corsa non vengono salvati. Non è quindi possibile riprendere una corsa che è stata arrestata. RTA v2 riprende automaticamente solo se una corsa è stata messa in pausa. Se la connessione di rete viene interrotta, RTA v2 prosegue con l'elaborazione e scrive i dati localmente. Il trasferimento dei dati riprende quando viene ripristinata la connessione. Input per RTA v2 RTA v2 richiede i file di input seguenti: } Le immagini delle tile contenute nella memoria locale del sistema. } RunInfo.xml, che il software di controllo genera automaticamente all'inizio della corsa. Da questo file, RTA v2 legge il nome della corsa, il numero di cicli, se una lettura è indicizzata e il numero di tile sulla cella a flusso. } RTA.exe.config, che è un file di configurazione software in formato XML. RTA v2 riceve i comandi dal software di controllo che comprendono informazioni relative alla posizione del file RunInfo.xml e se è stata specificata una cartella di output opzionale. Descrizione generale di RTA v2 Output per RTA v2 Le immagini per ciascun canale sono passate in memoria a RTA v2 come tile. In base a queste immagini, RTA v2 produce output primari sotto forma di un set di file di identificazione delle basi qualitativamente valutate e di file filtro di punteggi qualitativi. Altri file supportano la generazione di file di output primari. } File di identificazione delle basi: per ciascuna tile analizzata, viene generato un file compresso di identificazione delle basi (*.bcl) per ciascuna tile per ciclo. Questo file contiene l'identificazione delle basi e il punteggio qualitativo associato. } File filtro: ciascuna tile produce informazioni sul filtro che sono incluse in un file filtro (*.filter) per ciascuna tile per l'intera corsa. Questo file specifica se un cluster ha attraversato il filtro. } File posizione cluster: un file posizione cluster (s.locs) contiene le coordinate X,Y per ciascun cluster sulla cella a flusso. I file di output primari sono utilizzati per la successiva analisi dei dati. Utilizzare il software di conversione bcl2fastq per eseguire il de-multiplex e la conversione FASTQ. Per convertire i dati da HiSeq X, utilizzare bcl2fastq v , o versione successiva. Per informazioni sulla versione software corrente e sul download, vedere la pagina di supporto di HiSeq X sul sito Web Illumina. RTA v2 fornisce metriche in tempo reale sulla qualità della corsa archiviate come file InterOp. I file InterOp sono file binari che contengono tile, ciclo e metriche a livello di lettura e sono richiesti per visualizzare le metriche in Sequencing Analysis Viewer. Per visualizzare le metriche generate da RTA v2, utilizzare SAV v1.8.37, o versione successiva. Per maggiori informazioni, vedere File di output del sequenziamento a pagina 66. Guida del sistema HiSeq X 59

68 Real-Time Analysis (RTA) Gestione degli errori di RTA v2 RTA v2 crea file di registro e li scrive nella cartella RTALogs. Gli errori vengono registrati in un file di errori nel formato file *.tsv. I seguenti file di registro e di errori sono trasferiti alla destinazione di output finale al termine dell'elaborazione: } *GlobalLog*.tsv riassume importanti eventi della corsa. } *LaneNLog*.tsv elenca gli eventi di elaborazione per ciascuna corsia. } *Error*.tsv elenca gli errori che si sono verificati durante una corsa. } *WarningLog*.tsv elenca gli avvertimenti che si sono verificati durante una corsa. Trasferimento dei dati Per tutta la durata della corsa, RTA v2 richiede il trasferimento dei dati da RunCopyService, il software che gestisce il trasferimento dei dati alla posizione della cartella di output specificata. Se viene usato BaseSpace, BaseSpace Broker gestisce il trasferimento dei dati a BaseSpace. Se la connessione di rete viene interrotta, RTA v2 prosegue con l'elaborazione e scrive i dati localmente. Il trasferimento dei dati riprende quando viene ripristinata la connessione. NOTA Assicurarsi che la connessione di rete corrisponda ai requisiti minimi per il trasferimento dei dati a BaseSpace. Per maggiori informazioni, vedere la guida all'allestimento del laboratorio e alla preparazione della sede di installazione per la configurazione di HiSeq X in uso. Vedere Risorse addizionali a pagina 3. Una volta completata l'elaborazione, RTA v2 crea un file dei marker denominato RTAComplete.txt. Il trasferimento dei dati è completato dopo la generazione di questo file. Un indicatore di rilevamento nella parte inferiore dello schermo mostra lo stato del trasferimento. Per ulteriori informazioni, vedere Indicatori di attività e di rilevamento a pagina N. codice Rev. E ITA

69 Flusso di lavoro di Real-Time Analysis Il flusso di lavoro Real-Time Analysis comprende i passaggi seguenti. } Generazione della griglia per l'identificazione dei cluster: mappa le posizioni dei cluster. } Registrazione ed estrazione delle intensità: registra la posizione di ciascun cluster sulla cella a flusso preconfigurata (patterned) e determina il valore dell'intensità per ciascun cluster. } Correzione della matrice colore: corregge la visualizzazione contemporanea tra i canali. } Correzione empirica della determinazione delle fasi (phasing): corregge gli effetti della determinazione delle fasi (phasing) e della predeterminazione delle fasi (prephasing). } Identificazione delle basi: determina una identificazione delle basi per ciascun cluster. } Punteggio qualitativo: assegna un punteggio qualitativo per ciascuna identificazione delle basi. Generazione della griglia per l'identificazione dei cluster Il primo passaggio del flusso di lavoro è la generazione della griglia per l'identificazione dei cluster, che definisce la posizione di ciascun cluster in una tile usando le coordinate X e Y. La griglia viene usata come riferimento per i passaggi successivi di registrazione ed estrazione dell'intensità. Grazie all'array sulla cella a flusso preconfigurata (patterned), tutte le posizioni cluster sono predeterminate in base al numero di righe, numero di colonne e distanza tra i nano pozzetti sulla cella a flusso. Per maggiori informazioni, vedere Cella a flusso preconfigurata (patterned) a pagina 10. Le posizioni cluster sono scritte su un file di posizioni cluster (s.locs) per tutta la corsa. Per maggiori informazioni, vedere File di output del sequenziamento a pagina 66. Flusso di lavoro di Real-Time Analysis Registrazione ed estrazione dell'intensità La registrazione e l'estrazione dell'intensità iniziano dopo la generazione della griglia delle posizioni dei cluster. } La registrazione trasforma le posizioni della griglia dei cluster nella posizione sull'immagine in ciascuno dei quattro canali colore. } L'estrazione dell'intensità determina un valore di intensità per ciascun cluster nella griglia per una data immagine. Se la registrazione non riesce per una qualsiasi immagine in un ciclo, non viene generata alcuna identificazione delle basi per quella tile in quel ciclo. Utilizzare Sequencing Analysis Viewer per esaminare le immagini in miniatura e identificare le immagine la cui registrazione non è riuscita. Per maggiori informazioni, vedere File di output del sequenziamento a pagina 66. Guida del sistema HiSeq X 61

70 Real-Time Analysis (RTA) Correzione della matrice colore Dopo la registrazione e l'estrazione dell'intensità, RTA v2 corregge la visualizzazione contemporanea tra i canali. La visualizzazione contemporanea si verifica quando, ad esempio, un cluster mostra qualche intensità nel canale C e qualche intensità anche nel canale A. Usando una matrice colore 4 x 4, il software RTA v2 genera intensità corrette in base alla matrice con ridotta o nessuna visualizzazione contemporanea e bilancia le differenze nell'intensità complessiva tra i canali colore. Correzione empirica della determinazione delle fasi (phasing) Durante la reazione di sequenziamento, ciascun filamento di DNA in un cluster si estende di una base per ciclo. La determinazione delle fasi (phasing) e la predeterminazione delle fasi (prephasing) si verificano quando un filamento fuoriesce dalla fase con il ciclo di incorporazione attuale. } La determinazione delle fasi (phasing) si verifica quando una base rimane indietro. } La predeterminazione delle fasi (prephasing) si verifica quando una base salta in avanti. Figura 20 Determinazione delle fasi (phasing) e predeterminazione delle fasi (prephasing) A B Lettura con una base nella determinazione delle fasi (phasing) Lettura con una base nella predeterminazione delle fasi (prephasing) RTA v2 corregge gli effetti della determinazione delle fasi (phasing) e della predeterminazione delle fasi (prephasing) usando un algoritmo empirico per la correzione della determinazione delle fasi (phasing), che massimizza la qualità dei dati a ciascun ciclo per tutta la corsa. 62 N. codice Rev. E ITA

71 Identificazione delle basi Dopo che le intensità non elaborate sono state corrette in base al colore e corrette in base al calcolo della determinazione delle fasi (phasing) e della predeterminazione delle fasi (prephasing), il canale colore con l'intensità più luminosa rappresenta l'identificazione delle basi per quel cluster in quel ciclo. L'identificazione delle basi su HiSeq X utilizzando RTA v2 inizia dopo il ciclo 3. L'identificazione delle basi determina una base (A, C, G o T) per ciascun cluster di una data tile a un ciclo specifico. Le identificazioni delle basi sono salvate nei file di identificazione delle basi (*.bcl), che sono file binari con 1 byte per identificazione e punteggio qualitativo. Questo file contiene l'identificazione delle basi e il punteggio qualitativo dell'identificazione delle basi. Per eseguire una identificazione delle basi, i cluster devono prima attraversare il filtro Chastity. I cluster che non attraversano il filtro o che non possono essere identificati perché fuori dall'immagine o perché non si è verificata la registrazione dell'immagine sono etichettati come senza identificazione. I cluster "senza identificazione" sono rappresentati da (N). Flusso di lavoro di Real-Time Analysis Guida del sistema HiSeq X 63

72 Real-Time Analysis (RTA) Cluster che attraversano il filtro Durante il primi 25 cicli di Lettura 1, il filtro Chastity rimuove i cluster di bassa qualità dai risultati dell'analisi. I cluster attraversano il filtro se non più di una identificazione delle basi presenta un valore Chastity inferiore a 0,6 durante i primi 25 cicli. Il valore Chastity è definito come il rapporto dell'intensità più luminosa delle basi divisa per la somma dell'intensità più luminosa delle basi e l'intensità più luminosa della seconda base. La percentuale dei cluster che attraversano il filtro è rappresentata nei report dell'analisi come %PF La cella a flusso preconfigurata (patterned) HiSeq X genera una percentuale bassa di cluster che attraversano il filtro in relazione ad altri modelli HiSeq X. La differenza è dovuta alle caratteristiche di un array ordinato di cluster su una cella a flusso preconfigurata (patterned) se confrontata con un array casuale di cluster su una cella a flusso non preconfigurata. } Cluster casuali su una cella a flusso non preconfigurata (patterned): i cluster si generano in un array casuale e sono individuati durante la generazione della griglia. I cluster di bassa qualità sono rimossi dal conteggio dei cluster non elaborati durante la generazione della griglia, questo porta a una percentuale relativamente elevata di cluster che attraversano il filtro. } Array ordinati di cluster su una cella a flusso preconfigurata (patterned): i cluster si generano in un array predefinito di nano pozzetti. I pozzetti vuoti senza cluster e i pozzetti policlonali in cui è presente più di una sequenza sono inclusi nel conteggio dei cluster non elaborati, ma non attraversano il filtro. Quindi, l'array ordinato su una cella a flusso preconfigurata (patterned) fornisce una percentuale relativamente bassa di cluster che attraversano il filtro. Figura 21 Pozzetti vuoti e policlonali, inclusi in Raw Cluster Count (Conteggio cluster non elaborati) Figura 22 Pozzetti con cluster non PF (mostrati in grigio) 64 N. codice Rev. E ITA