Esperimento RASTA Radiosensibilizzazione di cellule tumorali per adroterapia (Sezioni di Milano e Napoli, )

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1 Esperimento RASTA Radiosensibilizzazione di cellule tumorali per adroterapia (Sezioni di Milano e Napoli, ) 1

2 Motivazioni scientifiche - 1 Glioblastoma multiforme (GBM): - la più frequente (25%) neoplasia primaria del cervello; - incidenza annua: 2-3 nuovi casi ogni persone; - bassa curabilità: 10% di sopravvissuti dopo due anni. - radioresistenza, dovuta anche all elevata frazione di cellule ipossiche o necrotiche (proliferazione cellulare troppo rapida rispetto alla neo-vascolarizzazione). Risultati significativi ottenuti con RT tramite: - nuove modalità (RT stereotassica, iperfrazionata e accelerata, brachiterapia, radioimmunoterapia, radiochirurgia e BNTC) che consentono l incremento della dose al tumore fino a Gy [1]; Regione necrotica - agenti sistemici (radiosensibilizzanti) somministrati con varie modalità [2]. 1 - Pytel, P., Spectrum of pediatric gliomas: inplications for the dvolpement of future therapies. Expert Rev Anticancer Theor 7, S51- S60 (2007) 2 - Chang JE, et al.. Radiotherapy and radiosensitizers in the Treatment of glioblastoma multiforme. Clinical Advances in Hematology & Oncology 5, (2007) 2

3 Temozolomide (TMZ) Motivazioni scientifiche - 2 Questo agente alchilante, agendo direttamente sul DNA delle cellule tumorali attraverso metilazione delle basi, può aumentare la loro radiosensibilità impedendo la riparazione dei danni indotti dalle radiazioni. Studi in vitro [3, 4] e preclinici [5] in gliomi primari e ricorrenti hanno dimostrato attività additiva o sinergica in combinazione con la radioterapia convenzionale. 3 - van Rijn J, et al., Survival of human glioma cells treated with various combination of temozolomide and X-rays. Int J Radiation Oncology Biol Phys 47, (2000) 4 - Combs SE, et al., In vitro responsiveness of glioma cell lines to multimodality treatment with radiotherapy, temozolomide, and epidermal growth factor receptor inhibition with cetuximab. Int J Radiation Oncology Biol Phys 68, (2007) 5 - Stupp R, et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant Temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med 352, (2005) Date le caratteristiche radiobiologiche dei GBM (radioresistenza, alta percentuale di cellule ipossiche, localizzazione, ), l adroterapia potrebbe aumentarne la curabilità, specialmente in combinazione con radiosensibilizzanti. 3

4 Obiettivi Scopo del progetto è valutare in vitro l eventuale incremento della radiosensibilità di gliomi radioresistenti esposti a particelle cariche in presenza di radiosensibilizzanti. In particolare, linee cellulari di glioblastomi multiformi umani di differente radiosensibilità ai fotoni saranno esposte a protoni, ioni carbonio ed ossigeno nella regione del picco di Bragg, ed a raggi X come radiazione di riferimento. In parallelo, verranno saggiati gli effetti dei vari tipi di radiazioni associate al trattamento con dosi opportune di Temozolomide somministrate a e per tempi diversi prima e dopo l'irraggiamento. A tale scopo, saranno realizzate curve di inattivazione cellulare per calcolare i rapporti α/β (indice di radiosensibilità) delle varie linee cellulari, e saranno misurati gli RBE per l induzione d inattivazione cellulare, apoptosi e ritardo della crescita per i differenti ioni, in funzione del LET e della dose assorbita in combinazione con Temozolomide. 4

5 Attività prevista per il triennio Caratterizzazione delle linee cellulari ed analisi dell interazione con TMZ Quattro linee cellulari, tre (U87 MG, LN18 e LN 229) radioresistenti e una (U251 MG) radiosensibile ai fotoni, saranno caratterizzate tramite: - curve di crescita per stabilirne i parametri essenziali (tempo di duplicazione, densità di saturazione, ) realizzate con metodologie standard, - analisi di ciclo cellulare mediante citofluorimetria (FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting) 0 cgy 200 cgy FL2-PI FL2-PI 5

6 Attività prevista per il triennio Analisi dell interazione con TMZ La tossicità al TMZ sarà analizzata a differenti dosi (5 30 µm), tempi di aggiunta e incubazione (24-96 ore) di TMZ tramite: - saggio clonogenico, - saggio MTT (metodo colorimetrico che utilizza un sale [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium-bromide] che fa assumere alle cellule vive una colorazione gialla quando viene metabolizzato dai loro mitocondri. 6

7 Attività prevista per il triennio Irraggiamenti con raggi X, protoni, ioni carbonio, ioni ossigeno e fotoni ± TMZ Monostrati cellulari saranno esposti a dosi di Gy di raggi X e dei vari ioni e alle dosi e tempi di trattamento con TMZ che si sono rivelate più efficaci presso: - DSF-NA Macchina a raggi X da 300 kvp - INT-MI Acceleratore da15 MeV - LNS Ciclotrone Superconduttore: - H fino a 62 MeV (LET 1 kev/ µm) - 12 C fino a 80 MeV/amu (LET 40 kev/ µm) - 16 O fino a 80 MeV/amu (LET 50 kev/ µm) - LNL Van de Graaff CN da 7 MV: - H da 1 5 MeV (LET 25-8 kev/µm) - LNL Tandem e ALPI: - 12 C da 4 20 MeV/amu (LET kev/ µm) - CNAO Sincrotrone: - H da 270 MeV nel SOBP, - 12 C da 400 MeV/amu nel SOBP 7

8 Attività prevista per il triennio Analisi della radiosensibilità cellulare - Morte clonogenica radioindotta (NA + MI) misurata tramite saggio clonogenico - Apoptosi radioindotta (NA) misurata tramite: - analisi al citofluorimetro, - saggio dell Annexina V, - misura dell attività delle caspasi tramite Western blotting. - Ritardo della crescita (MI) misurata tramite: - analisi citofluorimetrica del ciclo cellulare, - incorporazione della bromodeossiuridina.

9 1 semestre Caratterizzazione delle linee cellulari. Milestones per il Analisi della tossicità del TMZ ed ottimizzazione delle dosi e dei tempi di esposizione. - Messa a punto dei protocolli di irraggiamento e delle facilitiy c/o LNL e LNS. - Scelta delle condizioni di crescita in cui effettuare gli irraggiamenti con ioni. - Primi irraggiamenti con raggi X a Napoli e a Milano per morte clonogenica ± TMZ. 2 semestre Irraggiamenti con raggi X a Napoli e a Milano per morte clonogenica, apoptosi, ritardo della crescita ± TMZ - Analisi dati irraggiamenti con raggi X - Due turni di irraggiamento con ioni 12 C c/o LNL per morte clonogenica ± TMZ. 9

10 Richieste finanziarie Napoli per il Consumo Materiale monouso e terreni per colture cellulari fiasche, capsule, provette, pipette, puntali, sistemi filtrazione, terreni per colture cellulari, soluzioni saline, reagenti chimici, kit filtri per sistema purificazione acqua, bombole CO2. Prodotti chimici per saggi funzionali TMZ, soluzioni per FACS, anticorpi per Western blotting. - Missioni interne Totale Due persone per due turni (~7 giorni/turno) per anno (c/o LNL) Due persone per due turni (~7 giorni/turno) per anno (c/o LNS) Un congresso nazionale, riunioni della collaborazione Missioni estere Totale Un congresso internazionale (per 2 persone) Totale Napoli

11 - Consumo Richieste finanziarie Milano per il 2009 Materiale monouso e terreni per colture cellulari fiasche, capsule, provette, pipette, puntali, sistemi filtrazione, terreni per colture cellulari, soluzioni saline, reagenti chimici, kit filtri per sistema purificazione acqua, bombole CO2. Prodotti chimici per saggi funzionali TMZ, soluzioni per FACS, bromodeossiuridina. Totale Missioni interne Due persone per due turni (~7 giorni/turno) per anno (c/o LNL) Due persone per due turni (~7 giorni/turno) per anno (c/o LNS) Un congresso nazionale, riunioni della collaborazione Missioni estere Totale Un congresso internazionale (per 2 persone) Totale Milano Totale esperimento (NA + MI)

12 Dettaglio materiale di consumo NA - Materiale monouso e terreni per colture cellulari Esperimenti di inattivazione cellulare con e senza chemioterapico per 4 linee cellulari 240 fiasche T25 (6 curve dose-effetto con raggi X) x 4 linee cellulari 600 x ml terreno completo (siero fetale, antibiotici, ecc.ecc) x 4 linee cellulari 600 x Reagenti (tripsina-edta, PBS, alcol etilico 70%, colorante GIEMSA) x 4 linee cellulari 200 x fiasche T75, tubi Falcon 15 ml, pipette 1, 2, 0, 25 ml, puntali Gilson 100 µl e 1 ml sistemi filtrazione, kit filtri per sistema purificazione acqua bombole CO Prodotti chimici per saggi funzionali TMZ Saggio MTT (Spettrofotometro tipo FLX800 Biotek Instruments Cell titre EPUS aqueus one solution Promega 96 well plates (circa circa 100 euro /100 pezzi/ 100 experiments) Esperimenti di Analisi al Citofluorimetro BD FACSCalibur Provette BD Falcon cat n , Soluzioni: BD FACS f low cat n BD Facs Rinse cat n SIGMA Propidium iodide P mg Saggio dell Annexina V Soluzioni e coloranti Saggio Western blotting per misurare l attività delle caspasi Caspase Detection Kit FITC-VAD-FMK (Calbiochem, Merk) per 100 assays Anticorpi anti PARP-1 - Cell signaling, Anticorpi anti Caspase 3 - Cell signaling Anticorpi Caspase 7 Santa Cruz Anticorpi anti cleaved Caspase 3 - Cell signaling Anticorpi anti cleaved Caspase 7 - Cell signaling Anti rabbit polyclonal antibody Acrilammide/Bis acrilamide

13 Dettaglio materiale di consumo MI - Materiale monouso e terreni per colture cellulari Esperimenti di inattivazione cellulare con e senza chemioterapico per 4 linee cellulari 240 fiasche T25 (6 curve dose-effetto con raggi X) x 4 linee cellulari 600 x ml terreno completo (siero fetale, antibiotici, ecc.ecc) x 4 linee cellulari 600 x Reagenti (tripsina-edta, PBS, alcol etilico 70%, colorante GIEMSA) x 4 linee cellulari 200 x fiasche T75, tubi Falcon 15 ml, pipette 1, 2, 0, 25 ml, puntali Gilson 100 ml e 1 ml sistemi filtrazione, kit filtri per sistema purificazione acqua bombole CO Prodotti chimici per saggi funzionali TMZ Analisi citofluortimetricvadel ciclo cellulare (FACS) Soluzioni, coloranti Saggio della bromodeoxiuridina Coloranti vari

14 Dettaglio missioni (NA e MI) - Missioni interne Due persone per due turni (~7 giorni/turno) per anno (c/o LNL) Attività turno 1 giorno: viaggio andata, semina cellule nei portac ampioni 2 giorno: messa a punto facility, dosimetria del fa scio, 3 giorno: irraggiamento, preparazione campioni per morte clonogenica 4 giorno: preparazione campioni per apoptosi e rita rdo della crescita 5 giorno: preparazione campioni per apoptosi e rita rdo della crescita 6 giorno: preparazione campioni per apoptosi e rita rdo della crescita 7 giorno: viaggio ritorno Costo Turno Viaggio per persona 250 Mangiare al giorno per persona 70 Pernottamento 0 Turno di 7 giorni per persona persone per 7 giorni (per Sezione) turni / anno Due persone per due turni (~7 giorni/turno) per anno (c/o LNS) Come sopra Un congresso nazionale, riunioni della collaborazione Totale Missioni estere Un congresso internazionale (per 2 persone) 4.000

15 Sezione di Napoli Partecipanti FTE 2009: 5.1 anni Grossi Gianfranco, PO Università Federico II, Napoli (Responsabile) 60% Gialanella Giancarlo, PO - Università Federico II, Napoli 30% Indovina Pietro Luigi, PO - Università Federico II, Napoli 20% Manti Lorenzo, RU - Università Federico II, Napoli 40% Massa Rita, PA - Università Federico II, Napoli 50% Scampoli Paola, PA - Università Federico II, Napoli 20% de Franciscis Vittorio, DR - CNR, Napoli 40% La Mantia Girolama, PO - Università Federico II, Napoli 40% Vivo Maria, Tecnico laureato - Università Federico II, Napoli 40% Pollice Alessandra, RU - Università Federico II, Napoli 40% Famà Lia, specializzanda - Università Federico II, Napoli 100% Santini Maria Teresa, R - Istituto Superiore di Sanità, Roma 30% Sezione di Milano FTE 2009: 3.6 anni Bettega Daniela, PA - Università, Milano (Responsabile) 100% Calzolari Paola, EP - Università, Milano 100% Catalano Maddalena, assegnista - Università, Milano 100% Ubezio Paolo, R - Istituto Mario Negri, Milano 30% Lupi Monica, R - Istituto Mario Negri, Milano 30% 15

16 Metodiche ed altro 16

17 L efficacia biologica relativa di una data radiazione è data dal rapporto tra la dose assorbita di una radiazione di riferimento D X (raggi X o γ) e quella D particle di una particolare radiazione sotto esame che è richiesta per avere lo stesso livello di effetto. Efficacia biologica relativa (RBE) 17

18 Definizione di OER Se durante l irraggiamento, o entro pochi millisecondi dalla sua fine, è presente ossigeno nelle cellule irraggiate, si ha un aumento dell efficacia della radiazione definito OER (Oxygen Enhancement Ratio) e fornito dalla relazione: OER = (Dose in condizioni ipossiche / Dose in aria)isoeffetto 18

19 Molecular interpretation of Oxygen Effec Effetto ossigeno vs. LET In figure, measurements were made with cultured cells of human origin. Closed circles refer to monoenergetic charged particles, the open triangle to 250-kVp X-rays with an assumed track average linear energy transfer of 1.3 kev/µm. 19

20 Curva di crescita Semilog plot of the increase in cell concentration (left axis) and cell density (right axis) following subculture, from cultures sampled daily and counted. It should be possible to draw a straight line through the partof the plot that represents the exponential phase and derive the population-doubling time (PDT) from the middle region of this best-fit line. (Freshney, Fig. 20.4) 20

21 Morte clonogenica: un esempio In figure, examples of pedigrees of EMT6 mouse cells. (a) In the absence of irradiation, the cell divides giving rise to a clone. The length of each cell cycle is indicated, about 10 h. (b) After irradiation (in this example: 8 Gy), the cells are killed, that is to say they have lost their reproductive capacity. In certain cases (near the bottom) pyknosis and lysis of the cell occurs at the first mitosis. In other cases (above) the daughter cells are still able to divide a few times before lysis. In a few cases fusion of cells occurs before disintegration ( ). These pedigrees were obtained by microcinematography. (M. Tubiana, An Introduction to Radiobiology, p. 87) 21

22 Curve di inattivazione (SV) Andamento lineare-quadratico del tipo: SF = exp( (αd + βd 2 )) La curvatura iniziale è determinata da α, la componente quadratica β causa invece la curvatura ad alte dosi Il rapporto α/β rappresenta la dose per cui sono uguali le componenti lineare e quadratica. (.. Tubiana, An Introduction to Radiobiology, p...)???

23 Radiosensibilità cellulare vs. LET (Tubiana, An Introduction to Radiobiology,) 23

24 MTT assay This test is a quantitative colorimetric method to determine cell proliferation. It utilizes the yellow tetrazolium salt [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium-bromide] which is metabolized by mitochondrial succinic dehydrogenase activity of proliferating cells to yield a purple formazan reaction product. Cells do not require functional mitochondria as demonstrated by the observation that no differences are observed in formazan production by normal cells or respiratory-defective cells in which mitochondria have been poisoned by the nucleic acid toxin, ethidium bromide. Both serum and plasma from a variety of species, non-specifically reduce both MTT and XTT tetrazolium salts to a colored formazan product. This effect appears to be particularly pronounced with fetal bovine serum. 24

25 Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) To separate a subpopulation of cells, you could do so by tagging those of interest with an antibody linked to a fluorescent dye. The antibody is bound to a protein that is uniquely expressed in the cells you want to separate. The laser light excites the dye which emits a color of light that is detected by the photomultiplier tube, or light detector. By collecting the information from the light (scatter and fluorescence) a computer can determine which cells are to be separated and collected. Diagram of FACS machine. Cells have been fluorescently tagged with either red or green antibodies, though not every cell expresses the epitope and therefore 25some are not tagged either color.

26 Annexin V Assay Il saggio della annessina fluoresceinata serve per quantificare la percentuale di cellule apoptotiche in una data popolazione cellulare, sfruttando il verificarsi di cambiamenti nella struttura della membrana cellulare nei primissimi stadi del processo apoptotico: sulla superficie della membrana diventa accessibile la fosfatidilserina, a causa del flipflop del doppio strato lipidico. L annescina vi si lega rendendo possibile la identificazione delle cellule apoptotiche se analizzate mediante citometria di flusso (FACScan), mentre l aggiunta di propidio di ioduro, che si incorpora nelle cellule necrotiche ma non nelle apoptotiche, ne rende possibile la distinzione. Sotto è riportato un esempio di output di analisi: sulle ordinate vi è la fluorescenza dovuta all incorporazione del propidio, mentre sulle ascisse quella dovuta all annessina. Il primo quadrante (in basso a sinistra) rappresentando le cellule vitali. Il quadrante in basso a destra mostra le cellule positive all annessina ma negative al propidio, pertanto in fase apoptotica, mentre quello in alto a sinistra rappresenta la frazione di cellule necrotiche. Alla fine, cellule in tarda apoptosi diventano positive per entrambi i marcatori (quadrante in alto a destra). 26

27 Come si studia l apoptosi: attivazione delle caspasi Synthetic fluorogenic substrates Western blots of pro-caspases/caspases Western blots of caspase substrates PARP, DNA-PKcs, etc. CAD/DFF45 BCL-2 lamins In figure, caspase-9 activation by 1 GeV/amu Fe ions Time dependence Fluence dependence Relative Fluorescence Caspase-9 Activity BNL-8 TK6 1 GeV Fe 0 cgy 94.5 cgy 189 cgy Hour Post Irradiation

28 Dopo il taglio enzimatico del peptide substrato da parte della caspasi-3/7, la rodamina 110 sviluppa fluorescenza quando viene eccitata ad una lunghezza d onda di 499 nm e la quantità di fluorescenza prodotta è proporzionale alla quantità di caspasi-3/7 presente nel campione. I campioni di partenza possono essere frazioni enzimatiche, estratti cellulari o cellule in coltura. Il saggio è sensibile (bastano poche centinaia di cellule per pozzetto di micropiastra dopo una sola ora di reazione) e la sensibilità inoltre aumenta all aumentare del tempo di incubazione. Saggio delle caspasi 28

29 Curve di Bragg per alcuni ioni

30 Bromodeossiurudina (BrdU) assay L incorporazione differenziata della BrdU è dovuta alla replicazione semi-conservativa della doppia elica del DNA per cui è possibile differenziare le cellule che sono in prima, seconda o terza mitosi. Le cellule vengono incubate in presenza di questo analogo delle basi del DNA e lasciate proliferare fino a 72 h. Le cellule in prima mitosi mostreranno cromosomi i cui bracci appaiono della stessa intensità di fluorescenza se osservati al microscopio dopo opportuno trattamento che prevede, tra l altro, quencing con raggi UV del fluorocromo coniugato alla BrdU; quelle in seconda presenteranno cromosomi i cui bracci sono uno più brillante dell altro, mentre quelle in terza o successive mitosi esibiranno una colorazione mista (harlequin staining). In questo modo è possibile avere informazioni sull eventuale ritardo nella crescita di una popolazione cellulare di cui si conosca il tempo medio di duplicazione. 30

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