IL CITOFLUORIMETRO. - quantificare e memorizzare contemporaneamente più parametri per ogni cellula che compone la popolazione

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1 IL CITOFLUORIMETRO E uno strumento di laboratorio che permette un analisi veloce ed automatica di popolazioni cellulari in sospensione misurandone le caratteristiche fisiche e/o biochimiche (volume, granulosita, fluorescenza). Consente di: - quantificare e memorizzare contemporaneamente più parametri per ogni cellula che compone la popolazione - analizzare i dati ottenuti anche dopo l acquisizione

2 Basi della citofluorimetria a flusso La popolazione cellulare in sospensione viene spinta all interno di una camera a flusso dove le singole cellule si dispongono in fila e, venendo colpite dalla luce di un raggio laser, riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza. Si generano così dei segnali che vengono raccolti e trasformati in segnali digitali e inviati ad un computer.

3 APPLICAZIONI Determinazione dei marcatori di differenziamento cellulare, di superficie, intracitoplasmatici e intranucleari Valutazione del contenuto cellulare di DNA Discriminazione tra cellule vive, cellule apoptotiche e necrotiche Predisposizione per la separazione cellulare

4 VANTAGGI dell ANALISI citofluorimetrica : multiparametricità possibilità di mettere in relazione più caratteristiche della stessa cellula analisi di grandi quantità di cellule riproducibilità ed affidabilità statistica delle acquisizioni grande sensibilità rapidità di analisi possibilità di ulteriori analisi a posteriori ( DIVA, CELL QUEST, FLOW JO)

5 FACScalibur

6 FACScanto

7 Il citofluorimetro è costituito da quattro elementi: 1. un sistema fluidico per il trasporto del campione nella cella di analisi 2. un sistema di eccitazione che può essere costituito da una o più sorgenti luminose. 3. un sistema ottico elettronico che raccoglie ed elabora i segnali, composto da lenti, specchi e filtri che inviano i segnali ai fotomoltiplicatori che ne permettono l acquisizione sottoforma di dati digitali. 4. un computer che, tramite specifici programmi, permette (il controllo dello strumento) e l analisi dei dati da parte di un operatore mediante una rappresentazione grafica (DIVA, FLOW JO, CELL QUEST).

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9 1. Sistema fluidico per il trasporto del campione nella cella di analisi Passaggio delle cellule in sospensione in fila, attraverso il raggio laser. Analisi di una sospensione di globuli bianchi contente linfociti, monociti e granulociti granulocito linfocito monocito Il campione viene spinto con pressione verso il punto di misura situato all interno della camera a flusso, in cui avviene l allineamento in singola fila delle cellule. La pressione di spinta consente di contare centinaia di cellule al secondo

10 2. Sistema di eccitazione costituito da una o più sorgenti luminose che generano segnali monocromatici e unidirezionali che intercettano le cellule nella cella di analisi. - I citometri con sorgente a luce laser - I citometri con sorgente a lampada ad arco (più economici perché le lampade a vapori di Mercurio e Xenon non richiedono raffreddamento). I citometri con luce laser, sono usati in immunologia ed ematologia, settori in cui vengono utilizzati maggiormente i fluorocromi. Il laser consente di misurare minime quantità di fluorocromo. Nella maggior parte degli strumenti è impiegato un laser a ioni Argon, di potenza variabile, centrato su una lunghezza di 488nm (blu). Questa lunghezza d onda consente un efficiente misura dei parametri fisici e può eccitare contemporaneamente diversi fluorocromi. Per altre lunghezze d onda si usano laser al Kripton, Elio neon, ecc

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12 3. sistema ottico elettronico che raccoglie ed elabora i segnali, composto da lenti, specchi e filtri ottici che inviano i segnali ai fotomoltiplicatori, che amplificano i segnali e ne permettono l acquisizione sottoforma di dati digitali. Filtri dicroici: i bandpass permettono il passaggio della luce solo ad una certa lunghezza d onda. filtri dicroici Fotomoltiplicatori cella di flusso I fotomoltiplicatori amplificano il segnale luminoso filtrato. Il PMT1 funziona come scatter a 90 gradi, raccoglie la luce rifratta/diffratta ( scatterata ) dalle cellule. 4. Computer con specifici programmi permette l analisi dei dati da parte di un operatore

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14 Scatter Frontale granulocito Laser Sensore (FSC) linfocito monocito Il passaggio delle cellule attraverso il laser, dà origine ad un segnale di difrazione che viene captato dal sensore che raccoglie la luce nel canale dello scatter frontale (forward), e che dà informazioni sul volume cellulare. L intensita del Forward Scatter (FSC) e proporzionale alla dimensione e alla forma delle cellule.

15 Scatter Laterale Laser granulocito linfocito Sensore FSC monocito Sensore per il 90 O SSC Il passaggio delle cellule dà anche origine ad segnale di rifrazione/ riflessione, che viene captato dal sensore che raccoglie la luce dello Scatter Laterale, (a 90 gradi) e dà informazioni sulla densità/granularità (compreso il rapporto nucleo/citoplasma) delle cellule che passano attraverso il laser Anche l intensita del side scatter e proporzionale alla dimensione e alla forma delle cellule

16 Il Forward Scatter è piu sensibile alle proprieta della superficie cellulare e pertanto puo essere usato per distinguere cellule vive da cellule morte Il Side Scatter è piu sensibile agli organuli presenti all interno della cellula e pertanto puo essere usato per distinguere cellule granulate da quelle non-granulate. Proprietà tipiche del Forward e del Side Scatter detriti La combinazione dei due tipi di segnale (FSC ed SSC) permette di ottenere un diagramma di dispersione denominato CITOGRAMMA (a dot plots), nel quale si possono evidenziare differenti popolazioni cellulari, in base alle sole caratteristiche fisiche. monociti Linfociti T,B,NK

17 Striscio di sangue Citogramma Sangue periferico

18 CITOGRAMMA, nel quale si possono evidenziare 3 differenti popolazioni cellulari, in base alle sole caratteristiche fisiche. 90 Degree Scatter (SSC) Forward Scatter (FSC) Esempio di analisi dei leucociti del sangue perriferico e gating elettronico si possono identificare tre popolazioni: - linfociti, - monociti - granulociti. Si può disegnare un gate elettronico che permetterà in seguito l analisi del segnale di fluorescenza proveniente soltanto della popolazione scelta

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22 (Isotiocianato di fluoresceina) (ficoeritrina) (alloficocianina)

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26 Il diagramma ad istogrammi rappresenta graficamente la misura di un singolo parametro. Gli eventi che si accumulano nei vari canali vanno a costruire un diagramma di distribuzione. La statistica si basa sulla impostazione di cursori che definiscono le aree di interesse calcolando gli eventi che cadono al loro interno.

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28 FENOTIPO cellule di coltura primaria da tumore solido gine 2K/97 (Kovarico cellule chiare) M1 M1 M1 M1 % Gated % Total Mean % Gated % Total Mean % Gated % Total Mean % Gated % Total Mean

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30 CD56 PC5 13% 11% 64% CD3 FITC

31 0% 29% 0% 29%

32 Quad Events % Gated UL UR LL LR Quad Events % Gated UL UR LL LR Quad Events % Gated UL UR LL LR

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34 IMPORTANZA DELLA COMPENSAZIONE Sottrarre dal canale del rosso una quota fissa di segnale che deriva dal verde e viceversa

35 Cellule in fase G2 e M hanno una quantità doppia di DNA rispetto a cellule in fase G1. Cellule in fase S hanno una quantità intermedia di DNA perché in fase di replicazione.

36 Per determinare il tipo di morte cellulare (apoptosi o necrosi) si utilizzano Annessina V-FITC e ioduro di propidio (PI) L annessina si lega alla fosfatidilserina (fosfolipide normalmente situato nel lato interno della membrana cellulare). Lo ioduro di propidio (intercalante del DNA), si intercala stechiometricamente quando la membrana cellulare non è integra. Le cellule negative all annessina e allo ioduro di propidio sono cellule vive. Le cellule positive solo all annessina sono cellule in fase precoce di apoptosi poiché presentano la traslocazione del fosfolipide; Le cellule positive all annessina e allo ioduro di propidio sono invece cellule o in fase avanzata di apoptosi o cellule necrotiche.

37 Il Sorting cellulare FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting Piastre cariche elettricamente Cellule singole separate dentro diverse provette FSC Fluorescence detector Il campione viene frammentato in minuscole goccioline, ognuna delle quali contiene una cellula. Le gocce che contengono cellule con caratteristiche rientranti nei parametri prefissati si presentano elettricamente cariche ed indirizzate in appositi raccoglitori da placche di deflessione.

38 Il Sorting cellulare Il campione viene frammentato in minuscole goccioline, ognuna delle quali contiene una cellula. Piastre cariche elettricamente Le gocce che contengono cellule con caratteristiche rientranti nei parametri prefissati si presentano elettricamente cariche ed indirizzate in appositi raccoglitori da placche di deflessione. Cellule singole separate

39 Le NK rappresentano una sottopopolazione di linfociti presenti nel sangue periferico dal 5% al 20%. Sono cellule dell immunità innata in grado di riconoscere ed uccidere cellule tumorali e/o infettate da virus Ogni cellula NK presenta recettori attivatori e inibitori I recettori inibitori riconoscono sulla cellula bersaglio le molecole HLA di classe I self I recettori attivatori riconoscono ligandi ancora non del tutto noti sulla superficie delle cellule bersaglio KIR KAR CD94/NKG2A CD94/NKG2C ILT2 + + CD2 DNAM-1 CD NK + Cell + + LAIR 1 p75/ IRp60 AIRM1 NTB-A 2B4 NKp46 NKp30 NKp44 NKG2D + NKp80

40 LINEE DI RICERCA DEL NOSTRO LABORATORIO -Immunodeficienze primarie (pazienti pediatrici) -Pazienti adulte affette da vari tipi carcinaoma ovarico -Produzione di anticorpi monoclonali Materiale utilizzato: -Sangue periferico -Liquido peritoneale -Pezzo bioptico (tumorale) (incluso in paraffina o congelato) Valutazioni fenotipiche e funzionali delle NK presenti in circolo, nel liquido peritoneale e nei tessuti tumorali. Analisi dei ligandi riconosciuti dalle cellule NK a livello delle cellule tumorali purificate dalla massa tumorale.

41 Isoliamo le cellule mononucelate presenti nel sangue periferico mediante centrifugazione in gradiente di densità e analizziamo il campione linfocitario così separato A livello del PLB troviamo le NK Resting, cioè le NK non attivate. Quando le NK si attivano, sotto stimoli specifici, esprimono con Intensità differente vari recettori di superficie. Possiamo inoltre far crescere in coltura popolazioni policlonali di NK attivate con IL2 sulle quali fare ulteriori analisi dei recettori espressi in superficie.

42 Esistono due diversi subsets di cellule Natural Killer

43 Caratteristiche fenotipiche delle cellule Natural Killer umane. Le cellule natural Killer rappresentano la terza linea linfocitaria del sistema immunitario (dal 5% al 20% dei linfociti nel sangue periferico). Sono presenti nella milza mentre negli organi linfoidi sono scarsamente rappresentate. Si differenziano dai linfociti T e B per l assenza dei convenzionali recettori per l antigene quali le immunoglobuline di membrana o il recettore delle cellule T (TCR), e sono caratterizzate dall espressione sulla loro superficie della molecola CD16 e CD56 CD56 38% CD56 CD3 CD16

44 PBL CTR R4 CD56+/CD3-19% CD56 bright CD56 dim

45 Anti-NKp46 Anti-CD16 Anti-KIRs

46 Anti-HLA classe I