COLTURE DI CELLULE LEUCEMICHE ESPOSTE A CAMPI ELETTROMAGNETICI, VALUTAZIONE DEGLI INDICI DI PROLIFERAZIONE E DEI PROFILI DI ESPRESSIONE GENICA

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1 PROGETTO ISPESL/CNR: COLTURE DI CELLULE LEUCEMICHE ESPOSTE A CAMPI ELETTROMAGNETICI, VALUTAZIONE DEGLI INDICI DI PROLIFERAZIONE E DEI PROFILI DI ESPRESSIONE GENICA - INTRODUZIONE 2 - MATERIALI E METODI:.. 3 Culture cellulari.. 3 Test di vitalita (MTT) 3 Citometria a flusso (FACS analisi). 4 Estrazione DNA da cellule esposte Western Blot RISULTATI. 5 Responsabile progetto: dott. F. Marinelli

2 INTRODUZIONE La possibilita che l esposizione ai campi elettromagnetici a radiofrequenza o microonde abbia un ruolo nello sviluppo di malattie degenerative a lungo termine, incluso il cancro, e stata suggerita da alcuni dati di letteratura scientifica. Recenti studi epidemiologici hanno messo in evidenza che l esposizione a campi elettromagnetici a bassa frequenza (EMFs) induce cambiamenti biologici e potrebbe essere associata all incremento di incidenza del cancro. In particolare e stata stabilita un associazione tra lo sviluppo del cancro nei bambini (leucemia e tumore del cervello) e l esposizione a campi elettromagnetici ad alta e bassa frequenza suggerendo un ruolo eziologico dei campi elettromagnetici nell induzione di effetti sfavorevoli sulla salute (Gurneyl et al.,1996; Ahlbom et al., 2000). Inoltre tali risultati sono stati supportati da lavori in vitro ed in vivo che hanno messo in evidenza come l esposizione ai campi elettromagnetici puo indurre rotture di DNA nelle cellule (Sarkar et al., 1994; Adey, 1997; Malyapa et al., 1998; Phillips et al., 1998), abberrazioni cromosomiche (Maes et al., 1993, 1995), cambiamenti nella proliferazione cellulare (Kwee and Raskmark, 1999, Velizarov et al., 1999) come anche l attivazione di oncogeni (Ivashcuk et al., 1997; Goswami et al., 1999). Nonostante tali esperimenti in vivo e in vitro suggeriscono un possibile ruolo dei campi elettromagnetici nell indurre effetti biologici dannosi, altri studi evidenziano risultati opposti. Mentre alcuni lavori non hanno evidenziato potenziali effetti genotossici dei campi elettromagnetici su culture cellulari e animali (Leonard et al., 1983; Saunders et al., 1988), altri hanno invece riportato effetti positivi (Maes et al., 1993, 1995; Lai and Singh, 1995,,,, 1996; Adey, 1997; Philips et al., 1998). Tali divergenze derivano principalmente dalla non omogeneigita degli esperimenti effettuati. Infatti le condizioni sperimentali spesso differiscono rispetto ai tempi e al tipo di esposizione (campi modulati o non modulati e potenza). In questo studio abbiamo investigato l effetto dei campi elettromagnetici (EMF) ad altafrequenza (900 MHz non modulati) generati da una cella elettromagnetica trasversale (TEM) su cellule leucemiche linfoblastoidi T (CCRF-CEM) in tempi diversi di esposizione (2, 4, 12, 24 e 48 ore). Inoltre e stata effettuata la valutazione degli indici di 2

3 proliferazione e i livelli di espressione dei geni regolatori del ciclo cellulare e dell apoptosi piu rappresentativi quali: RB, p21, p73, p53, E2F1, Ras, Akt-1, Akt1-P, Bax e Bcl2. MATERIALI E METODI Culture cellulari Cellule umane linfocitarie (CCRF-CEM) sono state messe in cultura in un volume di 20ml di medium RPMI-1640 e FCS 10% in petri di vetro di 10cm di diametro ad una densita di 1X10 5 cellule/ml ed esposte a campi elettromagnetici non modulati di 900MHz per 2, 4, 12, 24 e 48 ore. Per ciascun esperimento le cellule CCRF-CEM sono state espanse in 5 petri di vetro da 75ml e sono state posizionate all interno della cella TEM. Come controllo 5 petri con la stessa quantita di cellule sono state collocate fuori dalla cella TEM. Le cellule esposte e non esposte sono state prelevate alla fine delle 2, 4, 12, 24 e 48 ore. L ammontare del medium e stato sempre di 20ml/petri e per evitare condizioni di stress alle cellule il medium e stato sempre preriscaldato a 37 C. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati confrontando le cellule esposte e non esposte e ripetuti per 15 volte. Test di vitalita cellulare (MTT) Al fine di investigare il possibile effetto dei campi elettromagnetici sulla vitalita cellulare, ho analizzato l ammontare delle cellule metabolicamente attive esposte e non esposte con il test MTT. Il test MTT e stato effettuato utilizzando un Kit I-MTT della Ditta Roche. 100 l/pozzetto di cellule esposte e non esposte a 2, 4, 12, 24, e 48 ore sono state 3

4 aliquotate in micro piastre da 96 pozzetti. Successivamente le cellule sono state incubate con MTT per 4 ore a 37 C. In tale modo le cellule metabolicamente attive hanno formato dei sali di formazano di colore viola (insolubili in soluzione acquosa) che sono stati solubilizzati con l aggiunta di 0.01M HCl e 10% di SDS a 37 C per tutta la notte. Poiche il numero delle cellule vitali e direttamente correlato all ammontare dei cristalli di formazano, il prodotto di formazano solubilizzato e stato quantificato usando un lettore ELISA. Citometria a flusso (FACS analisi) Per determinare la percentuale di popolazione cellulare nelle differenti fasi del ciclo cellulare, le cellule in coltura esposte e non esposte ai campi elettromagnetici per 2, 24, e 48 ore sono state fissate in alcool etilico al 70% per 30 minuti a 4 C. I nuclei sono stati colorati con 25 g/ml di ioduro di propidio e incubati con 1 mg/ml di Rnases per 1 ora a 37 C. Il DNA che discrimina le fasi del ciclo cellulare e stato determinato tramite la FACS analisi (Becton-Dickinson FACScan). Estrazione DNA da cellule esposte e non esposte a EMF Cellule CCRF-CEM esposte per 2, 4, 12, 24 e 48 ore a 900MHz e cellule CCRF-CEM sono state pellettati, lavati in in buffer PBS (buffer fosfato salino) e risospese in 500 l di buffer di lisi. Il lisato e stato suggesivamente centrifugato a rpm per 15 minuti. Il DNA e stato isolato tramite fenolo/cloroformio e successivamente sottoposto a trattamento con Rnasi A (100 g/ml) a 37 C per 30 minuti. Ogni campione di DNA e stato analizzato su gel di agarosio al 2%. Western Blot 4

5 Il lisato cellulare e stato preparato risospendendo le cellule in buffer di lisi. 40 gr. di proteine sono state denaturate mediante bollitura in buffer sample 2X (100mM Tris HCL ph6.8, 200mM dithiothreitol, 2% SDS, 0.1% bromophenol blue, 10% glycerol), frazionate su gel di poliacrilamide e infine trasferite in una membrana di nitrocellulosa. Le membrane sono state successivamente incubate con i seguenti anticorpi monoclonali: anti-human bax (2D2), anti-p21, anti-bcl2, anti-p53, anti-p21, anti-e2f1 e anti-h-ras. L analisi dell espressione delle proteine Akt1 e Akt-fosforilata e stata eseguita utilizzando anticorpi policlonali. Dopo tre lavaggi in buffer PBS-Tween-20 le membrane sono state incubate con gli anticorpi secondari anti-mouse e anti-rabbit. Il segnale e stato rilevato usando il sistema ECL. RISULTATI Tale studio ha messo in evidenza un significativo decremento cellulare dopo 24 e 48h di esposizione a 900MHz rispetto alle cellule di controllo, si e notato un aumento della proliferazione a 12 ore mentre nessuna differenza e stata riscontrata tra le cellule esposte e non esposte per tempi di esposizione brevi (2, 4 h). La FACS analisi ha rivelato che l esposizione ai campi elettromagnetici induce un significativo incremento della percentuale di cellule in apoptosi dopo 2 ore (18.07% di cellule esposte vs. 3.89% di cellule non esposte). Tale effetto gradualmente decresce dopo 24 e 48 ore di esposizione. Inoltre e stata evidenziata una sostanziale differenza nella distribuzione delle fasi del ciclo cellulare dopo 48 ore. In particolare la percentuale delle cellule in fase S incrementa (39.3% nelle cellule esposte vs. 22.6% nelle cellule di controllo), mentre le cellule in fase G0/G1 decrementa (26.68% nelle cellule esposte vs % nelle cellule di controllo). Questi dati sono stati confermati mediante analisi del DNA (DNA ladder) che ha messo in risalto la presenza di DNA frammentato tipico dell apoptosi dopo 2 e 24 ore di esposizione, mentre dopo 48 ore non e stato rilevato. 5

6 Pertanto questa prima serie di esperimenti indica che l esposizione a campi elettromagnetici a 900MHz determina un danno al DNA inducendo una precoce morte cellulare programmata (apoptosi) in una frazione di cellule CCRF-CEM. Per determinare quali geni potrebbero spiegare gli effetti osservati nelle cellule CCRFcem esposte a 900MHz EMF ho analizzato i livelli di espressione dei geni regolatori del ciclo cellulare piu rappresentativi quali: RB, p21, p73, p53, E2F1, Ras, Akt-1, Akt1-P, e i geni coinvolti nell apoptosi Bax e Bcl2. I dati ottenuti con l analisi del Western Blot hanno messo in evidenza un up-regolazione sia di prb/p105 che di p21 spiegando quindi l effetto dell arresto di crescita delle cellule esposte, mentre l induzione all apoptosi e stata evidenziata da una attivazione precoce di p53, bax, E2F1 e p73. L attivazione dei segnali apoptotici e stata mantenuta per le prime 24 ore in accordo a quanto osservato tramite il DNA ladder e la FACS analisi. Per quanto riguarda i proto-oncogeni Ras e Akt1 si e osservato un progressivo e veloce incremento della proteina Ras fino alle 48 ore, mentre l espressione della proteina Akt1 incrementa 12 ore dopo l esposizione e si mantiene alta fino alle 48 ore. Al contrario la forma fosforilata attiva Akt1 e evidente a 24 ore e si mantiene alta fino a 48 ore solo nelle cellule esposte. In conclusione tutti questi dati indicano che le cellule CCRF-CEM inizialmente rispondono ai danni genotossici indotti dai campi elettromagnetici mediante arresto del ciclo cellulare e apoptosi poi per tempi di esposizione piu lunghi l attivazione dei pathway pro-apoptotici p53 dipendenti e indipendenti non sono piu efficaci. Quindi nonostante la riduzione del numero vitale di cellule esposte a 900MHz le cellule sopravvissute mostrano un aumento di sintesi di DNA con attivazione dei geni della sopravvivenza e il conseguente silenziamento dei geni pro-apoptotici portando quindi le cellule ad acquisire una maggior aggressivita tumorale. 6