Fluorescenza e fluorocromi: caratteristiche. fisico chimiche e spettrali

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1 Fluorescenza e fluorocromi: caratteristiche fisico chimiche e spettrali Le applicazioni della Citometria a Flusso (CF) sono quasi esclusivamente basate sullʹimpiego di uno o più fluorocromi in vario modo legati alle strutture da analizzare. La CF è oggi utilizzata nel settore della fenotipizzazione cellulare mentre inizialmente il suo utilizzo era mirato all analisi della misura del volume e del contenuto di DNA, utilizzando la valutazione della luce diffusa e la misura della fluorescenza del Bromuro di Etidio (EB). I fluorocromi in questo modo hanno sostituito i coloranti classici della citochimica, almeno per quanto riguarda gli aspetti qualitativi e in parte anche quantitativi. In seguito l uso della CF è stato impiegato in un ampia ricerca metodologica attraverso l utilizzo di una vasta gamma di metodologie e di fluorocromi ed è stato rivolto allo studio delle proteine cellulari utilizzando dapprima tecniche tradizionali e, successivamente, metodiche e fluorocromi dedicati alla CF. FLUORESCENZA Nell analisi le cellule vengono attraversate da un fascio di luce laser di determinata frequenza ed elevata intensità che può venire diffusa (trasmessa), rifratta o riemessa come fluorescenza nel caso ecciti molecole in grado di emetterla. La fluorescenza è quel fenomeno per cui una molecola colpita da una radiazione luminosa ad una certa lunghezza dʹonda (frequenza di eccitazione) ne emette unʹaltra a lunghezza dʹonda superiore (frequenza di emissione). Le molecole fluorescenti (Fluorofori, fluorocromi o coloranti fluorescenti) assorbono la luce in una regione dello spettro (figura 2.1) e di conseguenza emettono luce (energia fotonica) fluorescente in una regione dello spettro superiore, ad una lunghezza d onda (λ) più alta. Infatti, in seguito a questo assorbimento dʹenergia gli elettroni degli orbitali più esterni si spostano da un livello energetico ad uno 1

2 superiore (eccitazione), dove la permanenza al livello superiore è brevissima, dellʹordine dei miliardesimi di secondo, dopo di che gli elettroni tornano al livello energetico originario liberando lʹenergia assorbita sotto forma di radiazioni elettromagnetiche (emissione di fotoni). Poichè la resa energetica non è mai del 100% le radiazioni liberate sono di lunghezza dʹonda superiore, e quindi di energia minore, rispetto a quella dellʹenergia di eccitazione; l emissione è spostata verso la regione del rosso rispetto all eccitazione perché è la zona ad energia più bassa (il livello di energia è inversamente proporzionale alla lunghezza d onda). Fig Ambito spettrale di analisi in citometria a flusso Ogni molecola possiede uno specifico spettro di emissione e le molecole che riescono ad emettere luce in modo particolarmente efficiente una volta eccitate vengono definite fluorocromi. Una delle proprietà fondamentali che caratterizzano un fluorocromo si chiama stokeʹs shift e rappresenta la differenza tra la lunghezza dʹonda della luce emessa e quella della luce assorbita, o, che è la stessa cosa, tra l energia del fotone di eccitazione e quella del fotone di emissione. Questa proprietà è caratteristica per ogni molecola ed è limitata di solito a poche decine di nanometri. 2

3 Quando gli elettroni passano da uno stato energetico superiore ad uno stato energetico inferiore, lʹenergia recuperata può venire emessa sotto forma di radiazione elettromagnetica. Una volta che la molecola ha assorbito la radiazione incidente torna allo stato fondamentale e la dissipazione di energia che ha ricevuto dal quanto può avvenire in due modi: 1. la molecola trasferisce lʹeccesso di energia allʹintorno con un processo non radiativo. Attraverso gli incontri con altre molecole, come di solvente, o attraverso moti che avvengono nei solidi, lʹenergia emessa, sotto forma di calore, permette alle molecole circostanti di compiere vibrazioni, rotazioni e traslazioni; infatti, la molecola può cedere energia che si trasforma in energia cinetica, energia vibrazionale, ecc. ma l effetto è comunque quello di un aumento di energia termica; 2. la molecola, invece, subisce un decadimento radiativo dove lʹenergia in eccesso viene liberata sotto forma di fotoni, dando luogo ad un evento di emissione spontanea che può essere fluorescenza o fosforescenza. Ogni livello elettronico ha dei sottolivelli vibrazionali. Una molecola eccitata si trova in uno degli stati vibrazionali di un livello energetico superiore e, essendo soggetta a collisioni con le molecole circostanti, rilascia parte della sua energia sotto forma non radiativa, scendendo nella scala dei livelli vibrazionali. Il comportamento delle molecole fino a questo punto è indistinto; la prima differenza dipende dalle molecole circostanti: se queste sono in grado di assorbire la restante energia elettronica in eccesso della molecola eccitata, questa completa il suo rilassamento in modo non radiativo tornando allo stato fondamentale e liberando così calore; altrimenti si ha il decadimento radiativo delle molecole eccitate, in cui viene emesso un fotone, che ha però minore energia rispetto a quella del fotone che l ha portata allo stato eccitato, e si hanno così i processi di fluorescenza o di fosforescenza. La fluorescenza è uno dei due processi radiativi con cui si può verificare il rilassamento di una molecola eccitata, lʹaltro è la fosforescenza. 3

4 La distinzione tra i due processi fu originariamente fatta in base al tempo di vita della radiazione: nella fluorescenza la luminescenza cessa quasi subito dopo aver eliminato la radiazione eccitante, infatti i materiali fluorescenti cessano di essere luminosi al cessare dello stimolo che ne determina la luminosità. Mentre nella fosforescenza la radiazione continua ad essere emessa, almeno per un breve lasso di tempo, anche dopo aver eliminato la sorgente eccitante, così nei materiali fosforescenti la luce continua ad essere emessa per un certo periodo dopo la fine dello stimolo. Ora, invece, si possono distinguere i due processi sulla base della natura degli stati elettronici coinvolti nelle transizioni responsabili dellʹemissione di radiazione. Quando un elettrone viene promosso da uno stato fondamentale ad uno di eccitato, esso può mantenere lo spin originario oppure invertirlo (figura 2.2). Se l eccitazione avviene con ritenzione dello spin, si parla di stato di singoletto(s1) e gli spin degli elettroni nello stato eccitato sono appaiati come nello stato fondamentale (S0). Se, invece, il passaggio allo stato attivato avviene con inversione dello spin, si parla di stato di tripletto (T1). Fig. 2.2 Rappresentazione dei differenti stati elettronici, sia allo stato fondamentale (S0) che in seguito ad eccitazione, in cui si può avere lo stato di singoletto (S1) o lo stato di tripletto (T1). Allo stato di singoletto compete una energia più alta e una vita media che va da a 10 9 sec, mentre lo stato di tripletto ha una energia inferiore e una vita media che va da 10 3 a 10 1 sec. 4

5 Nella fluorescenza la radiazione è generata da transizioni tra stati con la stessa molteplicità di spin (es. S1 S0). Nella fosforescenza, invece, la transizione coinvolta comporta variazione della molteplicità di spin, dove il caso più frequente sono transizioni tripletto singoletto (es. T1 S0). Una molecola nello stato fondamentale (S0), a seguito dell assorbimento di luce, viene eccitata a uno dei suoi stati elettronici di singoletto (S1, S2, ); quindi, in un primo momento si genera uno stato di singoletto, dato che le molecole nello stato fondamentale sono quasi tutte dei singoletto. L energia vibrazionale della molecola eccitata viene trasferita a molecole vicine in seguito a collisioni; infatti, vi è sempre un rapido ritorno al più basso livello vibrazionale dello stato di singoletto eccitato, senza emissione di radiazioni. Questo fenomeno si chiama conversione interna e si verifica in tempi dell ordine di secondi. Inoltre, c è la possibilità di un passaggio dallo stato di singoletto (S1) allo stato di tripletto (T1) mediante conversione di sistema o Intersystem Crossing. Questo passaggio è una inversione dello spin dell elettrone che viene determinato dagli urti con altre molecole o da processi intramolecolari. Dallo stato di tripletto per passare allo stato fondamentale la molecola può subire l emissione spontanea di un fotone dando luogo al fenomeno della fosforescenza. L eccitazione segue la legge della conservazione dello spin, cioè le transizioni tra stati a diverse molteplicità sono proibite; pertanto, la transizione di uno stato fondamentale di singoletto (S0) al primo stadio di tripletto eccitato (T1) ha una scarsissima probabilità di avvenire. Il diagramma di Jablonski (figura 2.3) riassume le trasformazioni che si verificano per assorbimento di una radiazione di sufficiente energia in una molecola. 5

6 Fig. 2.3 Diagramma di Jablonski: descrive il fenomeno di eccitazione di un fluorocromo e successiva emissione di fluorescenza. 1. ECCITAZIONE: un fotone di energia hυ viene emesso da una radiazione ed assorbito da un fluoroforo, questo determina la formazione di uno stato eccitato di singoletto (S1 ). 2. STATO TEMPORANEAMENTE ECCITATO: lo stato di eccitazione si mantiene tale per circa 10 9 secondi. Durante questo periodo di tempo, il fluoroforo va incontro a cambiamenti conformazionali grazie ai quali ha la possibilità di interagire con il proprio ambiente molecolare, dando origine al fenomeno di conversione interna o di quencing. Questi processi determinano due importanti conseguenze: per prima cosa, l energia di S 1 viene in parte dissipata, producendo uno stato eccitato di singoletto (S1) dal quale si ha emissione di fluorescenza; secondo, non tutte le molecole inizialmente eccitate dall assorbimento ritornano allo stato fondamentale (S0). 3. EMISSIONE DI FLUORESCENZA: si ha emissione di un fotone con energia hυem ed il fluoroforo ritorna allo stato fondamentale (S0); durante questo processo l energia del fotone hυem è più bassa rispetto al fotone eccitato hυex, e di conseguenza la lunghezza d onda è maggiore. hυem hυex 6

7 L energia di un fotone viene misurata come: E = hυ = hc/λ dove: h = costante di Plank ( J s) c = velocità della luce ( m/s) E = energia di 1 fotone [J = ev] λ = lunghezza dʹonda della radiazione [m] υ = frequenza della radiazione [Hz] 1 ev = 8000 cm 1 e corrisponde a λ= 800 nm Più la λ è alta e più bassa è l energia del fotone. L intensità di fluorescenza è quantitativamente dipendente da una serie di parametri, quali: Legge di Lambert Beer, descrive l assorbimento delle sostanze in soluzione e stabilisce che quando un fascio di luce (mono o policromatica) di intensità I0 attraversa uno strato di spessore l di un mezzo, una parte di esso viene assorbita dal mezzo stesso e una parte ne viene trasmessa con intensità residua IT. Il rapporto tra l intensità della luce incidente e di quella trasmessa con il mezzo attraversato è espresso dalla seguente relazione: dove kλ è detto coefficiente di estinzione ed è una costante caratteristica del mezzo oltre che della lunghezza d onda della luce incidente. Il rapporto tra le intensità viene detto Trasmittanza. 7

8 Efficienza Quantica è espressione della probabilità di conversione dellʹenergia di eccitazione in emissione di fluorescenza: maggiore è il suo valore e maggiore sarà la sensibilità della determinazione. n fotoni emessi/n fotoni assorbiti = IEm/IEx In generale, è il rapporto tra il numero di fotoni emessi, in un processo sensibilizzato sulle radiazioni elettromagnetiche, ed il numero di fotoni assorbiti. E rilevante la precisazione della intensità della radiazione in funzione della frequenza o della lunghezza dʹonda. Un fluorocromo ideale dovrebbe avere una efficienza quantica decisamente più alta nella forma legata che in quella libera, così da ridurre il rumore di fondo dovuto al colorante libero; una simile situazione è riscontrabile per il Bromuro di Etidio e lo Ioduro di Propidio nella forma intercalata e non. Inoltre, i processi non radiativi che competono con la fluorescenza, come la conversione interna, i processi di conversione di sistema e le perdite di intensità (fading), influenzano direttamente l efficienza quantica di fluorescenza. I fenomeni di fading (decadimento) comprendono il quenching (spegnimento) ed il photobleaching (fotodecadimento). Una proprietà unica della fluorescenza sta nella capacità dei fluorocromi, che si trovano ad una certa distanza da altri fluorocromi, di provocare quenching di fluorescenza di questi ultimi. Alcune interazioni elettroniche però possono verificarsi tra due fluorocromi anche quando essi sono così distanti da non poter dare variazioni di spettro; tale disposizione è detta limite dell accoppiamento debole. Definendo donatore il componente che assorbe ad una energia più alta (λ minore) e l altro accettore, quando il donatore viene eccitato perde rapidamente energia per conversione interna fino a che non raggiunge il livello vibrazionale fondamentale del primo stato eccitato elettronico. A questo punto i quencher reagiscono con lo stato eccitato depopolandolo oppure possono reagire con lo stato fondamentale impedendo il raggiungimento dello stato eccitato. 8

9 Il quenching non è sempre un fenomeno negativo (es. molecole dello stesso fluorocromo, Fitc o CarboxyFitc); se l energia di emissione del donatore coincide con l energia di assorbimento dell accettore, l accoppiamento debole permette che avvenga il fenomeno di trasferimento di energia, FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Così il donatore è soggetto a fenomeni di quencing, cedendo la sua energia all accettore che diventa eccitato e quindi fluoresce; è quindi necessario che i due fluorocromi appartengano a molecole diverse. La FRET consiste quindi nell interazione fra gli stati eccitati di due molecole di fluorocromo, in cui lʹeccitazione di una molecola donatore è trasferita ad una molecola accettore, senza emissione di fotoni. Questo fenomeno dipende dalla distanza intermolecolare (R), diventando molto evidente a distanze fra donatore e accettore dellʹordine di Å. Le condizioni essenziali perché possa avvenire la FRET sono: a) lo spettro di assorbimento dellʹaccettore deve essere in buona parte sovrapponibile allo spettro di emissione del donatore; la zona di sovrapposizione è chiamata FRET spectral overlap integral (integrale di sovrapposizione) (figura 2.4); Fig. 2.4 FRET: integrale di sovrapposizione tra lo spettro di emissione del donatore e lo spettro di assorbimento dell accettore. b) i dipoli di transizione del donatore e dellʹaccettore devono avere orientamento parallelo. 9

10 Cy 5 Emette PE non Emette Laser 488 nm Fig. 2.5 FRET: esempio di capping di superficie Questa proprietà dei fluorocromi è pertanto estremamente utile quando si vogliano studiare processi biologici che avvengono su distanze comparabili con le dimensioni delle macromolecole biologiche, o che comportino modificazioni delle conformazioni o delle distanze molecolari. Le principali applicazioni della FRET riguardano struttura e conformazione di proteine ed acidi nucleici, interazioni recettore/ligando, sequenziamento del DNA, distribuzione e trasporto di lipidi, fusione di membrane, ecc. Poiché, nella maggior parte delle applicazioni, donatore e accettore sono fluorofori diversi (figura 2.5), come la coppia fluorescein donatore e tetramethylrhodamin accettore (R = 55 Å), la FRET può essere rivelata dalla graduale comparsa della fluorescenza dellʹaccettore e scomparsa di quella del donatore. Nel caso di donatore ed accettore uguali, come fluoresceinfluorescein (R= 44 Å), la FRET viene rivelata dalla conseguente depolarizzazione della fluorescenza. 10

11 Le principali differenze tra il quenching e la FRET sono: QUENCHING fenomeno statico breve distanza intermolecolare, R < 20 Å dipendente da e R forte dipendenza dalla temperatura alterazione dello spettro di assorbimento del fluorocromo FRET fenomeno dinamico grande distanza intermolecolare, R Å dipendente da 1/R 6 non dipende dalla temperatura spettro di assorbimento del fluorocromo invariato Un altro fenomeno capace di influenzare l intensità di fluorescenza emessa è il photobleaching, che consiste nella scomparsa irreversibile della fluorescenza prodotta da un eccessiva intensità della luce di stimolazione. In questo caso l energia in eccesso viene utilizzata da altre molecole per dissociarsi o per attivare reazioni chimiche. Si può dire quindi che l emissione di un fluorocromo e la relativa intensità di fluorescenza dipendono da vari fattori tra cui il ph, la concentrazione, la vicinanza di altre molecole, la fototossicità, il fading, la presenza di particolari ioni, ecc... In figura 2.6 viene mostrata la dipendenza dal ph dell emissione di fluorescenza comparata tra i fluorocromi Oregon Green 488, carboxyfluoresceina e Alexa Fluor 488; le intensità di fluorescenza sono state misurate per uguali concentrazioni dei tre fluorocromi usando uno spettro eccitazione/emissione a 490/520 nm. 11

12 Oregon Green 488 Carboxyfluoresceina Alexa Fluor 488 Fig. 2.6 Comparazione della dipendenza dal ph dell emissione fluorescente dei tre fluorocromi. 12

13 Proprietà dei fluorocromi Virtualmente, ogni molecola può essere considerata un fluorocromo e può emettere una fluorescenza quantificabile se opportunamente eccitata. Anche la stabilità dellʹintensità di fluorescenza del fluorocromo durante lʹirraggiamento è particolarmente importante per lʹaccuratezza della misura citofluorimetrica quantitativa. La brillantezza (B) dell emissione di un fluorocromo dipende da vari fattori e segue la seguente relazione: B = NxExQ Dove: N è il numero di molecole di fluorocromo; E è l estinzione: la probabilità che una mole di fluorocromo riesca effettivamente ad assorbire un fotone incidente; Q è l efficienza quantica: la probabilità che una mole di fluorocromo che abbia assorbito un fotone ne emetta un altro. Le caratteristiche spettrali di un fluorocromo devono essere adeguate allo strumento che si usa. In particolare, maggiore è lʹestinzione (E) maggiore è la possibilità di creare lo stato eccitato; inoltre, se si usano più fluorocromi, i loro spettri di emissione devono essere sufficientemente separati. I fluorocromi devono essere compatibili con la biologia dellʹesperimento e devono: 1. presentare adeguata specificità del legame 2. presentare legame proporzionale al numero di siti da riconoscere 3. devono poter raggiungere il loro bersaglio 4. non devono essere tossici, in particolare i reagenti usati per il cell sorting, e non reattivi in modo da evitare processi di idrolisi, con conseguente rilascio di colorante libero ed aumento del segnale di fondo, nei tempi normalmente previsti per lʹimpiego dei coloranti e lʹesecuzione delle analisi. 13

14 Esistono numerosissimi fluorocromi per differenti applicazioni. Di essi occorre conoscere le lunghezze dʹonda di eccitazione ottimali e le lunghezze dʹonda di massima emissione. In caso di impiego simultaneo di due o più fluorocromi è indispensabile conoscerne i diagrammi spettrali dettagliati, in modo da valutare la loro compatibilità e l eventuale sovrapposizione degli spettri di emissione, che verrà sottratta mediante la procedura di compensazione. Le caratteristiche dello spettro di emissione possono essere sfruttate per analisi multicolour; questo tipo di indagine possiede un campo di applicazione sia in immunofenotipizzazione che in studi di funzionalità cellulare e citogenetica. In generale la fluorescenza si può distinguere in fluorescenza primaria (o spontanea o ancora, autofluorescenza) e secondaria (o indotta), dovuta all introduzione di un fluorocromo nel sistema. Qualsiasi oggetto biologico che viene colpito da luce incidente emette un segnale di fluorescenza misurabile su tutti i canali, anche se di debole intensitaʹ; questo fenomeno è detto autofluorescenza ed interferisce nella misurazione dell intensità di fluorescenza indotta. Generalmente, è prodotta dalla fotoluminescenza di alcuni aminoacidi e quindi dalle proteine che li contengono; in particolare il triptofano e la tiroxina sono i principali responsabili della tipica autofluorescenza di molti tessuti biologici osservati in luce ultravioletta al microscopio a fluorescenza. Lʹintensitaʹ dellʹautofluorescenza cellulare dipende dalla lunghezza dʹonda incidente, dove è massima per λ basse, come gli UV e Blu (Argon 488 nm), e minima per λ alte, come Rosso (He Ne 633 nm); ma, a parità di lunghezza dʹonda incidente, lʹintensitaʹ dellʹautofluorescenza cellulare dipende dal tipo di cellula (figura 2.7): massima per macrofagi alveolari, linee in vitro e granulociti. Alcune condizioni patologiche inoltre aumentano questo fenomeno, come nel caso di blasti leucemici mieloidi, iperbilirubinemia, trattamento con vitamine del gruppo B, emolisi spontanea, alcuni antibiotici e citostatici, che in alcuni casi possono essere considerati veri e propri fluorocromi. 14

15 Infine, lʹattacco aspecifico di anticorpi coniugati e la presenza di fluorocromi liberi in soluzione (fluorescenza aspecifica), ed i fissativi cellulari, come la paraformaldeide e la formaldeide, aumentano anch essi il fenomeno dellʹautofluorescenza PIASTRINE LINFOCITI (LYSE NO WASH) GRANULOCITI (LYSE NO WASH) Fig. 2.7 Autofluorescenza su FL1 (exc 488 nm) di preparati di controllo: sono evidenti le differenze tra i diversi tipi di cellule. La fluorescenza primaria si può ridurre effettuando dei lavaggi, ma eʹ comunque ineliminabile e rappresenta un aspetto negativo di molti approcci citometrici, soprattutto in citometria statica, ma anche, in misura minore, a flusso. E chiaro che si dovrebbe sempre avere un valore del livello di autofluorescenza come termine di paragone di ogni marcatura cellulare, utilizzando un campione non marcato che funge da controllo negativo; questo permette di capire quanto l autofluorescenza incide percentualmente sul valore dellʹintensità di fluorescenza da quantificare, prevedendo così il livello di errore, più o meno elevato, della misura stessa. Le fluorescenze che però interessano maggiormente il campo della citometria sono le cosiddette fluorescenze indotte o secondarie, a cui appartengono tutte le luminescenze. 15

16 Caratterizzazione dei fluorocromi Le attuali indagini, che utilizzano come strumentazione la citometria a flusso, sono sostanzialmente riconducibili a due tipi di tecniche: 1) l utilizzo di un fluorocromo coniugato ad anticorpo (Ab) per la valutazione di antigeni di interesse; 2) l utilizzo di un fluorocromo capace di legarsi agli acidi nucleici (DNA, RNA); 3) l utilizzo di un fluorocromo in grado di valutare la funzionalità cellulare. FLUOROCROMI CONIUGATI AD ANTICORPI La scoperta degli Anticorpi monoclonali (mab), capaci quindi di riconoscere un solo epitopo di uno specifico antigene (Ag), ha introdotto la CF in molti laboratori sia di ricerca che clinici, in particolare per la immunofenotipizzazione leucocitaria. Tra i fluorocromi che vengono coniugati a mab, il primo posto è sicuramente occupato dalla fluorescina isotiocianato (FITC). Esso stabilisce un legame covalente fra il radicale tiocianato ed il gruppo aminico primario che unisce stabilmente il fluorocromo alla struttura proteica. La FITC rappresenta uno dei fluorocromi più stabili, più economici, più facilmente coniugabili ed inoltre, presenta un basso peso molecolare, con conseguente basso rischio di impedimento sterico; presenta però problemi relativi alla stabilità dell emissione fluorescente in presenza di variazioni del ph, nonché il fenomeno del quenching in funzione del numero di molecole adese per mab. La sua stabilità permette di effettuare procedure di lavaggio importanti per eliminare le molecole FITC non legate che sono comunque fluorescenti, in modo da poter effettuare corrette analisi quantitative. L eccitazione avviene con la sorgente 488 nm del laser ad Argon, lo spettro di assorbimento è massimo intorno a 490 nm e l emissione è nel verde con massimo a nm. Un altra famiglia importante è quella delle rodamine a cui appartengono la sulforodamina 101 (SR101), con assorbimento massimo intorno a 596 ed emissione a 16

17 620nm, e la tetrametilrodamina isotiocianato (TRITC), con assorbimento massimo intorno a 550 nm ed emissione a 570nm. In particolare SR101 viene impiegata insieme a DAPI, con la singola eccitazione in UV, dove si è notato un miglioramento del CV del DNA rispetto alla misura effettuata con solo DAPI. Recentemente sono stati sviluppati alcuni derivati cumarinici fra cui la 7 amino cumarina (AMCA) ed il derivato maleimide DACM, caratteristici per le loro proprietà spettrofluorimetriche: ovvero dal grande assorbimento nell ultravioletto (UV). In particolare lʹamca viene utilizzata nel campo della ibridazione in situ in fluorescenza dove grazie alla sua efficacia e grande brillantezza, permette di rilevare marcature anche deboli. Il DACM invece ha grande affinità per i gruppi sulfidrilici SH (anziché per i gruppi aminici), ed è stato utilizzato prevalentemente per marcature citochimiche, come di proteine solforate, quali il glutatione, nelle applicazioni legate al suo ruolo verso i radicali liberi, ma anche per la determinazione della frazione proteica associata al nucleo caratterizzata da una più elevata componente proteica solforata. Un altro gruppo rappresentativo è quello dei derivati phyco, molecole di origine naturale, con proprietà molto interessanti per lʹapplicazione in fluorimetria ed in immunofluorescenza. Sono composti chiamati ʺphycobiliproteinsʺ, vengono estratti da alcune specie di alghe rosse e da alcuni batteri (in particolare dai cianobatteri) caratterizzati da un alta capacità di trasformare energia luminosa in metabolica. Hanno quindi un elevato Coefficiente di Estinzione ed elevata Efficienza Quantica (Rapporto tra Energia emessa/energia Incidente, rapporto fra i fotoni emessi e quelli assorbiti), elemento molto importante per una buona fluorescenza. I tre fluorocromi commerciali sono: ficoeritrina B (B PE), ficoeritrina R (R PE) e alloficocianina (APC). Come tutte le clorofille, le ficobiliproteine sono caratterizzate da un elevato peso molecolare, derivante dalla struttura organica molto complessa; inoltre, presentano spettri di assorbimento che vanno oltre 450 nm: I coniugati R PE hanno il picco di assorbimento intorno a 490 nm, idonei per essere 17

18 eccitati con laser ad Argon (488 nm); Il B PE, ha il massimo di eccitazione verso il verde, intorno a 530 nm, e si eccita quindi meglio in questa regione spettrale; L APC ha eccitazione spostata nella zona rossa dello spettro, con massimo intorno a 650 nm. PROBES ECCITAZIONE (nm) EMISSIONE (nm) FITC PE APC PerCP Cascade Blue Coumerin phalloidin Texas ReD Tetramethylrhodamine amines Cy3 (indotrimethinecyanines) Cy5 (indopentamethinecyanines) Cy7 (cyanine7) Come già detto più sopra la peculiarità di questi fluorocromi è quella di essere particolarmente efficienti in termini di emissione di fluorescenza; si vede quindi che la capacità di questi fluorocromi di assorbire luce è molto elevata rispetto alla FITC. Tuttavia lʹelevato peso molecolare limita notevolmente la coniugazione del fluorocromo allʹanticorpo da marcare e quindi fa si che si possano ottenere solo coniugati a basso valore di F/P (rapporto Fluorocromo/Proteina), mentre nel caso di FITC questo valore è sempre superiore a 1. Inoltre la reattività chimica, fa si che il procedimento di coniugazione (ad esempio ad anticorpi monoclonali) non sia così semplice e perfettamente riproducibile, come quello di FITC. 18

19 Rientrano in questo gruppo anche la famiglia delle cianine ed i fluorocromi tandem. Le cianine sono fluorocromi di sintesi concepiti per simulare le caratteristiche e soprattutto i vantaggi delle ficobiliproteine naturali. Costituiscono una serie, anchʹessa costituita da nomi commerciali es. Cy da 2 a 7 e sono caratterizzate da: un elevato assorbimento di luce specifico unitamente ad una buona efficienza quantica; spettri di assorbimento emissione più stretti delle molecole parentali naturali, ciò per poter offrire una migliore selettività delle emissioni e un minor riassorbimento reciproco quando vengono utilizzate in analisi multiparametrica (minor spillover di assorbimento); un elevata fotostabilità, non tanto per le applicazioni emergenti in citometria a flusso, ma sicuramente per quelle in FISH, per cui sono state quasi appositamente sviluppate, e lʹottima idrosolubilità. Purtroppo questi fattori sono mitigati dal costo elevato. I fluorocromi tandem sono generalmente costituiti da due molecole con proprietà fotofisiche complementari, atte a sfruttare il principio del trasferimento di energia dallʹuna (donatore) allʹaltra (accettore) (FRET), comportandosi come un unico fluorocromo. Si tratta dell unione covalente di due diversi fluorocromi in cui lo spettro di emissione del donatore corrisponde alla regione di eccitazione dell accettore. Generalmente vi è un fluorocromo PE che funge da donatore verso un accettore a cui è accoppiato; infatti la prima molecola tandem prodotta era composta da due ficobiliproteine, PE/APC, dove PE emette intorno a 570 nm, regione di eccitazione di APC, e si diseccita in modo non radiativo, trasferendo direttamente l energia all APC che viene conseguentemente eccitata. Questa coppia di fluorocromi non è stata mai commercializzata perché l APC era rieccitabile dal secondo laser, ma lo stesso principio è stato utilizzato per la sintesi di nuovi tandem, come PE/Texas Red, PE/Cy5 e PE/Cy7. Quest ultimo, recentemente prodotto, è più vantaggioso di PE/Cy5 (figura 2.8) perché non richiede compensazione con PE e può essere utilizzato nei sistemi dual laser senza problemi di compensazione interlaser, dato che assorbe attorno a 700 nm e non viene 19

20 eccitato dal laser secondario. Fig. 2.8 Principio dei fluorocromi Tandem PE: 1. PE viene eccitato da laser a 488nm ed attiva Cy5 per Energy Transfer (FRET); 2. Cy5 emette per FRET a 650nm, ma non emette se eccitata a 488nm; 3. PE teoricamente non emette luce se tutta la sua energia viene impiegata in FRET. Un problema dei fluorocromi tandem è la possibile rottura del legame covalente e perdita del secondo fluorocromo, con produzione di un segnale inappropriato da parte della PE residua. Inoltre, la Cy5 tende a legarsi selettivamente a particolari subset cellulari, come monociti, sottopopolazioni di B linfociti e a cellule morte. Il peridinin clorophylla protein (PerCP) è un tandem naturale in cui l energia viene trasferita dai cromofori della peridinina, un pigmento carotenoide, ai cromofori della clorofilla. Questa caratteristica conferisce al fluorocromo un elevato shift di Stoke, con un vasto spettro di eccitazione, tra 430 e 550 nm, ed un picco di emissione a 675 nm; però presenta una certa fotosensibilità, che ne limita l uso con potenze luminose elevate. 20

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