ANALISI CITOFLUORIMETRICA E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO

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1 ANALISI CITOFLUORIMETRICA E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO Cos è la CITOMETRIA A FLUSSO? Citometria si riferisce alla misura di caratteristiche chimico-fisiche di cellule o di altre particelle biologiche. Citometria a flusso è una tecnica di misurazione multiparametrica di caratteristiche fisiche e/o chimiche condotta su cellule in sospensione all interno di un fluido di trasporto. FACS - Fluorescence Activated Cell Sorting È la citometria a flusso con la capacità aggiuntiva di separare e raccogliere le cellule con una serie di caratteristiche meccaniche ed elettriche. 1

2 Definizione CITOFLUORIMETRIA o CITOMETRIA A FLUSSO Metodica di laboratorio che permette un analisi automatica di sospensioni cellulari monodisperse misurando le caratteristiche citologiche e/o biochimiche all interno di un flusso laminare che interseca una sorgente luminosa, acquisendo e memorizzando piu parametri (volume, granulosita, fluorescenza) per ogni cellula acquisita 2

3 Un po di storia La comparsa della citofluorimetria a flusso (CFM) avviene intorno agli anni 70, determinando un veloce ed intenso sviluppo delle tecniche istologiche e citochimiche. Inizialmente era limitata alla misura di 1-2 parametri: uno per le misure fisiche e l altro per la fluorescenza. La CFM porto grande impulso allo studio del sistema immunitario, grazie all utilizzo di anticorpi monoclonali marcati con fluoresceina (FITC). La grande complessita del sistema immunitario e la presenza di diverse subpopolazioni che reagivano con lo stesso anticorpo stimolarono: lo sviluppo di MoAb sempre piu specifici; la ricerca di nuovi coloranti fluorescenti da coniugare agli anticorpi; la creazione di citofluorimetri a flusso multiparametrici I PRIMI PROBLEMI.. trovare coloranti che potevano essere coniugati agli Ab senza modificare la loro capacita di legame all antigene; selezionare fluorocromi con spettri distinti di emissione. E LE SOLUZIONI!!! un punto di svolta nella CFM fu lo sviluppo di coloranti come le ficobiliproteine, fluorocromi naturali solubili in acqua, fluorescenti a ph neutro, facilmente coniugabili con MoAb, con elevate rese quantiche. Ficoeritrina (PE): viene eccitata dalla stessa lunghezza d onda del FITC (488 nm), quindi possono essere usati insieme per realizzare un sistema di rilevazione molto sensibile in doppia marcatura. 3

4 Citofluorimetria a flusso oggi Negli ultimi anni la CFM ha raggiunto una notevole diffusione, sia in laboratori clinici che in laboratori di ricerca. Fattori che hanno contribuito a questo notevole sviluppo: la possibilita di utilizzare piu laser di emissione, che permette di effettuare analisi multiparametriche a 4 e piu colori; la disponibilita di MoAb marcati con un ampia gamma di fluorocromi e diretti contro una larghissima varieta di Ag di membrana e/o intracellulari; la riduzione dei costi e della complessita nell utilizzo dello strumento. APPLICAZIONI Permette di analizzare un elevato numero di cellule in breve tempo ( cellule in pochi secondi), quantificando numerosi parametri per ogni singola cellula. Permette ad es. di determinare il contenuto di DNA, i diversi sottotipi cellulari, gli organelli intracellulari, l attivita di alcuni enzimi. Studio della ploidia e della proliferazione cellulare; Analisi del ciclo cellulare; Analisi immunofenotipica multiparametrica; Risposta del sistema immunitario alla somministrazione di vaccini (cellule antigene specifiche, produzione di citochine, ecc); Livelli di apoptosi in patologie associate a deplezione cellulare (es AIDS) o accumulo cellulare (tumori); ecc ecc!!!!! 4

5 COME FUNZIONA UN CITOFLUORIMETRO? 1) Le cellule di una popolazione eterogenea vengono aspirate dalla provetta e immesse in un sistema fluidico il quale tende, in opportune condizioni idrodinamiche, a trasportare le cellule in maniera separata e ordinata fino al punto di misura. 2) Ogni singola cellula viene poi attraversata da un fascio di luce che eccita i fluorocromi e determina l emissione di un segnale fluorescente 3) Il segnale passando attraverso un sistema lenti, specchi e filtri ottici, viene inviato ai sensori (fotodiodi e fotomoltiplicatori) che ne misurano l intensita. 4) I segnali elettrici provenienti da ogni sensore,opportunamente amplificati vengono quindi processati e digitalizzati, sono inviati ad un analizzatore, che elabora il dato e lo visualizza tramite un grafico. 5) Attraverso piastre di deflessione le cellule analizzate possono essere raccolte separatamente tramite un processo definito sorting. Componenti di un citofluorimetro a flusso Sistema fluidico (focalizzazione idrodinamica) Sistema ottico (laser Argon 488nm) Sistema elettronico (software CellQuest) 5

6 Il sistema di dispersione del campione liquido fornisce un efficiente mezzo in grado di presentare individualmente le cellule del campione alla stazione di misura, dove intersecano il raggio di luce emesso dal laser. E importante evitare la formazione di aggregati cellulari. Sistema Fluidico La velocita di efflusso delle cellule viene valutata come numero di eventi al secondo: numero di particelle che hanno incontrato il raggio di luce nell unita di tempo. La sospensione cellulare viene spinta con pressione all interno della camera di flusso, dove le cellule vengono messe in fila una dietro l altra, grazie alla differenza di pressione tra il campione e il fluido di trasporto. Si realizza così un flusso laminare concentrico di liquidi (FOCALIZZAZIONE IDRODINAMICA) in cui il più esterno (liquido di trascinamento) trasporta all interno una sottile vena fluida di campione. Le cellule sono così forzate ad allinearsi ed attraversare individualmente un punto di misura interagendo con il fascio di luce del sistema di eccitazione. La pressione di spinta e la diluizione del campione consentono di contare fino a qualche migliaia di cellule al secondo. 6

7 Le cellule così disposte passano davanti al raggio laser di forma ellittica, focalizzato in modo da colpire le cellule al centro del canale di conta formato dal liquido di trasporto. Sistema Ottico Sorgenti luminose Nella grande maggioranza dei citofluorimetri si utilizza una sorgente luminosa a ioni Argon centrata su una lunghezza d onda di 488 nm (blu). Tale luce consente una efficace misura dei parametri fisici, inoltre permette la contemporanea eccitazione di diversi fluorocromi. Se e necessario utilizzare altre lunghezze d onda bisogna utilizzare altri tipi di laser (es Kripton, Elio Neon, ecc) I laser hanno costi molto elevati!!! Un alternativa piu economica e costituita dall uso dei citometri a lampada, che hanno come fonte di eccitazione una lampada a vapori di Mercurio o Xenon che non richiede particolari sistemi di raffreddamento. Sono utili per le applicazioni che riguardano particolari fluorocromi (es quelli utilizzati per la marcatura del DNA). LIMITI: bassa potenza erogata, scarsa stabilita della luce di emissione, rapido decadimento 7

8 Proprietà del Laser Radiazione coerente a discrete lunghezze d onda. Sorgenti più comuni: Ione Argon. UV 350/364 nm Visible nm Ione Krypton. UV 350/356 nm Visible nm Helium/Neon 633 nm hoy@cf.ac.uk Dall interazione delle cellule con il raggio luminoso del sistema di eccitazione, vengono generati dei segnali dipendenti dalle caratteristiche fisiche e dalla presenza di marcatori fluorescenti sulla superficie, nel citoplasma o nel nucleo della cellula. Light scattering : I due segnali che permettono di identificare le caratteristiche fisiche delle popolazioni cellulari sono correlabili alle dimensioni delle cellule. Se si osserva una cellula in controluce, si misura un segnale legato alla diffrazione (scatter) che è in relazione al diametro cellulare (FORWARD SCATTER O SCATTER LINEARE = FSC) Rifrazione & Riflessione: proporzionale alla granularità cellulare e alla complessità rilevate a 90 rispetto la luce incidente Diffrazione: proporzionale all area della cellula rilevata lungo l asse della luce incidente 0 Se ci si pone ortogonalmente al fascio, si misura un segnale legato sostanzialmente alla riflessione e alla rifrazione (SIDE SCATTER O SCATTER A 90 = SSC) dovute alla granulosità cellulare, al rapporto n/c e alla irregolarità della superficie cellulare. 8

9 RICAPITOLANDO: Il Forward scatter distingue le cellule sulla base del volume ed è anche in grado di distinguere cellule vive da morte. Il Side scatter tende ad essere più sensibile rispetto alle inclusioni all interno della cellula e può essere usato per distinguere le cellule granulate dalle non-granulate. FSC e SSC rappresentano i parametri fisici. Raggruppandoli in un unico grafico se ne ottiene uno biparametrico, il Citogramma: diagramma bidimensionale ottenuto dalla combinazione di questi due tipi di segnale. Permette di discriminare tra diverse popolazioni cellulari basandosi solamente sulle loro caratteristiche fisiche. Grafici monoparametrici (istogrammi) Citogramma 9

10 Componenti di un citofluorimetro a flusso Segnali di fluorescenza: in citofluorimetria vengono rilevati segnali fluorescenti generati: dall utilizzo di MoAb marcati con fluorocromi (FITC, PE, PerCp, APC, ecc) specifici per antigeni presenti sulla membrana, nel citoplasma, nel nucleo; da fluorocromi che si legano in maniera stechiometrica a determinate sostanze come il DNA e l RNA. Ogni fluorocromo presenta una caratteristica lunghezza d onda per l eccitazione e l emissione. Limiti alla scelta di fluorocromi da utilizzare in combinazione: La lunghezza d onda di eccitazione Le bande di emissione devono essere sufficientemente separate da permettere la loro appropriata misurazione. FLUOROCROMI La fluorescenza e il fenomeno per cui una molecola colpita da una radiazione luminosa di definita ne emette un altra a maggiore (effetto Bohr). Ogni fluorocromo presenta una caratteristica per l eccitazione e per l emissione. Se utilizziamo piu fluorocromi nello stesso protocollo sperimentale, le loro emissioni devono essere sufficientemente distanti per poter essere selezionate in modo distinto, ciascuna da un Fotomoltiplicatore. L intensita della fluorescenza emessa è proporzionale al numero di siti di legame. 10

11 Con l utilizzo degli anticorpi coniugati a Fluorocromi (e. Isotiocianato di fluoresceina: FITC, FICOERITRINA (PE), etc:) ed il Citofluorimetro, sonostatiidentificatinumerosideterminantiantigenicidisuperficieche permettono di differenziare sia i vari tipi di cellule che il loro stadio di maturazione Come lavorano i fluorocromi? Un laser eccita il fluorocromo il fluorocromo eccitato sale nel livello successivo della nuvola elettronica il fluorocromo ritorna al livello originale e rilascia l energia in eccesso come fotone i fotoni emettono a lunghezze d onda maggiori rispetto a quelle a cui vengono eccitati Fluorocromi diversi hanno lunghezze d onda diverse L eccitazione proviene dal laser. Ci sono 4 diverse opzioni: 488nm Blue, 633nm Red, 405nm violet, 350nm UV. Usando filtri e specchi è possibile separare le diverse lunghezze d onda ed inviarle a diversi detectors 11

12 In caso di impiego di più di una sostanza fluorescente, le diverse emissioni di colore vengono separate attraverso un sistema di filtri ottici, in modo da poter analizzare separatamente tutte le diverse fluorescenze (FL1, FL2, FL3, FL4). I segnali emessi vengono raccolti da un sistema di lenti, specchi e filtri ottici ed inviati ai relativi sensori (fotodiodi e Fotomoltiplicatori) che trasformano i segnali luminosi in impulsi elettrici direttamente proporzionali alla luce raccolta (ampiezza del segnale). Vengono poi digitalizzati ed inviati ad un elaboratore che provvede alla loro definizione statistica. Sistema Elettronico Sistema di conversione ed elaborazione digitale Ogni singolo valore proveniente dai sensori, viene amplificato e convertito, costituendo cosi il quanto citometrico o evento. Tutti gli eventi relativi all insieme dei dati misurati si accumulano nei canali che ne rappresentano la distribuzione dei valori. Il modo piu semplice di rappresentare una correlazione tra due parametri è il diagramma di dispersione a due punti (dot plot),nel quale ogni punto rappresenta un singolo evento o un insieme di eventi dotati di un definito valore per ciascuno dei due parametri considerati. 12

13 Elementi fotoelettronici di base di un FACS Fotomoltiplicatori trasformano il segnale in voltaggi FSC SSC FL1 FL2 FL3 Amplificazione e linear linear log log linear trasformazione log se richiesta Digitalizzati su una scala discreta (un byte) per la maggior parte per risoluzioni superiori (i.e. DNA). Elencate e visualizzate Header contiene informazioni riguardanti come Flow Cytometry l esperimento ed il settaggio del citometro. Standard ( FCS ) I dati correlati sono registrati per singola cellula Files elencata per tutti I parametri selezionati. hoy@cf.ac.uk File Size header+cells x (parameters x bytes). Rappresentazione dei dati Esistono diversi modi per rappresentare un dato citofluorimetico. La rappresentazione piu semplice e costituita dall istogramma dove l ascissa riporta l intensita di fluorescenza e l ordinata il numero di cellule che esprimono o meno l antigene (diagramma di distribuzione). L analisi statistica si basa sull impostazione di cursori che delimitano le aree di interesse, e sulla quantificazione degli eventi cellulari che rientrano in tali aree (la % di cellule è determinata con una funzione integrale- area sottesa dalla curva). Per ogni picco e possibile calcolare dati statistici (valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, ecc) 13

14 Rappresentazione bidimensionale Oltre all istogramma, e possibile utilizzare una serie di rappresentazioni bidimensionali, che permettono di mettere in correlazione due parametri tra di loro. Dot-plot: ogni singolo punto rappresenta un evento Contour-plot: Visualizzano aree aventi la stessa densita mediante linee concentriche CD8 - /CD4 + CD8 + /CD4 - CD8 - /CD4 - Si possono utlizzare altre rappresentazioni dove l intensita del colore e proporzionale alla densita degli eventi 14

15 Campione : cellule ematiche periferiche dopo lisi emzie. Dati raccolti su cellule. Dot Density Contour Horizontal : low angle scatter. Vertical : high angle scatter. hoy@cf.ac.uk VANTAGGI dell ANALISI citofluorimetrica : multiparametricità possibilità di mettere in relazione più caratteristiche della stessa cellula analisi di grandi quantità di cellule riproducibilità ed affidabilità statistica delle acquisizioni grande sensibilità rapidità di analisi possibilità di ulteriori analisi a posteriori 15

16 Limitazioni dell ANALISI citofluorimetrica : nella necessita di impiegare sospensioni monocellulari, nei costi, nella relativa complessità della strumentazione che richiede un addestramento estensivo del personale ed accurata manutenzione. Nessun citofluorimetro a flusso potrà dare buoni risultati da cattivi campioni, e questo fondamentale aspetto preanalitico dipende dallo scrupolo dell operatore e dalla sua capacità di valutare anche visivamente la qualità di un preparato cellulare o di una marcatura. Applicazioni 1. determinazione dei marcatori di differenziamento cellulare, di superficie, intracitoplasmatici e intranucleari 2. valutazione del contenuto cellulare di DNA 3. discriminazione tra cellule vive, cellule apoptotiche e necrotiche 4. predisposizione per la separazione cellulare 5. Macchina per l emocromo-> un citofluorimetro a basso costo predisposto alla lettura degli elementi corpuscolati del sangue. 16

17 Una delle principali applicazioni cliniche e sperimentali della Citofluorimetria riguarda l immunofenotipizzazione linfocitaria che consiste nell utilizzazione di anticorpi specifici diretti verso i vari marcatori di membrana CD (Cluster Of Differentiation) al fine di differenziare, all interno di un pool di linfociti, le diverse sottopopolazioni. I linfociti infatti, morfologicamente indistinguibili tra loro, sono costituiti da diverse sottopolazioni con ruoli specifici nella risposta immunitaria, le quali hanno pero diverse espressioni antigeniche. Nelle patologie coinvolgenti il sistema immunitario, ritroviamo caratteristiche alterazioni dei rapporti tra le sottopolazioni linfocitarie, che possono essere riconosciute grazie alla loro Tipizzazione citofluorimetrica. Tipi di cellule Immunofluorescenza Antigene specifico Reporters genetici FACS Gal FISH GFP 17

18 Immunofluorescence Antigene specifico Reporters genetici FACS Gal FISH GFP Immunofluorescence Specific antigen Genetic reporters FACS Gal FISH GFP 18

19 Stadi: Quiescenza, Attività, Apoptosi DNA Totale: ciclo cellulare Sintesi di RNA Mitocondri Ca ++ Intracellulare ph Intracellulare Esposizione di fosfatidilserina G0/1 S G2/M Apoptosi: Annexin-V + PI Dead Cells Late Apoptosis Viable Cells Early Apoptosis Ref: Beckman Coulter Inc: 19

20 The Pre-Apoptotic Sequence 20