Nuove conoscenze sulla patogenesi della sindrome nefrosica da glomerulonefrite a lesioni minime e glomerulosclerosi focale

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1 Giornale Italiano di Nefrologia / Anno 18 n. 1, 2001/pp Nefrologia / Rassegna Nuove conoscenze sulla patogenesi della sindrome nefrosica da glomerulonefrite a lesioni minime e glomerulosclerosi focale R. Coppo Nefrologia, Dialisi e Trapianto, Azienda Ospedaliera Regina Margherita-S.Anna, Torino New insight into the pathogenesis of nephrotic syndrome and focal segmental glomerulosclerosis Following the Shalhoub s hypothesis in 1974, several studies have tried to identify circulating cytokines produced by a modified T lymphocyte clone, able to alter the GBM permselectivity leading to fully developed nephrotic syndrome. Several circulating factors have been implicated, including IL-1, IL-2, IL-8, SIRS, VEGF and the glomerular permeability factor described by Savin, However, none of them is of completely convincing evidence. On the other hand, the last year was rich in very interesting reports concerning a possible role of podocyte melecules expressed on the cell surface or in the cytoskeletal structure, which are likely to play a crucial role not only in congenital or familial nephrotic syndrome, but also in steroid-resistent forms. Old concepts and new hypotheses are discussed looking for an unifying theory. (Giorn It Nefrol 2001; 18: 9-13) KEY WORDS: Minimal change disease, Focal segmental glomerulosclerosis, Nephrotic syndrome pathogenesis, Podocyte, Vascular permeability factors PAROLE CHIAVE: Glomerulonefrite a lesioni minime, Glomerulosclerosi focale e segmentaria, Patogenesi della sindrome nefrosica, Podocita, Fattori di vasopermeabilità Epidemiologia e clinica La glomerulonefrite a lesioni minime (GNLM) rappresenta la causa più frequente di sindrome nefrosica nel bambino, con un incidenza stimata intorno 1-3/ nuovi casi e picco intorno ai 2-3 anni di età (1, 2). La frequenza della GNLM nel contesto di un quadro clinico di sindrome nefrosica è dell 80% circa dei casi biopsiati in età pediatrica, contro il 20% dei casi dell adulto, mentre quella della glomerulosclerosi focale e segmentaria (GFSF) è del 10-20% delle sindromi nefrosiche biopsiate sia nel bambino che nell adulto (3, 4). I rapporti fra la GNLM e GSFS sono sempre stati sfumati dal punto di vista clinico tanto che molti collocano la GNLM nell ambito di una forma minore o iniziale di GSFS (5). In particolare la fusione dei pedicelli si ritrova nelle due forme istologiche; nella nefrosi da puromicina sperimentale, è possibile riprodurre la GNLM con iniezione singola e la GSFS con iniezioni multiple. Infine sono segnalati casi, anche se discussi, di passaggio istologico da GNLM a GSFS. Anche la risposta alla terapia non è discriminante: è vero che il 75% delle GNLM sono corticoresistenti, ma lo sono anche il 25% circa delle GSFS (6). Si ritiene attualmente che esistano dei meccanismi patogenetici comuni, anche se probabilmente alcune forme di GSFS ne hanno di peculiari. Più il bambino è piccolo al momento dell esordio, più è probabile che la sua storia sia caratterizzata da frequenti ricadute, però per la quasi totalità dei casi all adolescenza le ricadute si rarefanno e la malattia ha una guarigione clinica completa (1, 6). Questa osservazione è compatibile con l ipotesi di un fattore favorente che necessiti di un tempo di maturazione fisiologico per scomparire e/o sia influenzato positivamente dagli ormoni sessuali. Fattori patogenetici circolanti di origine immunitaria Nella GNLM è di riscontro comune l associazione fra Società Italiana di Nefrologia 9

2 Nuove conoscenze sulla patogenesi della sindrome nefrosica da glomerulonefrite atopia o altre manifestazioni allergiche e lo scatenamento della ricaduta da parte di agenti infettivi banali. Questi elementi clinici hanno da vari decenni suggerito una possibile patogenesi immunologica della GNLM, che si è formalizzata nella famosa ipotesi di Shaloub del 1974 (7). Considerando altre osservazioni interessanti, quali la guarigione clinica in corso di malattie virali come il morbillo, lo scatenamento da parte di punture di api o in corso di vari tumori della serie bianca (m. di Hodgkin, linfomi, timomi, leucemie, ecc), Shaloub ipotizzò che la malattia avesse come momento patogenetico la comparsa di un clone di linfociti T sintetizzanti una citochina tossica per i podociti. Questo clone avrebbe avuto le caratteristiche di malignità nel m. di Hodgkin, mentre poteva considerarsi sovra-regolato e passibile di regressione nella forma comune di GNLM. In effetti molti studi del decennio successivo rivelarono varie anomalie del sistema immunitario e delle popolazioni linfocitarie, alterazione della sintesi di immunoglobuline e del sistema reticolo-endoteliale, immunocomplessi circolanti e alterazioni subcliniche del complemento, senza però arrivare a risultati conclusivi. La ricerca si focalizzò successivamente sul fattore circolante ipotizzato da Shaloub, in grado di modificare la sintesi da parte dei podociti di polianioni di superficie (sialoglicoproteine) della MBG inducendo anche una fusione dei processi pedicillari per perdita di carica elettrica e di forma, con modificazione finale di perdita della permselettività glomerulare. Fra i fattori ipotizzati, attenzione particolare è stata focalizzata su varie interleuchine (IL-1, IL-2, IL-8), su un fattore solubile detto SIRS, sul fattore di vasopermeabilità/crescita endoteliale (VPF/VEGF) (8) e, più recentemente, sul fattore permeabilizzante glomerulare GPF, ipotizzato da Savin (9). Nel siero di pazienti con sindrome nefrosica cortico-resistente, per lo più GSFS, è stato isolato un fattore circolante, assorbibile su proteina A stafilococcica, che, iniettato nell animale da esperimento, induce proteinuria. Nessuno di questi fattori però rende conto, di per sé, della comparsa di sindrome nefrosica e gli studi sulla patogenesi della GNLM non hanno compiuto significativi progressi fino agli ultimi anni. In particolare il 2000 è stato tanto ricco di novità da aprire un campo di ipotesi del tutto nuovo. Proteine strutturali dei podociti I podociti sono cellule post-mitotiche altamente differenziate, capaci di mitosi ma non di divisione cellulare, la cui funzione dipende dalla loro complessa architettura. La differenziazione dei podociti coincide con la progressiva espressione di markers di maturità cellulare, quali il WT-1, i recettori per il C3b, la podocalixina e la sinaptopodina. WT1 Il gene che codifica per WT1 (10) contiene una regione che regola la trascrizione di altri geni, è cioè un gene orchestratore. Fra i geni regolati, per lo più negativamente, sono compresi quelli che codificano fattori di trascrizione, quali i paired box (PAX2 e PAX8) e fattori di crescita o loro recettori, quali il fattore insulinico di crescita (IGF e il suo recettore IGFR), fattore di crescita di derivazione piastrinica (PDGF), fattore di crescita trasformante (TGFβ) e fattore di crescita epiteliale (EGF). Il trascritto WT1 è espresso fortemente durante la vita fetale e persiste nell adulto a livello dei podociti e nell epitelio della capsula di Bowman. È associato al tumore renale di Wilms, da cui deriva la sigla. Il WT1 partecipa all induzione della gemma ureterale, nella differenziazione mesenchimo-epiteliale, nella regolare nefrogenesi e nel mantenimento della funzione podocitaria (10). Mutazioni del gene WT1 sono state identificate in una sindrome nefrosica congenita, la sindrome di Denis- Drash, variante della sclerosi mesangiale diffusa (11). Le mutazioni rilevate delezioni, inserzioni, mutazioni nonsense e missense conducono alla sintesi di proteina WT1 troncata a vari livelli, con incapacità di legarsi alle consensus sequences del DNA che vengono da essa regolate. La perdita di regolazione negativa del WT1 conduce ad una iperespressione del prodotto del gene PAX2 sui podociti, normalmente non rilevabile. L osservazione di una gravissima sindrome nefrosica nei topi transgenici con iperespressione del gene PAX2 suggerisce l ipotesi di questo gene a livello dei podociti possa essere responsabile della sindrome nefrosica rilevata nella sindrome di Denis- Drash. Analogamente, è stata rilevata una ridotta espressione di WT1 con aumento di espressione di PAX2 anche in alcuni casi di sindrome nefrosica da sclerosi mesangiale diffusa isolata (11). Nefrina La sindrome nefrosica di tipo finnico è una malattia autosomica recessiva con incidenza 1/8000 nati in Finlandia, rarissima in area mediterranea. Dal punto di vista istologico non ha lesioni specifiche all esordio, a parte un modesto allargamento mesangiale. Fra i meccanismi patogenetici di questa sindrome nefrosica congenita, venne ipotizzato in passato un errore della composizione biochimica della membrana basale glomerulare (MBG), con riduzione delle cariche elettriche negative, tuttavia non fu confermata alcuna alterazione quantitativa dei maggiori componenti, quali laminina, collagene IV, fibronectina o glicosaminoglicani. Nel 1998 venne identificato il gene responsabile della sindrome nefrosica congenita di tipo finnico (NPHS1), localizzato nel braccio lungo del chromosoma 19 (q 13.1) (12). Questo gene codifica per una proteina transmembrana che appartiene alla famiglia delle molecole 10

3 Coppo di adesione cellulare, denominata nefrina. La conoscenza di questa proteina, ha permesso un significativo avanzamento nella conoscenza dei meccanismi patogenetici che si esprimono clinicamente nella sindrome nefrosica. La parete di filtrazione glomerulare è costituita da tre strati: l endotelio vascolare fenestrato, la MBG e i podociti, che formano una sorta di ragnatela di processi pedicillari interdigitati strettamente uniti fra loro dal diaframma che ricopre la fessura fra un processo pedicillare e l altro (slit diaphragm). La microscopia immunoelettronica ha identificato la nefrina in questa regione, in una struttura con aspetto a cerniera lampo, di ampiezza nm (13). Poiché la nefrina ha un dominio intracellulare ed uno extra, si ritiene che le porzioni extracellulari di nefrina originate su due processi pedicillari affiancati si interdigitino e stabiliscano interazioni omofiliche permettendo una stretta connessione tra un podocita e l altro. È particolarmente interessante rilevare che altre proteine possono interagire con la nefrina sia sulla superficie dei podociti che nella porzione intracitoplasmatica, verosimilmente modificando variabilmente la funzione del sistema di adesione podocitario. Cd2 ap Si tratta di una proteina contenente gruppi SH3 che ancora ed aggrega i recettori CD2 dei linfociti T al citoscheletro da cui il nome di Cd2 associated protein e che facilita così l adesione dei linfociti T alla cellula presentante l antigene. Sorprendentemente, i topi geneticamente deficienti di Cd2ap presentano, oltre al difetto immune dei linfociti T, anche una grave sindrome nefrosica con fusione dei pedicelli (14). Si è ipotizzato che la Cd2ap ancori la porzione intracitoplasmatica della nefrina al citoscheletro e che così medi l espressione e la fisiologica funzione dello slit diaphragm. α-actinina-4 Topi con delezione del gene che codifica per α-actinina-4 presentano una grave sindrome nefrosica con aspetti di glomerulosclerosi. Il gene che la sintetizza, ACTN4 è sovraregolato in sindromi nefrosiche sperimentali. Nell uomo, mutazioni del gene ACTN4, presente sul cromosoma 19, in particolare quelle interessanti l esone 8, si estrinsecano con un aumentata affinità dell α-actinina-4 per l actina (15). Il quadro istologico è di GSFS. La trasmissione è dominante a penetranza incompleta. Si ritiene attualmente che questa mutazione possa rendere i podociti sensibili all azione di un altro fattore, ancora non identificato. Podocina Il gene NPHS2, identificato dal gruppo di Corinne Antignac nel 2000, è stato associato a forme di sindromi nefrosiche autosomiche recessive resistenti alla terapia steroidea e con rapida progressione verso l insufficienza renale (16). La proteina sintetizzata da questo gene è stata denominata podocina. Si tratta di una proteina costituente della membrana dei podociti, con struttura a forcina di capelli, presentante due estremità transmembrana che terminano nel citoplasma e la parte curva di unione inserita nella membrana del podocita. Nei nematodi la podocina trasferisce gli stimoli meccanici dalla superficie cellulare al citoscheletro. Potrebbe avere un analoga funzione anche nell uomo, collegando proteine di membrana al citoscheletro, ma la reale funzione di questa proteina non è ancora nota. Integrine I podociti prendono contatto con la MBG attraverso molecole di adesione specializzate nell interazione con i componenti della matrice extracellulare e della MB. Si tratta delle integrine, dimeri costituiti da catene di tipo α e β. Sono molecole di transmembrana con una corta porzione intracellulare che prende contatto, attraverso piccole molecole quali talina, vinculina ed actinina, con il citoscheletro, ed una più lunga porzione extracellulare che, ripiegandosi su sé stessa, prende contatto con sequenze aminoacidiche specifiche dei componenti di matrice extracellulare. Attraverso questo sistema non solo è possibile per le cellule epiteliali viscerali ancorarsi saldamente alla MBG, ma ricevere ed inviare messaggi dal e per il comparto intracellulare e l ambiente extracellulare. Le integrine α 3 β 1 ed α v β 3 sono le più rappresentate e mediano l adesione a vitronectina, collagene IV e fibronectina. L iniezione sperimentale di anticorpi anti-integrine determina il distacco dei podociti dalle MBG e la comparsa di proteinuria (17). Topi knock-out per integrine α v β 3 mostrano inizialmente un aumento dei filamenti di actina nella fase di fusione dei podociti, conseguente all adattamento dei podociti per l aumento della pressione intraglomerulare, successivamente compare proteinuria e GSFS. Peraltro è possibile determinare il distacco con una ridistribuzione delle integrine di superficie mediante uno stimolo tossico che agisca direttamente sul citoscheletro, come ipotizzato nel modello da somministrazione di una citochina prodotta da ibriboma di cellule T derivato da un paziente con GNLM (18). Sono state recentemente identificate altre molecole di adesione a funzione simile alle integrine, i destroglicani che si legano a componenti della MBG laminina, agrina, perlecani ed alla actina del citoscheletro per mezzo della utropina. Nelle sindromi nefrosiche umane l espressione delle integrine è normale, mentre quella dei destroglicani risulta deficiente, soprattutto nelle GNLM (19). È interessante che l espressione di queste molecole viene modulata dalla corticoterapia in caso di remissione. 11

4 Nuove conoscenze sulla patogenesi della sindrome nefrosica da glomerulonefrite Sinaptopodina e proteine del citoscheletro Il citoscheletro acquista un particolare rilievo dalle recenti pubblicazioni (20). Il processo pedicillare dell epitelio viscerale della capsula di Bowman contiene un sistema di proteine contrattili, fra cui actina, miosina II, α-actinina-4, talina, vinculina e sinaptopodina. Esso, come abbiamo riferito sopra, è connesso alla MBG per mezzo di integrine, soprattutto α 3 β 1. La connessione fra il citoscheletro e le proteine che costituiscono lo slit diaphragm, nefrina e caderina, può essere mediato da Cd2ap o da altre proteine collegate al citoscheletro (i costituenti della zona occludens ZO1, le catenine a, b, e g, ecc). Il citoscheletro di actina è adatto a trasmettere e integrare differenti segnali originati dall interfaccia matrice-mbg, lo slit diaphragm o la superficie cellulare. È ipotizzabile che un mancato coordinamento di questo complesso sistema comporti una riorganizzazione del citoscheletro di actina con fusione dei processi pedicillari tipici della sindrome nefrosica. La sinaptopodina è associata ai microfilamenti di actina presenti nei processi pedicillari: studi su biopsie renali di bambini con vari tipi istologici di sindrome nefrosica hanno rilevato una significativa riduzione di espressione di sinaptopodina, particolarmente nelle GSFS e nelle sindromi nefrosiche congenite, cioè nelle forme più severe e corticoresistenti, tanto che ne viene proposto il valore di marker prognostico (21). Topi deficienti per sinaptopodina hanno normale espressione di nefrina e di Cd2ap, quindi presentano un sistema di adesione normale, ma il citoscheletro è danneggiato, il podocita non risponde adeguatamente agli stimoli e compare un aumentata espressione di desmina, indice di stress della cellula podocitaria. un ruolo puramente passivo. Una malattia primitiva e limitata al solo podocita pare al momento riferibile principalmente alle sindromi nefrosiche congenite e GSFS familiari. È possibile che nelle più comuni forme isolate un fattore circolante attui il suo effetto permeabilizzante attraverso una modulazione delle proteine costituenti il citoscheletro podocitario o delle proteine di connessione fra il citoscheletro e la MBG o fra i processi pedicillari adiacenti. È al momento tuttavia possibile proporre un ipotesi multifattoriale, che veda in un condizionamento plurigenico un locus minoris resistentiae del podocita. La sovrapposizione di uno stimolo immunologico acquisito o a sua volta congenito subliminare, potrebbe rompere il precario equilibrio prima esistente e rendere evidente una perdita massiva di proteine attraverso il filtro glomerulare. Maturazione del sistema immune e/o del sistema proteine di superficie-citoscheletro dei podociti, durante il passaggio all adolescenza, potrebbe spostare l equilibrio verso un punto di guarigione clinica della GNLM esordita in età pediatrica. Resta infine affascinante l ipotesi, suggerita dallo studio della Cd2ap, di molecole espresse contemporaneamente sui linfociti T e sui podociti che potrebbero rappresentare un facile punto di connessione per l alterazione dei due sistemi fino alla comparsa del quadro clinico di sindrome nefrosica. Nuove ipotesi patogenetiche della GNLM e GSFS Le nuove ricerche sulle molecole di superficie e del citoscheletro dei podociti hanno introdotto un nuovo protagonista nella patogenesi della sindrome nefrosica da GNLM e da GSFS, il podocita stesso, prima relegato ad Indirizzo degli Autori: Dr.ssa Rosanna Coppo Divisione di Nefrologia e Dialisi Ospedale Regina Margherita P.zza Polonia, Torino nefrologia@oirmsantanna.piemonte.it Bibliografia 1. Coppo R. Il trattamento della sindrome nefrosica del bambino. Giorn It Nefrol 1994; 11: Banfi G.Nefropatia a lesioni minime e glomerulosclerosi focale e segmentaria. In: Ferrario F, et al eds. Le glomerulonefriti primitive e secondarie. Milano: Wichtig Editore 2000; Coppo R, Gianoglio B, Porcellini MG, Maringhini S, for the Group of Renal Immunopathology of the Italian Society of Nephrology. Nephrol Dial Transplant 1998: 13: Schena FP. Survey of the Italian Registry of Renal Biopsies. Frequency of the renal disease for 7 consecutive years. Nephrol Dial Transplant 1997: 12: Habib R, Girardin E, Gadnadoux MF, Hinglais N, Levy M, Broyer M. Immunopathological findings in idiopathic nephrosis: clinical significance of glomerular immune deposits. Pediatr Nephrol 1988; 2: Brodel J. Conventional therapy for idiopathic nephrotic syndrome in children. Clin Nephrol 1991; 35 (suppl): S Shaloub RJ. Pathogenesis of lipoid nephrosis: a disease of T 12

5 Coppo cell function. Lancet 1974; 2: Bailey E, Bottomley MJ, Westwell S, et al. Vascular endothelial growth factor mrna expression in minimal change. Membranous and diabetic nephropathy demonstrated by nonisotopic in situ hybridization. J Clin Pathol 1999; 52: Savin VJ, Sharma R, Sharma M. Circulating factor associated with increased glomerular permeability to albumin in recurrent focal segmental glomerulosclerosis. N Engl J Med 1996; 334: Reddy JC, Licht JD. The WT1 Wilm s tumor suppressor gene: How much do we really know? Biochem Biophys Acta 1996; 1287: Jeanpierre C, Denamur E, Cabanis MO, Luce S, Cecille A, Elion J. Identification of costitutional WT1 mutations in patients with isolated diffuse mesangial sclerosis. Am J Hum Genet 1998; 62 : Kestila M, Lenkkeri U, Mannikko M, Lamerdin J. Positionally cloned gene for a novel protein -nephrin- is mutated in congenital nephrotic syndrome. Mol Cell 1998; 1: Ruotsalainen V, Ljungberg P, Wartiovaara J, Lenkkeri U, Kestila M. Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocites. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: Shih NY, Li J, Karpitslii V, et al. Congenital nephrotic syndrome in mice lacking cd2-associated protein. Science 1999; 286: Kaplan JM, Kim SH, North KN, et al. Mutations in ACTN4, encoding alpha-actinin-4, cause familial focal segmental glomerulosclerosis. Nature Genet 2000; 24: Boute N, Gribouval O, Roselli S, et al. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nat Genet 2000; 24: Couser WG. Mediation of immune glomerular injury (editorial Review). J Am Soc Nephrol 1990; 1: Koyoama A, Fujisaki M, Kobayashi M, Igarashi M, Narita M. A glomerular permeability factor produced by human T cell hibridomas. Kidney Int 1991; 40: Regele HM, Fillipovic E, Lamger B, et al. Glomerular expression of dystroglycans is reduced in minimal change nephrosis but not in focal segmental glomerulosclerosis. J Am Soc Nephrol 2000; 11: Sornio S, Mundel P. Getting a foothold in nephrotic syndrome. Nat Genet 2000: 24: Srivastava T, Garola RE, Whiting JM, Alon US. Synaptopodin expression in idiopathic nephrotic syndrome of childhood Kidney Int 2001; 5: Giunto in Redazione il Accettato il