Anatomia Patologica Policlinico Universitario di Udine CELL SORTING. Puppato Elisa

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1 Anatomia Patologica Policlinico Universitario di Udine CELL SORTING Puppato Elisa

2 Cosa si intende per sorting? Possibilità di selezionare e di isolare fisicamente una determinata sottopopolazione di cellule con caratteristiche ben definite If a cell can be identified by cytometry,then then it can be sorted

3 Metodi di separazione Aderenza alla plastica Centrifugazione Biglie immunomagnetiche Deplezione CELL SORTING tramite citofluorimetro

4 Tutti i citofluorimetri permettono il sorting? Citofluorimetri Circuito idraulico chiuso Circuito idraulico aperto FACScan Becton Dickinson MoFlo Dako CyAn Dako

5 Storia 1 st prototipo sviluppato nel 1965 da Mack J Fulwyler a Los Alamos National Laboratory (LANL): separazione in base al volume elettronico 1981 : FACSIII 1884 : FACS : FACScans 1996 : FACSCalibur : FACS Vantage :Cytomation: MoFlo cell sorter ad alta velocità

6 MoFlo (Modular Flow) Strumento di ricerca che permette analisi di precisione ed alte prestazione di sorting di cellule, batteri ed altre particelle di simili dimensioni. Consente all operatore di modificare, riconfigurare e migliorare il sistema

7 Cell Sorting Criteri: 10 4 Livello/i di uno/tutti marker/s analizzati Correlazione tra più parametri (fisici o di fluorescenza) Numeri: FINO A 9!! Another Parameter Molte cellule; ~ 70,000 cells/sec Molte popolazioni; ; 4 simultaneamente One Parameter Una cellula

8 Sorting by Flow Cytometry I punti preliminari del sorting sono come quelli per l analisi : 1) FOCALIZZAZIONE IDRODINAMICA 2) INTERROGAZIONE 3) APPLICAZIONI DI REGIONI ( gates ) per definire la sottopopolazione di interesse.

9 Condizioni essenziali per il sorting: Stabilità del flusso NO OSTRUZIONI NO BOLLE T ideale di C Un buon allineamento del flusso e dei laser Cellule monodisperse,risospese risospese in un appropriato terreno (es. RPMI 10% di FBS) [ ] 3-4 milioni/ml

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11 Jet-in-Air quarzo Elettrodo Nozzle Freq. (Hz) Laser Ottica, elettronica decisionale Ampiezza (v)

12 Jet-in-Air quarzo Elettrodo Nozzle Freq. (Hz) Laser Ottica, elettronica decisionale Ampiezza (v)

13 Jet-in-Air quarzo Elettrodo +/- 190 V Freq. (Hz) Laser Fluorescenza Ottica, elettronica decisionale Ampiezza (v) Nozzle Delay Time Punto di break-off

14 Jet-in-Air quarzo Elettrodo Nozzle Freq. (Hz) Laser Ottica, elettronica decisionale Ampiezza (v) +

15 Jet-in-Air V V

16 Jet-in-Air + _ V V + _

17 Controllo digitale della carica Digital Drop Charging elimina il fanning incrementa la purezza 4Way Sort V V

18 MoFlo Con un apposito test ( test pattern ) si controlla la deflezione dello stream principale in quelli laterali (per il sorting) e centrale (scarto)

19 Le cellule sortate sono pure quando vengono caricate SOLO le gcc contenenti le cellule d interessed per questo motivo L operatore calcola il Drop Delay empiricamente (testando vari tempi di DD con test sort con biglie)

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21 SortMaster Monitor automatico per il drop delay Sistema di controllo Ha il compito di mantenere un accurato Drop Delay durante il processo di sorting Un accurato DD è CRITICO per ottenere un sorting ad alta purezza E caratterizzato da un immagine video dello stream e delle gcc; controlla che non ci siano cambiamenti di essi durante il sorting altrimenti esegue gli opportuni aggiustamenti del DD senza dover bloccare il sorting

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23 Esempio di single cell sorting in mw da 96

24 Monitoraggio durante il sorting

25 Modalità di sorting

26 RIANALISI DELLE CELLULE SORTATE PUREZZA Num di eventi+ sortati Num tot di eventi sortati RESA Num di eventi+ sortati Num di eventi+nel campione originale RECUPERO Eventi sortati contati da emocitometro Eventi sortati contati dalla CSU * 100

27 Applicazioni del Cell Sorting Cloning tramite single cell sorting produzione di Ab monoclonali Test clonogenico - per le Cellule Staminali. Studi Biochimici e funzionali su linee purificate - immunologia e ematologia. Cromosomi - generazione di librerie genetiche e paints cromosomici.

28 Applicazioni del Cell Sorting Isolamento di cellule leucemiche per analisi citogenetiche. Isolamento di cellule successivo a trapianto per studi di chimerismo e attecchimento Isolamento di cellule geneticamente modificate marcate con proteine fluorescenti (GFP etc).

29 Single cell cloning GFAP NSE CFSE ASA vwf SMA CFSE HUMAN LAMIN

30 ISOALMENTO PROSPETTICO STABILIRE QUALE SIANO LE CARATTERISTICHE IMMUNOFENOTIPICHE/FISICHE DI UNA POPOLAZIONE CHE PRESENTA UNA DETERMINATA PROPRIETA, IN MODO DA POTERLA POI ISOLARE A PRIORI, O STUDIARLA IN SITU, ETC ES. QUAL E L IMMUNOFENOTIPO DELLE CELLULE STAMINALI DELL ADENOCARCINOMA DELLA MAMMELLA?

31 ISOALMENTO PROSPETTICO POPOLAZIONE DA STUDIARE TEST PER VALUTARE PROPRIETA IN STUDIO PARAMETRI FISICI O IMMUNOFENOTIPICI O ALTRE PROPRIETA VALUTABILI MEDIANTE CITOFLUORIMETRIA SORTING

32 EX 1: CLONOGENICITY TEST MoFlo, DakoCytomation Neuroectodermic diff. Hepatocyte differentiation Endothelium differentiation Myocyte differentiation Pluripotency assay FACS analysis 96wells 48wells 24wells 6wells 6cm Soft agar Array MULTIPARAMETER SELECTION HIGH PURITY LESS EFFORT (TIME SPARING)

33 EX 1: CLONOGENICITY TEST A + A - NF % CELLULE CLONOGENICHE NELLE DIVERSE FRAZIONI % DELLE DIVERSE FRAZIONI ARRICCHIMENTO SE (% CELLULE CLONOGENICHE IN A+* % CELL A+) > NF > (% CELLULE CLONOGENICHE IN A- * % CELL A)

34 % POP % CLONI CONTRIBU TO ALLA POP A + 10% 1% 0,1% A - 90% 1% 0,9% NF 100% 1% 1% A NON ARRICHISCE

35 2 X % POP % CLONI CONTRIBU TO ALLA POP A + 10% 6% 0,6% (18%) A - 90% 3% 2,7% (72%) NF 100% 3,3% 3,3 % (100%) A E ARRICCHITO DI 2 VOLTE IN CELLULE CLONOGENICHE, MA NON RICONOSCE 4/5 DELLE CELLULE CLONOGENICHE RICERCA MARCATORI DIVERSI DA A!!

36 % POP % CLONI CONTRIBU TO ALLA POP A + 10% 20% 2% (100%) A - 90% 0% 0% (0%) NF 100% 2% 2% (100%) A CONTIENE TUTTE LE CELLULE CLONOGENICHE, MA SOLO 1/5 DELLE CELLULE A E VERAMENTE CLONOGENICA RICERCA ALTRI MARCATORI PER DISCRIMINARE ALL INTERNO DELLE CELLULE A POSITIVE!!

37 PROSPECTIVE ISOLATION OF CANCER STEM CELLS

38 To define distinct populations of cells within tumours based on surface immunophenotypic or functional characteristics => FACS To purify these populations to homogeneity => High-speed multiparameter flow-cytometry and cell sorter To develop long term assays of their functional ability (ability( to form new tumour that recapitulate precisely the phenotype of the initial disease) => IMMUNODEFICIENT mice

39 IN VITRO TUMORIGENICITY ASSAY: SOFT AGAR ASSAY Ose 19N 20days

40 Functional assays for normal and malignant stem cells Brian J. P. Huntly and D. Gary Gilliland, NATURE REVIEWS CANCER, VOLUME 5, APRIL 2005

41 Prospective identification and isolation of the tumorigenic cells as (ESA + )CD44 + CD24 - /lowlineage -. (lineage markers: endothelial cell, mesothelial cell, leukocyte and fibroblast markers) As few as 100 cells with this phenotype were able to form tumors in mice, whereas tens of thousands of cells with alternate phenotypes failed to form tumors. The tumorigenic subpopulation could be serially passaged.

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