Parassitologia. For Newbies

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1 Parassitologia For Newbies 1

2 PREMESSA Nei campioni fecali si ricercano: PROTOZOI ELMINTI 2

3 RICERCA DI ELMINTI Le forme di elminti che si ritrovano in genere sono le larve e le uova, sebbene si possano ritrovare anche vermi adulti o parti di essi. Gli elminti sono di solito visibili ad occhio nudo, mentre le larve e le uova solo al microscopio. 3

4 RACCOLTA DEI CAMPIONI FECALI Nei programmi epidemiologici è in genere sufficiente analizzare un solo campione, mentre nella pratica diagnostica i è consigliabile ilibil esaminare almeno tre campioni fecali raccolti a giorni alterni. E importante fornire al paziente istruzioni dettagliate su come raccogliere le feci. 4

5 RACCOLTA DEI CAMPIONI FECALI Le feci vanno raccolte su una superficie asciutta tipo una padella da letto, un sacchetto di plastica posto in un cestino, un foglio di carta posto al di sotto del copri water. Le feci non devono essere contaminate con urine né essere recuperate dal vaso della toeletta. 5

6 RACCOLTA DEI CAMPIONI FECALI Trasferire in un contenitore pulito, possibilmente di plastica, una porzione o di feci della grandezza ga aminima di una noce, chiudere e il contenitore ed inviarlo al laboratorio nel più breve tempo possibile dopo aver etichettato con nome e cognome, data ed ora della raccolta. In caso contrario porre il campione in flaconi contenenti sostanze conservanti (formalina al 10%, SAF, MIF, PVA) 6

7 RACCOLTA DEI CAMPIONI FECALI Il campione deve essere accompagnato da una scheda che riporti informazioni cliniche ed anamnesi soprattutto riguardanti viaggi effettuati dal paziente. 7

8 RACCOLTA DEI CAMPIONI FECALI Il campione va esaminato appena giunto in laboratorio. Se ciò non fosse possibile occorre conservarlo in frigorifero 8

9 Appena i campioni giungono in laboratorio, esaminarli e annotarne la consistenza Verificare anche la presenza di muco e sangue. La consistenza può essere una guida nella ricerca di protozoi: Nelle feci acquose e diarroiche, più raramente in quelle soffici, i è possibile trovare dei ditrofozoiti Mentre nelle feci formate e soffici si possono osservare le forme cistiche. 9

10 Se si ricevono contemporaneamente parecchi campioni, si esaminano prima quelli contenenti muco e sangue, quindi quelli acquosi e diarroici, lasciando per ultimi i campioni soffici e formati Importante Nel caso di contenitori con conservanti tutte le notizie devono essere riportate sul contenitore stesso e/o sul foglio della richiesta 10

11 Esame microscopico diretto L esame diretto è la tecnica più semplice per l esame delle feci e dovrebbe essere eseguita in tutti i laboratori. Per tale esame si possono usare diversi tipi di preparati, come per es. La soluzione di Dobell (Lugol 1:5) Soluzione fisiologica Soluzione di blu di metilene tamponata 11

12 Esame microscopico diretto Il preparato con soluzione di Dobell è utilizzato per colorare i vacuoli di glicogeno ed i nuclei delle cisti eventualmente presenti. Utile per la diagnosi di specie di cisti 12

13 Esame microscopico diretto (fisiologica e Dobell) Identificare un vetrino portaoggetto con nome e cognome del paziente Porre unagoccia di soluzione fisiologica alcentro della metà sinistra del vetrino ed una goccia della soluzione di Dobell al centro della metà destra In presenza di trofozoiti amebici usare fisiologica a 37 C Prelevare con un bastoncino una piccola porzione di feci e stemperarla in soluzione fisiologica 13

14 Esame microscopico diretto (fisiologica e Dobell) FECI FORMATE Prelevare il campione includendo porzioni interne ed esterne delle feci FECI CON MUCO Se è presente muco, si prepara un altro vetrino con una goccia di fisiologica e vi si stempera una piccola porzionedi muco. I trofozoiti amebici si evidenziano più facilmente nel muco. FECI DIARROICHE O ACQUOSE Prelevare una qualunque parte di feci e stemperarla in fisiologica 14

15 Esame microscopico diretto (Fisiologica e Dobell) Nello stesso modo prelevare un campione di feci e stemperarla in una goccia di soluzione di Dobell Coprire ciascuna goccia con un coprioggetto. La densità del preparato deve permettere la lettura di carattere di stampa attraverso di esso 15

16 Esame microscopico diretto (Blu di metilene) Procedere come per il metodo precedente versando sul vetrino una goccia grossa di blu di metilene. Attendere 5 10 minuti prima di esaminare il vetrino per permettere al colorante di penetrare nei trofozoiti. Osservare entro 30 minuti per evitare sovracolorazioni 16

17 Lettura dei preparati Utilizzare un obiettivo 10X ed una intensità luminosa tale da osservare distinti i detriti fecali Iniziare l osservazione da un angolo del vetrino, focheggiando in continuo In presenza di microorganismi cambiare obiettivo ed aumentare la luminosità per vederne la morfologia 17

18 Esame dopo concentrazione Quando il numero dei parassiti è basso, per evitare falsi negativi, bisogna ricorrere alla concentrazione La tecnica raccomandata è quella formalina etere (o etil acetato) Esistono varianti (Ritchie, Ridley e modificazioni) 18

19 Concentrazione Formalina Etere Stemperare 2 3 gr di feci in 10 ml di formalina al 10% Disporre in un imbuto un doppio strato di garza inumidita co H 2 O distillata. Porlo su una provetta da 15 ml Filtrare 7 ml di sospensione fecale Aggiungere nella provetta del filtrato 3 ml di etere o etil acetato 19

20 Concentrazione Formalina Etere Tappare ed agitare su vortex per 15 secondi almeno Allentare i tappi e centrifugare a g per 2 minuti (2000 rpm) Si formano 4 strati: solvente, detriti fecali, formalina, sedimento con i parassiti. Con una palettina di legno staccare dalle pareti della provetta i detriti 20

21 Concentrazione Formalina Etere Rovesciare la provetta eliminando il surnatante Se si utilizza l etil acetato pulire bene le pareti con tampone di cotone Aggiungere 2 3 gocce di fisiologica al sedimento Su una metà del vetrino porre una goccia di sedimento, sull altra una goccia piccola di sedimento ed una goccia di sol di Dobell Coprire con un coprioggettoe leggere al microscopio i 21

22 Tecniche supplementari COLORAZIONI PERMANENTI Non si usano nella routine. Il loro utilizzo è indicato per identificare trofozoiti e cisti di protozoi in caso di dubbio e allestire preparati didattici Le colorazioni maggiormente utilizzate sono TRICROMICA di Wheatley con ematossilina ferrica 22

23 Diafanizzazione Kato Katz Questo metodo è molto efficace per la ricerca di uova di elminti in quanto permette di esaminare una quantità di materiale 25 volte maggiore rispetto all esame a fresco ma non consente di evidenziare larve di elminti e cisti di protozoi. Sono necessarie feci fresche. Quelle in formalina non diafanizzano. 23

24 Conteggio delle uova secondo Stoll Questa tecnica di conteggio è indicata in caso di forte infestazione (1000 uova/gr) Va eseguito solo su feci formate 24

25 Test di Graham o scotch test La femmina gravida di Enterobius vermicularis, durante le ore notturne, migra fino all apertura anale dell ospite, dove depone le uova che aderiscono alla mucosa ed alla pelle. Queste uova non vengono evidenziate con le tecniche normali, ma vanno cercate direttamente sulla cute perianale. Il prelievo va fatto al mattino prima che il paziente defechi e/o si lavi 25

26 Colorazioni TRICROMICA La colorazione tricromica è raccomandata per colorare in maniera permanente gli strisci fecali, perché evidenzia le caratteristiche nucleari e citoplasmatiche dei parassiti. 26

27 Colorazioni LUGOL La colorazione di Lugolè indicata per l esame lesame microscopico a fresco dei parassiti. Colora soprattutto i vacuoli di glicogeno ed i nuclei delle cisti. 27

28 Colorazioni ISOSPORA E CRYPTOSPORIDIUM Per la colorazione dicryptosporidium e Isospora Serve anche per la determinazione di Micobatteri e Nocardia. 28

29 Colorazioni CRYPTOSPORIDIUM Per la colorazione di Cryptosporidium 29

30 Colorazioni MICROSPORIDIUM Per la colorazione delle spore protozoarie di Microsporidium 30

31 Colorazioni CYCLOSPORA Per la colorazione di Cyclospore. Va abbinato ad un fluido in cui vanno immersi i vetrini 31

32 Colorazioni PNEUMOCYSTIS Per la colorazione rapida delle oocisti di Pneumocystis carinii e di funghida tessuti ed aspirati bronchiali, BAL (lavaggio broncoalveolare) 32

33 Colorazioni PNEUMOCYSTIS Per la colorazione in fluorescenza delle oocisti di Pneumocystis carinii e di funghi da tessuti ed aspirati bronchiali, BAL (lavaggio broncoalveolare) 33

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