1. Punto isoelettrico (pi) 2. Peso molecolare (Mw)

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1 PROTEOMA E PROTEOMICA Le proteine hanno due valori intrinseci che ne determinano le caratteristiche specifiche: 1. Punto isoelettrico (pi) 2. Peso molecolare (Mw)

2 PRINCIPIO DELL ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE +ve (anodo) ph 3.0 IEF Carica -ve (catodo) ph 10.0 Grande SDS-PAGE Peso molecolare Piccolo +ve (anodo)

3 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PROTEICO Una efficace procedura di preparazione del campione deve includere Solubilizzazione riproducibile di tutte le classi proteiche, incluse quelle idrofobiche Prevenzione dell aggregazione proteica e mantenimento della solubilità durante IEF Prevenzione di modificazioni chimiche ed enzimatiche dovute al processo di estrazione La rimozione di macromolecole che possono interferire Una resa proteica adeguata per la valutazione che potrebbe implicare la rimozione di specie proteiche molto abbondanti

4 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PROTEICO Le proteine devono essere denaturate e solubili Questo processo si ottiene tramite trattamenti specifici con: Urea (denaturante) Tioli (riducenti) Detergenti Inibitori di proteasi

5 UREA L urea è l agente caotropico più utilizzato, ma in casi specifici con problemi di solubilizzazione si può utilizzare la tiourea. Entrambi questi agenti rompono i ponti idrogeno intra e inter molecolari. Normalmente si utilizza urea 8M, ma anche miscele di tiourea 2M e urea 5-8M. DETERGENTI I detergenti vengono aggiunti per rompere interazioni idrofobiche e incrementare la solubilità proteica al relativo punto isolelettrico. I detergenti devono essere non ionici o zwitterionici, quindi SDS non può essere utilizzato. Vengono utilizzati CHAPS, CHAPSO o octilglucoside 1-2%

6 AGENTI RIDUCENTI Per rompere i ponti disolfuro si utilizzano o ditiotreitolo (DTT) o tributil-fosfina (TBP). Una soluzione di DTT 50mM è sufficiente per la maggior parte delle proteine, ma per casi difficili è consigliato l uso di TBP

7 ANFOLITI CARRIER Le proteine tendono a precipitare quando vicine al loro pi, soprattutto in assenza di sali, che in IEF interferirebbero con la focalizzazione. La mancanza di sali può essere sopperita dall aggiunta di anfoliti solubili al campione.

8 COMPOSTI CHE INTERFERISCONO Acidi nucleici Lipidi Polisaccaridi Sali Ove è possibile è preferibile eseguire un frazionamento del campione Proteasi

9 PREFRAZIONAMENTO Estrazione differenziale Frazionamento subcellulare Cromatografia IEF preparativa

10 ELETTROFORESI BI-DIMENSIONALE PRIMA DIMENSIONE Focalizzazione isoelettrica

11 Focalizzazione isoelettrica

12 MIGRAZIONE DELLE PROTEINE IN IEF

13 STRISCE PER IEF (isoelectrofocusing) Utilizzano gradienti immobilizzati Possono avere diverse lunghezze Devono essere reidratate e corse in ambiente oleoso Il gradiente di ph viene creato con set di tamponi derivati dall acrilammide. La struttura generica è CH2=CH-CO-NH-R R= -COOH oppure N(CH3)2

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16 CORSA ELETTROFORETICA Fino a 4 mg di proteine totali per strip Il campione viene comunemente pre-adsorbito sulle strip durante la loro reidratazione, permettendo anche alle HMW proteins di entrare nel gel. Questo processo dura almeno 11 ore, dopodichè si può passare alla focalizzazione Durante la corsa elettroforetica la conduttività del gel cambia dipendentemente dal numero di specie cariche, diminuendo mano a mano che le varie specie si focalizzano

17 ELETTROFORESI BI-DIMENSIONALE SECONDA DIMENSIONE SDS-PAGE

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19 SECONDA DIMENSIONE La transizione dalla prima alla seconda dimensione coinvolge l equilibrazione della striscia focalizzata in tampone contenente SDS, la deposizione di essa sul gel di corsa e l inglobamento in un gel di agarosio.

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22 SDS-PAGE E esattamente uguale all SDS-PAGE monodimensionale. Per avere un quadro generale si utilizza solitamente un gradiente (es. 8-16%). Una volta individuato il PM della regione di interesse, si passa a gel a percentuale uniforme che mostra una maggiore definizione. Nel caso si debbano paragonare due campioni è opportuno utilizzare due gel identici con corsa parallela.

23 COLORAZIONE DELLE PROTEINE Una volta separato il campione in elettroforesi è possibile continuare con un Western blot, nel caso si cerchi qualcosa di specifico, come modificazioni proteiche post-traduzionali. Normalmente si procede alla colorazione del gel.

24 CHE COLORAZIONE EFFETTUARE? La scelta della colorazione dipenderà soprattutto dalla quantità di proteine caricate. Le colorazioni non devono interferire con i processi successivi e, in ordine di sensibilità, sono le seguenti: Blu Coomassie Argento Coloranti fluorescenti

25 CHE COLORAZIONE EFFETTUARE? I gel sono o preparativi o analitici. Se lo scopo del gel è quello di identificare proteine poco abbondanti, si eseguirà un grosso caricamento con una colorazione finale molto sensibile Se la procedura viene utilizzata per ottenere un antigene, le proteine non devono essere fissate al gel, quindi la colorazione con argento verrà esclusa In ogni caso ogni colorazione ha le proprie limitazioni

26 CHE COLORAZIONE EFFETTUARE? La sensibilità raggiungibile con la colorazione è determinata dalla quantità di colorante che si lega alla proteina dalla differenza di colorazione tra il campione e il background del gel (signal-to-noise-ratio) Ogni colorazione interagisce diversamente con le proteine e non esiste una colorazione che sia in grado di colorare tutte le proteine allo stesso modo. Sembra però che tutti i coloranti interagiscano meglio con aminoacidi basici

27 CHE COLORAZIONE EFFETTUARE? Premettendo che sia meglio effettuare colorazioni diverse dello stesso campione, il colorante che sembra riuscire a dare il più ampio spettro di colorazione è il Blu Coomassie colloidale. E possibile effettuare colorazioni successive dello stesso gel (fluorescente, Coomassie e infine argento)

28 CHE COLORAZIONE EFFETTUARE? Sypro Ruby Silver staining

29 2D ELETTROFORESI DELLE PROTEINE DI C. elegans 3 pi 10 kda

30 COLLEGAMENTO A BANCHE DATI

31 COMPARAZIONE CON 2D IN BANCA DATI

32 ANALISI DIFFERENZIALE

33 General detection methods Coomassie Blue Dyes - commonly used - does not interfere with subsequent protein identification - inexpensive - sensitivity well below silver and fluorescent dyes Silver stain - sensitivity times greater than CB - ability to detect 1 ng of protein - silver diammine/silver nitrate - relatively expensive (reagents/waste disposal) - high background Fluorescent Stains and Dyes - accurately determine changes in protein expression - greater sensitivity than silver stain -DIGE -cost

34 Dual Channel Imaging Technique (DIGE) 1) Proteins are extracted from the cells or tissues of interest. 2) The protein extracts are labeled with different fluorescent dyes: Extract 1 Cy5 dye Extract 2 Cy3 dye mix 3) The 2 extracts are mixed and then resolved by 2-D gel electrophoresis.

35 Fluorescence staining H 2 N- CyDye DIGE containing NHS ester active group covalently binds to the lysine residue of a protein via an amide linkage.

36 The DIGE technology platform

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38 E-Cy5 E-Cy3 Excise spots; elute; digest, extract peptides; MS analyze, Protein identification

39 Identification of differently expressed proteins by Dual Channel Imaging Technique (DIGE) IEF (ph 4-7) Dual Channel Imaging Technique SDS PAGE - PSHA_1_1875 PSHA_1_2360 PSHA_1_0871 PSHA_2_0420 PSHA_1_2262 PSHA_1_0849 PSHA_1_0021 PSHA_2_0363 PSHA_2_0259 PSHA_1_0658 PSHA_1_0255 PSHA_2_0474 PSHA_1_0328 PSHA_1_0416 PSHA_1_3009 PSHA_2_0557 PSHA_1_0870 PSHA_1_0119 PSHA_1_0595 PSHA_1_0689 PSHA_1_1740 PSHA_1_2758 PSHA_1_1059 PSHA_1_3038 PSHA_2_0370 PSHA _2_0370 PSHA_1_2400 PSHA_1_3001 PSHA_2_0144 PSHA_1_2145 PSHA_1_0341 PSHA_2_0150 PSHA_1_2771 Green label Proteome A; Red label = Proteome B

40 PROTEOMA E PROTEOMICA "The analysis of the entire PROTEin content expressed by a genome, or by a cell or tissue type. Wasinger VC et al, Electrophoresis 16 (1995) PROTEOMICS is the systematic analysis and documentation of proteins in biological samples with focus on state-related expression of proteins.

41 PROTEOMA E PROTEOMICA L approccio genomico non considera le possibili modificazioni post-traduzionali che tutte le proteine degli organismi superiori posseggono

42 APPROCCIO PROTEOMICO Ricerca proteine in un lisato cellulare o in estratto tissutale la cui espressione differenziale è determinata da fattori come 1. Processi patologici 2. Delezioni o over-espressioni geniche 3. Trattamenti farmacologici 4. Stimolazioni chimiche e fisiche 5. Rimozione di nutrienti o di ossigeno

43 SCOPO DELL APPROCCIO PROTEOMICO Valutazione di marcatori diagnostici in fluidi corporei Studi di farmacologia quali identificazione e/o validazione di nuovi target proteici per trattamenti farmacologici e drug profiling Studi di tossicità Glicosilazioni, fosforilazioni o processamenti proteici Analisi tissutali in situazioni patologiche

44 TECNOLOGIA LEGATA ALLA PROTEOMICA Elettroforesi bidimensionale Rilevazione degli spot proteici Analisi di immagine Excisione degli spot proteici Digestione enzimatica Spettrometria di massa Bioinformatica

45 ANALISI DEL GEL L acquisizione dell immagine dipende dal sistema di colorazione Per colorazioni in luce diretta si possono utilizzare Densitometro Telecamera Per colorazioni in fluorescenza o radioattive Scanner a fluorescenza Phosphoimager Telecamera su transilluminatore

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48 COME IDENTIFICARE NUOVI SPOT? Classica degradazione di Edman Rimozione chimica di un residuo aminoacidico alla volta e analisi dello stesso. Metodo lento che necessita di grosse quantità proteiche Spettrometria di massa Fingerprint proteico e sequenza ex novo. Metodo veloce che necessita di piccole quantità proteiche

49 SPETTROMETRIA DI MASSA E una metodica che Misura accuratamente la massa proteica Attraverso sequenze peptidiche identifica proteine note e sequenzia proteine ignote Identifica modificazioni posttraduzionali

50 EXCISIONE DEGLI SPOT PROTEICI

51 DIGESTIONE PROTEICA Excisione dello spot da gel Digestione con proteasi (tripsina) per una notte Recupero del surnatante e estrazione dei peptidi da gel con acetonitrile Evaporazione del solvente e risospensione in opportuna matrice

52 PEPTIDE MASS FINGERPRINT La tripsina digerisce la sequenza proteica dopo un residuo di lisina (K) e di arginina (R). Il peptide YAEKGLQQPVRAYMESEKSEEIDLPK verrà quindi digerito in corrispondenza delle frecce I 4 peptidi derivati hanno una massa ben definita: YAEK GLQQPVR AYMESEK SEEIDLPK Queste 4 masse definiscono esattamente il peptide della sequenza precedente

53 COME RILEVARE I PEPTIDI? Dopo la digestione il campione deve essere ionizzato tramite: Protonazione: M + H + = MH + Cationizzazione: M + Cat + = MCat + Deprotonazione: MH = M - + H + Rilascio di elettroni: M = M + + e - Cattura di elettroni: M + e - = M -

54 COME RILEVARE I PEPTIDI? Dopo la ionizzazione il campione viene fatto volare in condizioni opportune. Applicando lo stesso impulso a tutti i peptidi ionizzati, questi percorreranno uno stesso tratto con un tempo relativo alla loro massa. Questo tempo viene definito tempo di volo (Tof)

55 SPETTROMETRIA DI MASSA generazione di ioni in fase gassosa: EI - Electron impact Ionisation (1919 A.J. Dempster) CI - Chemical Ionisation FAB - Fast Atom Bombardment (1981 M. Barber) MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (1988, K. Tanaka et al.) ESI - ElectroSpray Ionisation (1985 J. Fenn)

56 SPETTROMETRIA DI MASSA EI - Electron impact Ionisation E la modalita piu classica. E una ionizzazione hard. Il campione deve essere in stato di vapore. Adatto per composti piccoli (< 800 Da), volatili, termicamente stabili. Interfaccia con GC, anche HPLC.

57 SPETTROMETRIA DI MASSA FAB - Fast Atom Bombardment Il campione viene prima dissolto in una matrice liquida (es. glicerolo). La superficie liquida viene bombardata da un fascio di atomi ad alta energia cinetica (xenon o argon). Le molecole di campione vengono cosi spruzzate via dalla superficie, entrano nella fase gassosa, e vengono ionizzate, per protonazione o deprotonazione. L introduzione di questa tecnica nei primi anni 80 ha rivoluzionato la spettrometria di massa, aprendola alla biologia e alla medicina. Adatto ad es. per peptidi, piccole proteine, altri biopolimeri (fino a 5000). Ionizzazione soft. Quantita minima circa 20 picomoli.

58 SPETTROMETRIA DI MASSA MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Matrice cristallina (anziche liquida). Fascio di fotoni (anziche di atomi). Adatto per composti simili a quelli analizzabili con FAB, ma apiu altasensibilita ( volte meglio) e con molti meno limiti nelle dimensioni dell analita: pesi molecolari fino a 300 kd.

59 SPETTROMETRIA DI MASSA ESI ElectroSpray Ionisation Il potenziale applicato alla fine dell ago e sufficientemente alto da nebulizzare la soluzione in una miriade di goccioline cariche, contenenti il campione.

60 ESI ElectroSpray Ionisation Quando il solvente evapora, la concentrazione di carica alla superficie della gocciolina aumenta fino a superare la tensione superficiale esplosione coulombica. Si formano ioni dell analita privi di solvente. Le cariche sono statisticamente distribuite tra i siti disponibili dell analita, portando spesso alla formazione di ioni a cariche multiple. La tecnica ESI e adatta per composti simili a quelli sottoponibili a MALDI, con sensibilita ed estensione di dimensioni molecolari un po minori. ESI si adatta all interfacciamento con HPLC e elettroforesi capillare

61 SPETTROMETRIA DI MASSA

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64 Nominal Mass Common Modifications and Residues change (Da) -42 ornithine replaces Arg -30 homoserine replaces Met -18 loss of water, (crosslink, dehydration, pyroglu, replaces Glu) - 2 disulfide formation, dehydroalanine replaces Ala - 1 amide group replaces acid 1 acid group replaces amide, citrulline replaces Arg 14 methylene group (methylation, homolog, etc) 16 oxygen atom (hydroxylation, Met sulfoxide formation, etc.) 28 formyl, 2 methyl groups, ethyl 32 addition of 2 oxygen atoms (dihydroxyl addition) 35 & 37 chlorine atom 42 acetyl, trimethyl group 44 carboxyl addition 56 t-butyl 64 + isotopes selenocysteine replaces serine 74 glyceryl group 78 & 80 bromine atom 80 phosphoryl, sulfonyl groups 126 iodine atom 132 pentosyl 176 glucuronosyl 210 myristoyl 226 biotinyl 229 pyridoxyl 454 coenzyme A 541 ADP-ribosyl 617 heme 784 FAD Modificazioni post-trasduzionali di proteine

65 TECNICHE MS E POTENZIALITA

66 MALDI-Tof