su uno stesso piano, a 0

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1 2 lezione Gli angoli e variano da 180 (+ o -) quando i piani della proteina sono allineati su uno stesso piano, a 0

2 L asse di legame C -C può compiere una rotazione completa da -180 a 0 ( ) Quando gli angoli e si mantengono invariati in un certo segmento della proteina avremo strutture regolari. Solo poche strutture secondarie sono stabili, le principali sono l a-elica e i filamenti. Se non è identificabile una struttura regolare si parla di random coil. (definizione impropria) Infatti la struttura delle proteine non è mai casuale. L' -elica si forma quando un certo numero di coppie successive degli angoli e assumono valori intorno a -60 e -50 rispettivamente. In questo modo i piani peptidici si dispongono in maniera elicoidale intorno ad un asse longitudinale. L' -elica ha un passo di 5.4 Å ed ogni spira dell'elica è costituita da 3.6 residui aminoacidici

3 Lo scheletro carbonioso polipeptico si avvolge intorno ad un asse immaginario longitudinale al centro della spirale. L unità che si ripete è il singolo giro dell elica elica di 5,4 A, ogni giro contiene 3,6 amminoacidi. I gruppi R sporgono in fuori e non partecipano alla formazione dei legami. MODELLO A NASTRO Strutture secondarie: l elica Filamento : conformazione ripetitiva, lo scheletro della proteina si dispone a zig-zag. I filamenti posti uno affianco all altro altro formano un foglietto pieghettato mantenuto da legami a H tra regioni adiacenti o anche molto distanti della stessa catena proteica, o tra filamenti appartenenti a proteine diverse. I guppi R sporgono in direzioni opposte. La direzione dei filamenti adiacenti che contraggono i legami a H possono essere orientati nella stessa direzione (paralleli) o in direzione opposta (antiparalleli) La struttura è identica anche se il periodo della parallela è leggermente più corto 6,5 rispetto a 7 A Le catene possono essere parallele o antiparallele

4 I ripiegamenti sono frequenti nelle proteine. Le proteine globulari presentano circa 1/3 dei residui aa sotto forma di ripiegamenti o anse, dove la catena proteica inverte la sua direzione, i ripiegamenti sono i più diffusi, collegano due estremità di un foglietto antiparallelo, 4 residui con un angolazione di 180 e formazione di un ponte di H tra il Carbonile del I a. e l H lh dell N del IV amminoacido. Gly e Pro sono frequenti in questa conformazione. Gly perché piccola e flessibile Pro perché l imminoacido promuove la forma cis degli aa. coinvolti nel legame In una proteina segmenti peptidici di varia lunghezza si dispongono a formare strutture regolari. Queste strutture sono molto diffuse in quanto stabili, poiché minimizzano le repulsioni steriche e rendono massima la potenzialità di formazione dei legami idrogeno. Le più comuni strutture secondarie sono le - eliche, mentre il secondo elemento strutturale tt principale i presente nelle proteine strutturali è il filamento che spesso si presenta sotto forma di foglietto costituito da due o più filamenti. La disposizione più comune di un - elica è all esterno della proteina con un lato rivolto verso il solvente e l altro laltro verso l interno della proteina stessa. In questo caso l elica si dice amfipatica e la sequenza primaria presenta un alternanza regolare di aminoacidi a carattere idrofilico e idrofobico. Il foglietto è una struttura stabile se costituito da più filamenti e può essere parallelo o antiparallelo a seconda della direzione in cui sono disposti i vari filamenti.

5 Le strutture secondarie sono mantenute da legami idrogeno tra atomi di residui aminoacidici.

6 Le strutture secondarie sono preferite Le strutture secondarie consentono, infatti, l'instaurarsi del maggior numero di legami a H tra i gruppi dello scheletro polipeptidico ed impediscono a quest'ultimo di interagire con l'ambiente acquoso Quattro livelli di struttura determinano la forma di una proteina alfa Beta Primaria: la sequenza lineare degli amino acidi tenuti insieme da legami peptidici. i Secondaria: l organizzazione di parti di una catena polipeptidica (es.: l elica o il foglietto ), tenute da legami a ponte di H. Terziaria: la struttura tridimensionale completa di una catena polipeptidica, con molti tipi di legami e interazioni di cui solo uno covalente il ponte ds. Quaternaria: l associazione di due o più polipeptidi in una struttura complessa multi-subunità

7 Struttura terziaria : relazione a lungo raggio tra amminoacidi anche molto distanti tra di loro, I protagonisti sono i gruppi R che possono appartenere anche a filamenti con diverse strutture secondarie. ORIGINE DELLA STRUTTURA TERZIARIA

8 L'effetto idrofobico è la forza motrice del ripiegamento di una proteina. La struttura terziaria si genera grazie alle interazioni tra i gruppi R. I quali si posizioneranno in risposta a attrazione o repulsione, generando la struttura tt finale. Le strutture terziarie sono sempre compatte La superficie delle proteine è polare mentre l'interno è prevalentemente t apolare

9 L'avvolgimento della catena deve essere tale da esporre sempre al solvente acquoso le catene laterali li idrofile. Catene laterali cariche possono trovarsi all'interno di una proteina solo se la loro carica netta viene neutralizzata. Legami responsabili della struttura terziaria Forze di Wan der Waals 1-2 Kcal/mole Legami a H 3-7Kcal/mole l Legami ionici 5 Kcal/mole Legami S-S 50 Kcal/mole

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11 In alcune catene e polipeptidiche pept e particolarmente lunghe (più di 200 residui) si ritrovano 2 o più zone distinte ( residui) a struttura globulare e compatta, congiunte da segmenti di catena polipeptidica relativamente flessibili. Queste strutture si definiscono DOMINI

12 Se si separa, attraverso un idrolisi controllata, un dominio dal resto della catena polipeptidica di cui fa parte, la molecola corrispondente al domino mostra la capacità di ripiegarsi riassumendo nuovamente la struttura tt e spesso anche la funzione che aveva quando era unita al resto della catena polipeptidica. p p Nel 1974 è stato scoperto uno dei domini più ampiamente distribuito, formato da 70 residui che presenta una super struttura secondaria del tipo (ripiegamento di Rosman). Esso è presente in numerose proteine, enzimatiche, anche a struttura molto diversa, ma che hanno in comune la funzione di legare un coenzima nucleotidico (NAD )

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14 E' stata avanzata l'ipotesi che questo dominio sia quello che resta di una primitiva proteina di epoche precellulari. Tutti gli organismi viventi discendono da pochi progenitori, così la grande maggioranza delle proteine deve essere derivata da un numero ristretto di archetipi I genomi eucariotici sono costruiti in modo da facilitare la riorganizzazione occasionale di sequenze di DNA atte a creare un gene che codifichi per nuove combinazioni di domini proteici

15 La struttura terziaria di una proteina globulare costituita da più domini i é la conseguenza della organizzazione dei vari domini e di tratti di struttura secondaria che li congiungono. Proteine che possiedono piu' siti di legame per ligandi distinti spesso presentano questi siti di legame localizzati su diversi domini. Domini diversi in proteine multifunzionali possono svolgere funzioni diverse. I vari domini presenti su una proteina mostrano talvolta spostamenti reciproci relativi, collegati all'attività della proteina. (Es. Esochinasi)

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17 Nelle cellule le proteine si sintetizzano ad una velocità molto elevata. Le cellule di EColiproducono E.Coli una molecola proteica biologicamente attiva contenente 100 residui aminoacidici in 5 sec a37.

18 COME FANNO LE PROTEINE AD AVVOLGERSI NEL TEMPO DI POCHI SECONDI? Supponiamo che ciascuno dei 2 angoli di torsione, di una proteina con n residui possa assumere 3 conformazioni stabili, le conformazioni possibili per questa proteina saranno 3 2n Se la proteina può esplorare una conformazione ogni secondi Il tempo in sec necessario per esplorare tutte le conformazioni possibili sarà t = 10 n / Per n= 100 t = ( 20 miliardi di anni!)

19 Le proteine non ricercano casualmente la conformazione nativa fra le molte possibili si ripiegano i seguendo vie dirette PICCOLI TRATTI DI STRUTTURA SECONDARIA SERVONO DA MEDIATORI DEL PROCESSO DI AVVOLGIMENTO.

20 LA FORMAZIONE DI CORTI SEGMENTI DI STRUTTURA SECONDARIA È MOLTO VELOCE. Questi piccoli tratti (circa 15 residui) si stabilizzano formando dei complessi (es 2, 2 ) che si chiamano unità di avvolgimento. Intorno a questi centri si stabilizzano poi altri tratti di struttura secondaria

21 L'avvolgimento spontaneo delle catene polipeptidiche nella loro corretta struttura terziaria a è un processo altamente cooperativo, in cui la formazione di piccoli elementi accelera la produzione di altri più grandi

22 Il processo di ripiegamento di una proteina procede da uno stato ad alta energia ed alta entropia ad uno a bassa energia e bassa entropia IL processo di avvolgimento delle proteine può essere accelerato dall enzima proteina disolfuro isomerasi

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24 Le proteine con peso molecolare l superiore a sono OLIGOMERICHE Sono costituite cioè da più catene polipeptidiche p p PROTOMERI O SUBUNITÀ Le proteine oligomeriche presentano un ulteriore livello di organizzazione srutturale la struttura quaternaria LA STRUTTURA QUATERNARIA descrive il modo in cui le singole catene polipeptidiche sono disposte l'una rispetto all'altra.

25 Vantaggi della struttura quaternaria Risparmio di DNA Minimizzazione Mi i i i degli d li errorii casuali li durante la biosintesi proteica Presenza di interazioni allosteriche

26 Per la sintesi i di una catena polpeptidica di 4000 residui aminoacidici è necessario un gene che contenga almeno 4OOO x 3 = basi azotate. Per la sintesi di 2O copie di una stessa catena polipeptidica di 200 residui è sufficiente un gene che contenga solo 200 x 3 = 600 basi La Ferritina ha un peso molecolare di circa daltons. Non è costituita da una sola catena polipeptidica di 400 a.a. ma di 20 catene identiche di circa 200 residui ciascuna.

27 LA GLICERALDEIDE-3-FOSFATO DEIDROGENASI È COSTITUITA DA 4 SUBUNITÀ IDENTICHE DI 330 RESIDUI (330 X 3 = 990 NUCLEOTIDI) SE LA PROTEINA CONSISTESSE IN 1 CATENA DI (330 X 4) 1320 RESIDUI OCCORREREBBE UN GENOMA DI 3 X 1320=3960 NUCLEOTIDI.

28 Generalmente nella formazione delle proteine oligomeriche le subunità difettose sono scartate.

29 LA STRUTTURA QUATERNARIA DI UNA PROTEINA PUÒ SUBIRE MODIFICHE CONFORMA ZIONALI REVERSIBILI AD OPERA DI LIGANDI, DEFINITI EFFETTORI ALLOSTERICI. LE MODIFICHE CONFORMAZIONALI POSSONO ALTERARE LA FUNZIONE DI UNA PROTEINA, REALIZZANDO IN TAL MODO UN IMPORTANTE MECCANISMO DI CONTROLLO DELLA SUA ATTIVITÀ BIOLOGICA.

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31 I residui di cisteina possono formare ponti disolfuro intra o extra catena Classificazione generale delle strutture terziarie Proteine con predominanza di elica Proteine miste Proteine con predominanza di sheets Biofisica

32 La struttura quaternaria delle proteine La struttura quaternaria riguarda proteine costituite da 2 o più catene polipeptidiche o da più domini strutturali (es. proteine regolatrici). E possibile classificare le proteine in due gruppi: Proteine fibrose con catene dispostest in lunghi fasci o foglietti e Proteine globulari con catene polipeptidiche ripiegate a formare forme globulari o sferiche Esempio: la emoglobina Le interazioni tra le subunità consentono grandi variazioni nell attività catalitica Biofisica La struttura terziaria è generata dal ripiegamento e dalla conformazione one della catena polipeptidica. pept La struttura quaternaria è l organizzazione di polipeptidi in un unica unità funzionale che consiste di più di una subunità polipeptidica.

33 Rappresentazioni grafiche differenti della stessa proteina

34 Conformazione, modificazione e degradazione delle proteine Una catena polipeptidica pept appena sintetizzata deve e conformarsi e spesso subire modificazioni chimiche per generare la proteina finale Tutti i polipeptidi con la stessa sequenza amminoacidica idi assumono, in condizioni standard, la stessa conformazione (lo stato nativo), che è la più stabile conformazione one che la molecola può assumere. 3 lezione

35 Per alcune proteine a tale processo partecipano gli chaperoni molecolari che : contribuiscono al corretto avvolgimento di una proteina nascente consentono alle proteine ripiegate in modo non corretto di raggiungere la conformazione nativa Esistono due classi di chaperoni molecolari :la famiglia Hsp70 e le chaperonine (Hps60 o GroEL ed o Hsp10 GroES )

36 Le chaperonine sono costituite da due tipi di proteine HP60 (GroEL) e HP10 (GroES) GroEL 14 subunità identiche (549 aa) disposte in due anelli sovrapposti (7+7) GroES 7 subunità identiche (97aa) formano un anello eptamerico

37 L informazione per il folding della proteina è contenuta nella sequenza Proteine denaturare al calore, con acidi, o chimici perdono la struttura terziaria e secondaria e la funzione biologica. Il processo è reversibile

38 Le chaperonine assistono le proteine nella fase di folding, prevenendo il legame con ligandi inappropriati.

39 Molte malattie sono dovute al difettoso ripiegamento di una proteina Alcune patologie derivano da proteine che non sono in grado di raggiungere la loro struttura funzionale e che tendono a formare grossi aggregati (fibrille o forme amiloidi): Alzheimer, Parkinson, encefalopatia spongiforme, diabete di tipo II. In altri casi mutazioni puntiformi generano proteine che non raggiungono la loro locazione finale o che non sono più in grado di svolgere la loro funzione perché incapaci di legare i loro substrati. La fibrosi cistica è un difetto nella proteina transmembrana che agisce come un canale degli ioni cloro nelle cellule epiteliali (CFTR: 1480 amminoacidi). La mutazione più comune è la delezione di un amminoacido (Phe 508) e la proteina mutata non si avvolge correttamente. Proteine conformate in modo aberrante sono implicate nello sviluppo di patologie Una placca amiloide nella malattia di Alzheimer è un agglomerato di filamenti proteici

40 Comparazione sequenze Hum globina: Bovis: Pig: mvlspadktn vkaawgkvga hageygaeal mvlsaadkgn g vkaawgkvgg gg haaeygaeal vlsaadkan vkaawgkvgg qagahgaeal ermflsfptt ktyfphfdls hgsaqvkghg kkvadaltna vahvddmpna ermflsfptt ktyfphfdls hgsaqvkghg akvaaaltka vehlddlpga ermflgfptt ktyfphfnls hgsdqvkahg kvadaltka vghlddlpga lsalsdlhahl h klrvdpvnfk llshcllvtl aahlpaeftp avhasldkfl lselsdlhah klrvdpvnfk llshsllvtl ashlpsdftp avhasldkfl lsalsdlhah klrvdpvnfk llshcllvtl aahhpddfnp svhasldkfl asvstvltsk yr anvstvltsk yr anvstvltsk yr L omologia delle sequenze suggerisce relazioni i funzionali ed evolutive tra le proteine

41 Degradazione Proteica Regolata Sistema autofagico lisosomiale Sistema Calpaina-CalpastatinaCalpastatina Sistema Ubiquitina-Proteasoma

42 Il sistema proteolitico calpaina/calpastatina è espresso nel citosol di tutte le cellule di mammifero ed è costituito da uno o più membri della famiglia delle calpaine e da una o più forme dell'inibitore calpastatina. La famiglia della calpaine è costituita da circa 15 membri bi che hanno in comune una serie di proprietà catalitiche e regolatrici. Una delle caratteristiche comune a tutte le forme di calpaina è la suddivisione del dominio catalitico in due sottodomini.

43 Modificato da: La Stampa, 7 ottobre 2004 Il premio Nobel per la Chimica 2004 è stato attribuito ai tre ricercatori che più hanno contribuito alla scoperta della«catena di smontaggio» delle proteine: sono l americano Irwin Rose, Università della California, e gli israeliani Aaron Ciechanover e Avram Hershko, entrambi dell Institute of Technology di Haifa. Il ruolo chiave nella demolizione delle proteine è affidato a una molecola relativamente piccola e semplice, un polipeptide chiamato «ubiquitina» (deriva dal latino, significa «sostanza che si trova dappertutto»). Quando una proteina deve essere rottamata - spiegano i vincitori - riceve una specie di bacio mortale. A baciare la proteina da demolire è appunto l ubiquitina, la cui scoperta risale al Si tratta di un bacio molto audace, perché questa molecola si lega alla proteina da distruggere in modo indissolubile con un meccanismo del tipo chiaveserratura molto diffuso nella chimica degli organismi viventi. Ricevuto il bacio letale, la proteina da rottamare finisce nel proteosoma, il tritatutto delle cellule, che in pochissimo tempo la ridurrà in minuti pezzetti, poi eliminati o riciclati.

44 In realtà l operazione è più complessa e richiede l intervento di tre enzimi. Il primo, chiamato E1, attiva la molecola di ubiquitina, e questa reazione richiede energia, liberata da una molecola di ATP. Il secondo enzima, E2, si lega all ubiquitina attivata e il terzo, E3, individua l oggetto da demolire. Il complesso ubiquitina-e2 aderisce strettamente alla proteina ed E3 rilascia la proteina marcata con l ubiquitina. L operazione o e si ripete finché si apre il proteosoma, cioè il tritatutto, tatutto che staccando l ubiquitina (che sarà di nuovo disponibile per il suo lavoro), smonterà la proteina pezzo a pezzo. Il meccanismo è stato chiarito da Rose, Ciechanover ed Hershko nel 1983 con esperimenti su topi transgenici. La demolizione delle proteine è fondamentale quanto la loro costruzione: la pepsina, la tripsina, insieme ad altri enzimi proteolitici ad esempio, spezzettano le proteine complesse del cibo in amminoacidi, passaggio indispensabile per farci assimilare il cibo, che avviene nello stomaco e intestino. L eliminazione delle proteine è essenziale anche nel ciclo riproduttivo delle cellule, nella riparazione degli errori di copiatura del DNA e nelle reazioni del sistema immunitario che ci difendono dalle infezioni e dalle aggressioni dell ambiente. Anche in malattie come il cancro e la fibrosi cistica il ruolo dell ubiquitina è determinante. Errori nella demolizione di proteine alterate sono all origine di molte malattie, ed è per questo motivo che le scoperte compiute dai tre ricercatori premiati con il Nobel possono aprire la strada a nuovi farmaci, in grado di curarle alla radice.

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52 Le proteine comunicano tra di loro e con altre molecole. Questo comportamento è alla base della scelta dei partner e della costruzione dei pathway. La superficie determinata dalle catene laterali degli aa. è alla base di questa proprietà Esempi di modalità di interazione ALLOSTERIA (ad es. nei recettori, nei canali ionici, nella contrazione). MOVIMENTO (ad es. il colpo generato dalla miosina a seguito dell azione ATPasica delle 2 teste, e dell actina che dopo il legame con l ATP polimerizza consentendo alla miosina di attaccarsi) TRASFORMAZIONE (Gli Enzimi che trasformano il ligando Substrato in Prodotto) FOSFORILAZIONI (legame covalente con il ligando PO 4 che modifica la struttura e quindi le interazioni successive)

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