Utilità e limiti della citofluorimetria in Anatomia Patologica: la quantificazione del contenuto in DNA

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1 Confederazione Italiana Tecnici di Laboratorio Biomedico ASSOCIAZIONE ITALIANA TECNICI DI LABORATORIO Utilità e limiti della citofluorimetria in Anatomia Patologica: la quantificazione del contenuto in DNA Moris Cadei Laboratorio di Citofluorimetria e Microscopia Quantitativa Anatomia Patologica Università degli Studi di Brescia

2 Un po di storia. I coloranti sintetici e Paul Ehrlich La colorazione del DNA (Reazione di Feulgen) Lo sviluppo delle tecniche di quantificazione

3 Reazione di Feulgen E una colorazione specifica che permette di colorare i nuclei delle cellule e di evidenziare il DNA su campioni citologici e istologici. Il principio metodologico della reazione si basa sull idrolisi acida che viene effettuata dall Acido Cloridrico che separa dalla molecola del Dna le basi puriniche. Il deossiribosio libero in ambiente acido si trasforma in aldeide ed i gruppi aldeidici sono quindi evidenziabili con l uso del Reattivo di Schiff.

4 Colorazione di Feulgen Reattivo di Schiff E una leucofucsina (acido bis-n-aminosolfonico) che colora in rosso i gruppi aldeidici liberati dall idrolisi acida.

5 Risultato della reazione Reazione Stechiometrica

6 2 Aprile 1953 Circa 10 anni dopo

7 Citometria Statica (CS) E una tecnica che si basa sull analisi di elementi cellulari (cellule o tessuti) depositati su vetrino e selezionati dall operatore che intende effettuare la quantificazione.

8 Microscopio ottico dotato di telecamera L immagine fornita da un microscopio ottico, modificato in modo tale da fornire una visione reale e fortemente ingrandita del campione in esame, è inviata da una telecamera ad un computer.

9 Il PC provvede a visualizzarla su un monitor grafico ad alta risoluzione. L immagine viene analizzata con un software dedicato che permette la valutazione di elementi geometrici quali la misura dell area e del diametro cellulare o di parametri di quantificazione (DNA, proteine).

10 Densità Ottica Integrata (D.O.I) Le immagini digitali possono subire un processo di elaborazione volto a manipolare l immagine stessa secondo le caratteristiche desiderate. La modificazione delle immagini digitali attraverso programmi dedicati può essere una forma semplice di editing o fotoritocco (photoshop) oppure una analisi di quantificazione dell immagine. Programmi di quantificazione del DNA

11 Aspetto morfologico e aspetto biologico

12 Il Contenuto in DNA in Citometria Statica Campione citologico normale Controllo Diploide

13 Campione citologico neoplastico Profilo Diploide Profilo Aneuploide

14 La citometria a flusso nasce in Anatomia Patologica Citologia e Istologia (istochimica) Alterazioni morfologiche Diagnostica (soggettiva) Contenuto nucleare di DNA Diploidia (normalità) Anomalie di contenuto (aneuploidie) Diagnostica (oggettiva) CITOMETRIA A FLUSSO.MEZZO SECOLO DOPO. G. Mazzini Istituto di Genetica Molecolare CNR. Sez. Istochimica e Citometria, Pavia

15 Hemalog D Technicon - Hemalog D first commercial differential flow cytometer - light scatter and absorption at different wavelengths - chromogenic enzyme substrates were used to identify neutrophils and eosinophils by peroxidase and monocytes by esterase, basophils were identified by the presence of glycosaminoglycans using Alcian Blue - the excitation for all measurements was a tungsten-halogen lamp Image from Shapiro Practical Flow Cytometry, 3rd Ed. Wiley-Liss, 1994

16 Wallace H. Coulter (1953) Durante il 1949 inventò una macchina che mise in atto la sua teoria (Principio di Coulter) con cui sosteneva che una carica elettrica poteva essere usata per determinare la grandezza e il numero di un dato tipo di particelle microscopiche in un fluido. La soluzione da studiare veniva aspirata con una pompa da vuoto attraverso un tubo carico elettricamente con un piccolissimo foro alla fine. Passando attraverso il foro, ogni particella all interno della soluzione bloccava il campo elettrico per un attimo. La forza e la frequenza della distorsione del voltaggio poteva essere abbinata a specifici tipi e numeri di particelle.

17 Principio di Coulter

18 Dagli occhi al laser Anni Citometria Statica Citometria a Flusso

19 Un impulso decisivo al passaggio dalla citometriastatica a quella a flusso èstato dato dall utilizzo dei fluorocromi Sostanze che si legano alle strutture cellulari in modo covalente (FITC) e non covalente (IODURO DI PROPIDIO E BROMURO DI ETIDIO).

20

21 Citometria a Flusso E una tecnica che si basa sull analisi di elementi cellulari sospesi in un mezzo fluido che vengono acquisiti attraverso un complesso sistema ottico e fluidico.

22 Nel citofluorimetro devo avere il materiale in sospensione

23 Analisi del Ciclo cellulare G0-G1 Dipl. S G2-m G0-G1 Dipl. G0-G1 Aneupl. Istogramma monoparametrico

24 Indice di DNA (D.I.) Diploidi Aneuploidi Contenuto di DNA normale Contenuto di DNA anormale

25 Correlazione tra Ploidia e Cariotipo Profilo Diploide G0-G1 S G2-m

26 Correlazione tra Ploidia e Cariotipo Profilo Aneuploide G0-G1 G0-G1 Aneupl.

27 Quale campione e perché Fresco Congelato Incluso Estemporanea Congelato a 80 C Fissato in formalina ed incluso in paraffina

28 Il campione fresco può essere immediatamente frammentato e filtrato per la preparazione della sospensione cellulare o si può trattare con scraping che dopo la procedura di filtrazione offre un campione citologico pronto da colorare e leggere.

29 Il prelievo sul campione a fresco (scraping)

30 Il prelievo sul campione congelato Archivio conservato a 80 C Singolo frammento di tessuto

31 Metodo di estrazione del DNA - disaggregare il frammento neoplastico con bisturi in PBS a ph 7,4 - filtrare la sospensione con filtri di nylon da 50 micron in provette immerse in ghiaccio - centrifugare a 2000 rpm per 10 minuti - risospendere il pellet nella soluzione per isolare i nuclei TRIS-HCl-EDTA - colorare in rapporto 1:1 con miscela di colorazione DAPI/Sr101 o IP/Fitc - leggere al citofluorimetro

32 Quale campione e perché Fresco Congelato Incluso Fissato in formalina ed incluso in paraffina

33 Metodo di estrazione del DNA Hedley DW et al. Method for analysis of cellular DNA content of paraffin-embedded pathological material using flow cytometry J. Histochem Cytochem 31: , 1983

34 Sparaffinatura e trattamento enzimatico Xilolo Alcool 100 Alcool 95 Alcool 70 Alcool 50 Acqua Pepsina 0.25 % in Hcl 0,1 N a 37 C

35 La selezione dell area da analizzare

36 La re-inclusione e l analisi al citofluorimetro Diploide Aneuploide

37 Campione incluso in paraffina - Fissazione in formalina - Buona qualità del campione Scarsa qualità del campione

38 a Fissazione in formalina: inclusione in paraffina buona (a) e scadente (b) b

39 Non risultano idonei per questo tipo di analisi quei tessuti trattati con fissativi acidi contenenti sostanze quali acido acetico e acido picrico. HOLLANDE BOUIN

40 Analisi citofluorimetrica del DNA Formalina B5 Holland Bouin

41 Ioduro di Propidio (PI)

42 2,6 Diamidiniofenilindolo (Dapi)

43 Pbs Pbs Tris-HCl Tris-HCl

44 Near-Diploide D.I. = 1,15 Interpretazione degli Istogrammi Poliploide D.I. = 1,41 D.I. = 1,75 Ipertetraploide D.I. = 2,2 Picco G0-G1 aneuploide D.I.: Picco G0-G1 diploide

45 La Citofluorimetria del DNA nei tumori solidi della mammella Si è ipotizzato che questa tecnica potesse profilarsi come una procedura di completamento di quei parametri biologici che venivano routinariamente eseguiti per integrare la diagnosi istocitopatologica (assetto estroprogestestinico e proliferativo).

46 Congelato Incluso in paraffina aneuploide D.I.= 1,49 aneuploide D.I.= 1,50

47 Valori % delle differenti fasi del ciclo cellulare La fase S

48 Parametri tradizionali della diagnostica mammaria Tumor size Nodal status Sentinel Lynphadenectomy Histologic type Histologic grade Mitotic figure count Hormone receptor status

49 Determinazione dei recettori estro-progestinici

50 La determinazione della positività al KI-67 per lo studio delle proliferazione cellulare

51 La positività all anticorpo Ki-67 è espressa da tutte le fasi del ciclo cellulare ad eccezione della fase G 0

52

53 E un parametro affidabile e riproducibile MIB ER A

54 La distribuzione della ploidia nei tumori solidi Tessuto Mammella Colon Vescica Polmone Prostata % Aneuploidia 71 % 39 % 85 % 84 % 55 %

55 La probabilità di sopravvivenza libera da malattia delle pazienti con tumore diploide e bassa S-phase è significativamente più alta rispetto a quella delle pazienti il cui tumore è diploide e ad alta S-phase o aneuploide. La elevata frazione di crescita (Sphase) è un importante fattore prognostico negativo nei tumori diploidi. Clark et al., N England J Med, 1989

56 L utilità pratica dimostrata a livello di pubblicazioni scientifiche DNA ploidy and DNA indices are important prognostic factors for malignant epithelial ovarian tumors Gynecol Obstret Invest 2001 Gynecol Oncol 2002 The rusults suggest that DNA ploidy status is important in determining the biological behaviour of rectal carcinoma Anticancer Res 2002

57 Una importante ipotesi di lavoro G0-G1 G0-G1 G0-G1 Aneupl. S G2-m S Marker biologico con possibile significato prognostico e terapeutico

58 Misurazioni citofluorimetriche ANNI

59 Carcinomi della mammella ANNO CARCINOMI REFERTI

60

61 Review 2002 Flow cytometry of human solid tumor: clinical and research application W.E. Corver and C.J. Cornelisse

62 Un nuovo parametro prognostico e terapeutico College of American Pathologists Conference XXXV June 10-13,1999

63 Category I II III Prognostic factors Tumor size, nodal status, sentinel Lymphadenectomy, histologic grade, histologic type, mitotic figure count. C-erbB-2, p53, lymphatic or vascular channel invasion, MIB-1, DNA analysis: phase fraction. DNA Ploidy analysis, tumor angiogenesis, epidermal growth factor receptor, transforming growth factor-α (bcl-2, ps2, cathepsin D).

64 Slamon DJ et al Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of HER-2/neu oncogene Science 235: L importanza di HER-2 nel carcinoma mammario non sia limitata alla determinazione della prognosi, indicando l esistenza di un ruolo predittivo nonché la possibilità concreta di utilizzarlo come target terapeutico.

65 Target Therapy Farmaci a bersaglio molecolare

66 Uno dei primi campioni analizzati in Anatomia Patologica (1993) Partec CAII

67 2011

68 TECNICI DI LABORATORIO BIOMEDICO Confederazione Italiana Tecnici di Laboratorio Biomedico Grazie a tutti voi per l attenzione e la pazienza!!!!

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