Ataxia-Telangiectasia (AT) e Fosfatidil Inositol-3-Cinasi (PI3K)

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1 Ataxia-Telangiectasia (AT) e Fosfatidil Inositol-3-Cinasi (PI3K) Vedi Curr.Biol. 5(11)1210(1995); TIBS, 20(10)431(1995) Esiste una grave malattia ereditaria nell uomo di tipo autosomico recessivo, l Ataxia (scoordinamento dei movimenti) Telangiectasia (dilatazione dei vasi sanguigni). A livello cellulare l AT è caratterizzata da un elevato grado d instabilità dei cromosomi e ad ipersensibilità alle radiazioni ionizzanti. Ovvero sono compromessi i meccanismi che normalmente presiedono al riparo dei danni al DNA, e le cellule AT sono mancanti di un prodotto genico che partecipa ai checkpoints del ciclo cellulare. Più in generale possiamo ricordare che normalmente una cellula con DNA danneggiato non entra in fase S, ovvero non supera il checkpoint tra fase G-1 e S (anche tra G-2 ed M). Spesso si osserva rallentamento della crescita in attesa che il DNA sia riparato, oppure la cellula sceglie la strada dell apoptosi, ovvero si autoelimina impedendo così in modo radicale di avere progenie, e di trasmettere a tale progenie un corredo genetico alterato. Nei soggetti AT sono compromessi tali meccanismi di controllo, e quindi sono molto più esposti all insorgenza di tumori (circa 100 volte di più). L omozigote è alquanto raro (1 su ), mentre l eterozigote è circa l 1% della popolazione; anche l eterozigote è più esposto all insorgenza di tumori. E stato verificato, per esempio, che il 9 % dei tumori al seno possono essere di soggetti eterozigoti per AT. Recentemente Savitsky (Science, 268, 1749, 1995) ha identificato il gene Mutato nei soggetti AT (gene ATM): questo gene codifica per una proteina che al C-terminale presenta una buona omologia con la subunità 110 della PI3K. ATM umana Adiacente PI3K AA Subunità p110 della PI3K-bovina PI3K AA 24/51 La zona PI3K al C- terminale della PI3K, subunità p-110 bovina, ha un 24 % d identità con la corrispondente zona al C-terminale dell ATM (ovvero del gene che codifica per ATM). L omologia di sequenza è del 51 %. Esistono almeno altre 7 proteine piuttosto simili all ATM, che sono state identificate in Drosophila, Lieviti ed uomo: tali proteine contengono anche il dominio adiacente (citiamo MEI-41, rad-3 e la subunità catalitica della proteina cinasi dipendente da DNA: DNA-PK cs). Denominiamo tali proteine simili all ATM. Esistono poi almeno altre 5 proteine simili all p110 della PI3K, non contengono cioè il dominio adiacente. Il dominio PI3K è formata da circa 400 AA. Tutte queste proteine (simili all ATM e simili alla PI3K), appartengono alla grande famiglia della PI3K. Queste sono le informazioni strutturali. Circa le probabili funzioni occorre ricordare a grandi linee i meccanismi di controllo del ciclo cellulare e di apoptosi. 219

2 Dopo esposizione a radiazioni ionizzanti le cellule presentano un forte aumento della concentrazione della proteina p53, definita soppressore di tumori (vedi pag.46). Esiste nell uomo la malattia di Li-Fraumeni caratterizzata da assenza di p-53. Le cellule dei soggetti affetti da Li- Fraumeni, dopo esposizione a radiazioni ionizzanti non arrestano in G-1 e non vanno in apoptosi. Nelle cellule normali, invece, la concentrazione di p-53 aumenta per esposizione a radiazioni; comunque normalmente la p-53 aumenta in seguito a danno al DNA. Importante per i livelli di p-53 è Mdm2 (vedi pag.227) La p-53 si lega al DNA e vengono trascritti alcuni geni che codificano per proteine implicate nel ciclo cellulare. Si ha trascrizione del gene per p21 Cip1. Questo mrna, codificante per Cip1 viene quindi tradotto e si ha sintesi della proteina Cip-1 di peso molecolare Da. p-53 induce anche la sintesi di Mdm2 (vedi pag.227). Occorre ricordare il meccanismo del MPF, ovvero dei complessi ciclina/cdc-2 (vedi pagg.127 e seguenti). In sostanza la proteina cinasi (la CdK-2) (Cdc = Ciclo di Divisione Cellulare e Cdk = Cicline dipendent Kinase sono sinonimi) è sempre la stessa, ed è il legame alla ciclina che conferisce specificità alla CdK stessa. La fase M è caratterizzata dal legame alla ciclina -B. Le cicline costituiscono una famiglia alquanto numerosa, ma si ritiene che la ciclina -E controlli la transizione dalla fase G1 alla S e che la ciclina-a controlli la continuazione della fase S. La ciclina- D si lega alla Cdk-4 (in realtà la Cdk non è una sola) e promuove la progressione in fase G-1. La p21 Cip1 inibisce l attività enzimatica ser/thr proteina cinasica dei complessi Cdk/cicline, in particolare i complessi con le cicline E e D, per cui la cellula non entra in fase S o, comunque, è ostacolata la progressione in fase G-1. Questo è il meccanismo largamente accettato di un tipo di checkpoint del ciclo cellulare. Ma non è l unico. Quali proteine sono fosforilate di norma dai complessi Cdk-ciclina? Nel capitolo sulle proprietà biochimiche della Cdc-2, si era visto che esisteva tutta un ampia gamma di substrati fosforilabili con la comune sequenza consenso Ser-Pro- X - Lys/Arg (vedi pag.130). Tali substrati erano, in qualche modo, modificati nella loro funzione con l obiettivo di portare avanti la mitosi. Viceversa nelle fasi che precedono la mitosi le Cdk-ciclina D e Cdk-ciclina E sono in grado di fosforilare altri tipi di substrati, tra i quali svolge un ruolo fondamentale la proteina RB (Retino Blastoma, proteina di PM compromessa in un tumore della retina; RB è un soppressore di tumori). La RB è di norma de-fosforillata e complessata alla proteina E2F, che è un fattore di trascrizione. La proteina RB può essere fosforilata in due siti dai complessi Cdk-ciclina D o E e tale fosforilazione promuove la dissociazione del complesso tra RB e la proteina E2F che, essendo un fattore di trascrizione, va su specifiche sequenze del DNA e con la partecipazione di altre proteine vengono trascritti geni che sono specifici di certe fasi del ciclo cellulare. L aumento di p53 avviene anche con cellule trattate con un inibitore della sintesi dei nucleotidi pirimidinici. 220

3 Tale versatile inibitore è il PALA, N-Phospho Acetyl-L-Aspartato. Tale composto mima l intermedio dello stato di transizione del ciclo catalitico dell enzima aspartico trascarbamilasi (che è quindi fortemente inibito), ma inibisce anche la sintesi del Carbamil-fosfato (substrato dell Aspartico Trascarbamilasi) e la reazione catalizzata dall enzima diidro-orotasi (che segue immediatamente la reazione dell aspartico trascarbamilasi). Quindi con PALA risultano bloccate le prime tre tappe che portano alla sintesi dell UMP. Cellule trattate in coltura con PALA arrestano la crescita, permanendo in G-1, e presentano livelli aumentati di p53. Per rimozione del PALA si ha ripresa del ciclo cellulare e proliferazione. Da osservare che nelle cellule trattate con PALA si poteva osservare nessun danno al DNA. Quindi la p53 può anche aumentare per arresto della sintesi di DNA ed anche di RNA (sintesi ovviamente impossibili in mancanza di nucleotidi pirimidinici, la cui biosintesi è bloccata dal PALA). Quindi nello schema della pagina precedente è riportato che l aumento di p53 può essere dovuto anche alla compromessa trascrizione (per mancanza dei substrati nucleotidici, che di fatto vengono a mancare nelle cellule trattate con l inibitore della loro biosintesi). Se il danno è più grave la p53 può portare alla trascrizione del gene BAX, che avvia la cellula all importante e radicale rimozione della cellula stessa (apoptosi, vedi pag.46). Bcl-2 contrasta BAX (vedi pag.50). Interazioni di ATM Nel paragrafo precedente sono illustrate a grandi linee le principali tappe che regolano il ciclo cellulare, ed il ruolo centrale delle proteine soppressori di tumori (p53 e RB). La proteina espressa dal gene ATM, che come abbiamo detto ha omologia di sequenza con l enzima PI3K, è simile ad altre proteine che partecipano in qualche modo al ciclo cellulare. Poiché tali proteine omologhe, in particolare quelle del gruppo simili all ATM, che hanno cioè anche il dominio adiacente, sono state studiate a fondo, specialmente nei lieviti (come Rad3 e Mec1), è possibile estrapolare all ATM le informazioni ottenute con tale numeroso gruppo di proteine regolatrici. Mutanti in Rac3 e Mec1 sono sensibili alle radiazioni ionizzanti, ed in essi non si verificano i tipici arresti per checkpoint. Tra le altre proteine simili all ATM occorre ricordare una proteina cinasi dipendente da DNA (DNA- PK). Non se ne è parlato quando abbiamo trattato tutte le proteine cinasi, ed è una proteina cinasi con proprietà particolari. La DNA-PK è una ser-thr proteina cinasi nucleare che ha la proprietà di essere attiva quando è legata al DNA a doppia elica. E formata da una subunità catalitica di più elevato peso molecolare e da una subunità che la indirizza al sito di azione denominata Ku (ne esistono più forme, di P.M. 70 ed 80). Tale DNA-PK fosforila fattori di trascrizione, ma anche proteine che potrebbero essere implicate nella riparazione del DNA. E stato dimostrato che la DNA-PK fosforila la p-53. Questa è una osservazione importantissima per le ipotesi relative al meccanismo di azione dell ATM (vedi dopo). Esistono diverse analogie tra PI3K e proteine simili all ATM. Ricordiamoci che l omologia della sequenza proteica è nell ambito della subunità catalitica della PI3K (la 110) e, come la 110 della PI3K si lega ad un altra subunità (la p85) che indirizza la 110 stessa sulle tirosine (solo se sono fosforilate) dei recettori, anche la DNA-PK è pilotata al suo sito d azione dalla subunità Ku. Si pensa che anche l ATM possa partecipare a processi simili a quelli espressi dalldna-pk. A questo punto possiamo domandarci quale è la funzione della proteina codificata da ATM. Alcuni ricercatori sostengono che tale prodotto di espressione potrebbe essere una proteina cinasi come la DNA-PK e quindi non una cinasi dei fosfoinositidi, come la PI3K. In realtà occorre precisare che per la PI3K è stata trovata una funzione certa, ovvero la fosforilazione in posizione 3 dell anello dell inositolo del Fosfatidil-Inositolo-4,5-bis, fosfato (PIP 2 - vedi pag.201) con formazione di PIP 3 Inoltre, per quanto concerne la PKB - che è attivata da PIP 3, vedi pag.206. D altra parte è stato dimostrato che cellule deficienti in AT presentano una scarsa induzione di p53 in risposta ad agenti che danneggiano il DNA. 221

4 Quindi si può introdurre il seguente sillogismo: come la p53 è substrato della DNA-PK, non potrebbe essere la p53 anche substrato della proteina espressione del gene ATM, che è omologa alla DNA-PK? Queste, al momento, restano pure speculazioni. Per concludere possiamo dire che la scoperta della PI3K ha aperto tutto un mondo di conoscenze della massima importanza su prodotti d espressione di geni, legata al ciclo cellulare e alla difesa della stabilità genomica. Tale importanza è stata messa ancora più in risalto dalla recente scoperta dell ATM e dalle sue interazioni con le proteine promotori di tumori. Fosforilazione di Rb R.Fahraeus e coll. [Curr: Biol. 6 (1) 84 (1996)] hanno studiato le capacità inibitorie - di inibitori delle cinasi dipendenti da ciclina - sulla fosforilazione della proteina Retinoblastoma (Rb). Tali inibitori sono proteine di basso peso molecolare, già descritte a pag.144. Ricordiamo brevemente che esistono più classi di tali proteine inibitrici. Alla classe Cip/Kip appartiene la già citata p21 Cip1. Alla classe Ink4 appartiene la p16, che è stata utilizzata negli studi effettuati (che ora analizziamo) dai sopra citati Autori. Nella figura qui sotto riportata, è riprodotta in (c) la sequenza di p16. Su di una colonna da laboratorio erano fissate le proteine cinasi Cdk4 oppure Cdk6. Soluzioni contenenti singoli spezzoni peptidici di circa 10 AA (riproducenti parte della struttura di p16) venivano percolati attraverso le due colonne Cdk4 [ vedi fig.(a)], oppure Cdk6 [vedi fig.(b)], e veniva misurato il grado di ritenzione di tali peptidi. Si osserva che il peptide 6 [vedi aa sequenza di p16 sottolineata in (c)] è quello maggiormente trattenuto. Conclusione: Cdk4 e Cdk6 legano il peptide 6 di p16, quindi è la parte 6 di p16 che inibisce Cdk4 e Cdk6. Conclusione: la proteina inibitrice p16 interagisce con Cdk4 e Cdk6 (e quindi inibisce) con la parte corrispondente al peptide 6. In un altra serie di esperimenti è stato confermato che la presenza del peptide 6 inibisce la fosforilazione di Rb da parte di Cdk. Qui sotto in (a), a sinistra, è riportato il risultato di tale inibizione: Rb pura ricombinante è aggiunta ad un estratto di colonie di insetti Sf9, precedentemente infettati con baculovirus esprimenti Cdk4. Si aggiunge ATP radioattivo. Viene poi eseguita l elettroforesi, seguita dalla radioautografia. In figura 2 è riportata la banda corrispondente alla proteina Rb. Se è presente il peptide 6 si ha pochissima fosforilazione di Rb (un forte annerimento della banda corrisponde ad una forte fosforilazione di Rb da parte di Cdk4). 222

5 Viceversa il peptide 1 (circa i primi 20 amminoacidi di p16) o il peptide 10 (gli ultimi 20) non inibiscono la fosforilazione di Rb (non è riportato l effetto degli altri peptidi, che non inibiscono - come, oppure 10. L inibizione viene poi esercitata dal solo peptide 6 che però è sintetizzato in modo da avere qualche AA (per esempio l 84 che normalmente è Asp) sostituito sempre con alanina. Si osserva che ricompare la banda, quindi sparisce la capacità inibitoria del peptide 6, e questo conferma l importanza del peptide in sé; tuttavia avviene un fenomeno strano: se l Asp.92 è sostituito con Ala ricompare la capacità inibitoria del peptide e, paradossalmente, è anche più forte! Molto probabilmente il peptide con l AA 89 = Gly seguito da tutti AA idrofobici sino al 98 (escluso l Asp-92 che è idrofilo) agisce perché idrofobico. Sostituendo l unico AA. idrofilo con uno idrofobico si ottiene un aumento delle capacità inibitorie. Questa parte di p16 (che inibisce Cdk4/ciclina D) è molto importante: infatti in alcuni tumori dell esofago e della vescica si ha una proteine p16 mutata proprio nella zona del peptide n 6 (o molto vicino ad esso). Quindi la Cdk4 ha un alterazione della sua capacità inibitoria su Rb = sbilanciamento del ciclo cellulare. Inoltre gli stessi Autori hanno dimostrato che un eccessiva produzione di Rb (indotta mediante trasfezione del gene per Rb in cellule in coltura) blocca le cellule in G1, impedendo l inizio della fase S. Infatti con molta Rb il complesso con E2F è più stabile e senza liberazione di E2F non si ha ingresso in fase S. La proteina Rb è moderatamente fosforilata (< 2 P/mole) in fasi cellulari diverse da fine G1. Al termine di G1 la Rb possiede anche 4 residui di Fosfato per mole di proteina, che permangono durante S e G2, per ritornare a 2 in G0 e G1. Mancanza di p21 Cip1 e checkpoint in G1. C.Deng e coll. in un a recente pubblicazione (Cell, 82,675,1995) hanno dimostrato l importanza di p21 Cip1 sul checkpoint in G1 del ciclo cellulare. Facendo riferimento allo schema di pag.220, un danno al DNA o una mancanza di nucleotidi (inibizione da PALA) determinano un aumento di p53 che porta alla trascrizione del gene per p21 Cip1 che inibisce le Cdk/cicline. C.Deng e coll. hanno prodotto dei topi transgenici, mancanti del gene per p21 Cip1. Sorprendentemente tali animali non presentavano sviluppo spontaneo di tumori nei 7 mesi di osservazione, mentre lo erano (più esposti all insorgenza di tumori) altri topi mancanti di p53. Tuttavia cellule fibroblasti di topo in coltura (Mouse Embryonic Fibroblasts-MEF) permanevano in G1 per esposizione a radiazioni ionizzanti o in seguito a perturbazione del pool dei nucleotidi. 223

6 Qui accanto, in (C),vengono riportati i risultati di Northern blot di p21 e p53 (elettroforesi e transblot di mrna, seguita da esposizione a sonde radioattive del cdna di p53 o p21 che ibridizza con l mrna complementare; dopo l ibridizzazione i trans-blot sono radioautografati). Gli esperimenti sono stati eseguiti con cellule MEF. In alto viene anche indicato il genotipo. Wt = Wilde type. Si può osservare che p53-/- manca di mrna della p53, ma anche di mrna per p21. Infatti se non esiste mrna per p53 non è possibile la sintesi della proteina p53 e quindi non può avvenire la trascrizione di Cip1 e sintesi dell mrna che codifica p21. Viceversa, all estrema destra, i topi p21-/- mancano ovviamente di mrna per p21 ma possiedono l mrna per p53. In (D) viene riportato il risultato dell immunoblot per Cdk2 e p21. La proteina cdk è sempre presente, mentre la proteina p21 non esiste, ovviamente, nelle cellule MEF provenienti da topi con genotipo nullo per tale p21, ma non esiste neanche nelle cellule MEF provenienti da topi con genotipo nullo per p53. Nelle Fig.(A) e (B) sono riportate le Interessanti osservazioni relative alla proliferazione di queste cellule. In (A) si può osservare che le cellule p21-/- e p53-/- quando arrivano a confluenza sentono in apparenza meno l inibizione da contatto. In (B) è osservata la crescita delle cellule dopo 5 trasferimenti (passaggio 5-6). Normalmente tutte le cellule sono meno proliferanti dopo un certo numero di trasferimenti su piastra da coltura, ed infatti la Wilde Type +/+ sono poco proliferanti, mentre p21-/- e p53-/- sono decisamente più proliferanti. Altre osservazioni dirette stabiliscono l importanza della p21 nell inibizione della Cdk per l arresto in G1. La p53 probabilmente svolge più ruoli. Qui sopra è riportato lo schema conclusivo dell importante lavoro di Deng e coll. 224

7 Inserto: Aspartico Transcarbamilasi e PALA L Aspartico Transcarbamilasi (ATCasi) catalizza la prima tappa della sintesi delle basi pirimidiniche. Il PALA (N-Phosphon-Acetil-L-Aspartato) è un analogo dello stato di transizione del ciclo catalitico di ATCasi, per cui la inibisce fortemente. Grazie alla sua struttura, inibisce anche la CAP sintasi e le diidroorotasi. 225

8 Inserto: analisi al FACS di cellule irradiate Con la tecnica Fluorescence Attivated Cell Sorter (FACS) è possibile stabilire la distribuzione (nelle diverse fasi del ciclo cellulare) di una popolazione di cellule. Per effettuare l analisi, si tratta il campione con un intercalante fluorescente (per esempio bromuro di etidio). Tale reattivo si coniuga al DNA e lo rende fluorescente. L intensità di fluorescenza è proporzionale al contenuto di DNA. Lo strumento FACS analizza il campione, osservando ogni singola cellula, in un tempuscolo brevissimo, rilevando l intensità di fluorescenza, e quindi il contenuto il DNA. Ad analisi avvenuta lo strumento produce la distribuzione cellulare (in ordinate - vedi tracciati sotto riportati) in funzione del contenuto in DNA (in ascisse). Tracciato (a). Si può rilevare che cellule wild tipe presentano una prevalenza di cellule in fase G1 e G2. Si può constatare che in G2 il contenuto in DNA più rappresentato - riportato in ascisse - (in corrispondenza del massimo della curva) è doppio rispetto a quello delle cellule in G1. In effetti in G2 è terminata la fase S e quindi il DNA è raddoppiato rispetto al contenuto in G1. Sempre in (a), in alto, vediamo che tra G1 e G2 esistono cellule, in numero più contenuto, che presentano livelli di DNA intermedi tra G1 e G2 (è la zona ombreggiata). Queste sono le cellule in fase S. Se le cellule Wilde Type sono esposte a radiazioni ionizzanti, si può osservare (tracciato in basso di b) che, dopo 8 ore, spariscono le cellule in fase S (scompaiono, in pratica, le cellule a contenuto intermedio di DNA - tra G1 e G2) mentre sono aumentate le cellule in G2. Questa distribuzione è interpretabile nel seguente modo: L irraggiamento ha danneggiato il DNA attivando un ceck-point cellulare (quello tra G1 ed S), impedendo l ingresso in fase S, mentre le cellule già in fase S al momento dell irraggiamento sono evolute in G2 (infatti il loro numero aumenta). Tracciato (b). E riportato il comportamento di cellule mutanti per p53. Prima dell irraggiamento la distribuzione coincide con quella delle cellule wilde-type. Dopo 8h si osserva presenza normale di cellule in fase S. Questa distribuzione è dovuta alla mancanza di p53, che non può aumentare, come di norma, per danno al DNA. Viene meno l induzione di p21-cip, che non può più inibire il complesso Cdk-ciclina E, che fosforila pertanto Rb normalmente (senza subire l inibizione da parte di p21-cip). Rb, in seguito a fosforilazione, rilascia il fattore di trascrizione E2F, che assicura la trascrizione dei geni per un corredo di enzimi specifici della sintesi del DNA, insieme ad enzimi accessori (per esempio: la timidilato sintetasi). 226

9 La proteina Mdm2 - Interazione tra Mdm2 e p53 (da TIBS 22, 372, ott 1997) Esiste un importante proteina che lega la proteina soppressore di tumore p53 (vedi pag.46).tale proteina e indicata con la sigla Mdm2. Fu inizialmente identificata non come proteina in quanto tale, ma attraverso il gene che la codifica, che fu trovato nel topo (mouse) su cromosomi double minute (in seguito ad amplificazione genica, si possono avere frammenti di DNA extracromosomiali, che sono accoppiati double e piccoli -minute). L acronimo Mdm deriva da Mouse double minute. Ricordiamo, prima di studiare le proprietà di Mdm2, che p53 è anche un fattore di trascrizione (abbiamo già visto che p53 trascrive p21 Cip1 vedi pag.220). 1. Oltre alla p21 Cip1, la p53 trascrive anche il gene che codifica per la stessa proteina Mdm2. Tenendo presente quest importante premessa, analizziamo ora le: Principali proprietà di Mdm2: 2. Possiede un sito di legame per la proteina p In tale complesso p53-mdm2, la p53 diventa contrassegnata per la degradazione Ubiquitina dipendente. Ovvero è un pre-contrassegno: infatti p53-mdm2 non è una interazione covalente, e la Mdm-2 pilota l ubiquitina sulla p53, che la contrassegna definitivamente per la successiva proteolisi. L Mdm-2 si allontana, e la p53 ubiquitinata verrà degradata in forma ATP dipendente dai proteosomi (vedi pag.36). Quindi, nelle cellule normali (non trasformate), in situazioni quiescenti (senza, per esempio, l esposizione a radiazioni) i livelli di p53 sono mantenuti bassi mediante tale interazione p53- Mdm2. D altra parte, per la sopra citata proprietà 1., con p53 assai bassa non si ha iperproduzione di Mdm2, che annullerebbe del tutto la presenza della p53 stessa, per esasperazione del processo 3. [infatti un iperproduzione di Mdm2 determinerebbe la completa sottrazione della p53 per azione di massa]. In sostanza, dalla integrazione delle proprietà e 3. scaturisce un sistema autobilanciato assai raffinato per il controllo della concentrazione cellulare di p53 che, in situazioni di normalità, deve risultare bassa. La p53 quindi svolge, con un po' di fantasia, il ruolo di sentinella. Ora prendiamo in esame la risposta della cellula in situazioni di anormalità. Tali situazioni possono essere raggruppate in due ambiti: a) esposizione a stress; b) cellule mutate, per esempio cellule che codificano per p53 mutata. Iniziamo da: a) esposizione a stress. Una varietà di processi, tra i quali l attivazione della DNA-PK (vedi dopo), porta alla modifica della p53, che non è più in grado di legarsi alla Mdm2. Questo mancato pre-contrassegno, impedisce l attivazione della via di degradazione della p-53 stessa [vedi processo 3) sopra citato], e pertanto la concentrazione della p53 sarà destinata ad aumentare, con la risposta graduata da parte della cellula, ovvero per livelli medi di p53 si ha blocco dell ingresso in fase S e, per livelli alti di p53, si ha l innesco dell apoptosi. b) cellule mutate. Può essere mutato il gene per p53, rendendo la proteina p53 incapace di attivare la trascrizione del gene Mdm2; quindi verrebbe meno il processo illustrato in 1) (vedi sopra). Infatti, se il gene per Mdm2 non è trascritto per il mancato legame della p53 al promotore di Mdm2, si avrà, ovviamente, l assenza della proteina Mdm2, e quindi la mancata proteolisi della p53 stessa, la cui concentrazione cellulare aumenterà a livelli medi o alti, con le stesse conseguenze descritte in a). Ricapitolando, gli stress inficiano il meccanismo con il quale p53 si lega a Mdm2 [vedi a)]. Con mutazioni di p53 si ha mancata trascrizione di Mdm2 [vedi b)]. 227

10 Nella seguente figura sono schematizzate queste proprietà: Quindi per processi b) (vedi pagina precedente, in basso; cellule mutate), non è operativo il processo b) indicato in figura: non si ha sintesi di Mdm2, che non pre-contrassegna p53, ed il livello di p53 aumenterà, essendo bloccato il processo che normalmente la degrada. Invece, se p53 è modificata [processi a), vedi la pagina precedente, per esempio per fosforilazione da parte della DNA-PK], viene meno la tappa a), ovvero p53 non è più riconosciuta da Mdm2, quindi p53 non sarà più degradata. Interessante che sia la via a) che b) portano ad incrementati livelli di p53. E degna di nota la seguente constatazione sperimentale: Cellule tumorali che possiedono p53 mutata non contengono la proteina Mdm2 [a conferma che non è operativa la sopra indicata via b)]. Se a tali cellule con elevata concentrazione di p53 viene aggiunta la proteina Mdm2 esogena, i livelli di p53 scendono rapidamente [ovvero è operativa la via a), resa possibile, perché Mdm2 esiste]. 228

11 DNA-proteina cinasi e fosforilazione di p53 (Cell, 91, 325, ott 1997) Occupiamoci ora dell importante fosforilazione di p53. La sua struttura era già stata introdotta (vedi pag.46). La zona fosforilabile è all N-terminale, nel cosiddetto dominio di trans-attivazione, in corrispondenza delle serine 15 e 37 (nella p53 umana). La DNA-proteina cinasi (DNA-PK) è assai importante. Infatti le cellule che ne sono prive, hanno un non-efficiente sistema di riparazione del DNA a doppia elica, e presentano una alta sensibilità alle radiazioni ionizzanti. La DNA-PK è formata da 2 subunità. La subunità di peso molecolare inferiore (contrassegnata dal simbolo Ku, di Peso Molecolare variabile, a seconda della specie, compreso tra e Dalton) che la indirizza al DNA, ed una subunità maggiore (di Peso Molecolare = Dalton) che ha attività serin/treonin cinasi. Come è già stato anticipato (vedi pag.221) la DNA-PK appartiene alla famiglia PI3K, anch essa formata da 2 subunità, di PM = e Ovviamente l interesse della DNA-PK è correlato alle proteine che fosforila. E assai interessante che alcune forme tumorali sono contrassegnate dalla mancanza di DNA-PK (p.e. linea cellulare M059J di glioblastoma umano). La p53 è substrato della DNA-PK. Infatti, una p53 mutata (con alanina al posto della serina-15) ha una capacità soppressore di tumori ridotta del 50%. Consideriamo le importanti conseguenze di queste fosforilazioni. Occorre premettere che la p53 interagisce con Mdm-2 con una modesta sequenza amminoacidica (dall AA 18 al 23 di p53), presente nel dominio d attivazione trascrizionale. Le Serine 15 e 37 di p53 sono quindi strettamente vicine a tale sequenza. Con queste premesse è del tutto plausibile (ed è stato dimostrato) che la fosforilazione di tali Serine impedisce il legame di p53 a Mdm2 [via a) della pagina precedente]. A lato è riprodotto un esperimento che illustra alcune di queste proprietà. Cellule LNCaP erano irradiate per 4 ore. Ad intervalli venivano prelevati degli estratti per essere analizzati in SDS-PAGE + Western blotting. La Mdm2 veniva evidenziata con anticorpo anti-hdm (H=Human) e la p53 veniva evidenziata con il suo anticorpo specifico (nella pratica i due anticorpi erano mescolati): si può constatare direttamente (vedi figura a lato) che la proteina HDM è presente inizialmente a livelli bassissimi, per aumentare progressivamente con l irraggiamento delle cellule (a 4 ore è vistosamente elevata). La p53 aumenta pure essa per toccare un massimo di concentrazione intorno alle 2 ore ma, a differenza di HDM, dopo le 2 ore diminuisce per riavvicinarsi alle concentrazioni modeste iniziali. In pratica p53 inizialmente è assente (oppure è presente, ma a concentrazioni inferiori alla sensibilità della tecnica analitica usata), e compare dopo solo ½ ora, mentre HDM è ancora a concentrazioni assai basse. 229

12 Ma tale aumentata concentrazione di p53 è seguita dall aumento della concentrazione di HDM. Quindi è verosimile che a p-53 determini trascrizione della Mdm2, che compare dopo. La sovraespressione di Mdm2 determina, a sua volta, la quasi scomparsa della p53. Il processo è facilmente desumibile dall osservazione del western-blot (pannello superiore, vedi pagina precedente). E stato realizzato inoltre un altro esperimento, che ha prodotto il western-blot del pannello inferiore. Gli estratti cellulari venivano (per quota parte) anche trattati con il solo anticorpo anti-p53 ed era recuperato il materiale immunoprecipitato (prima dell analisi in western-blot). L ipotesi di lavoro è la seguente: estraendo p53 dovrebbe essere possibile anche immunoprecipitare HDM, se questa forma dei complessi con p53. Tali immunoprecipitati venivano in seguito analizzati in western-blot e si utilizzava l anticorpo anti- HDM per evidenziare (se presente) la proteina HDM. In effetti HDM è presente. Possiamo interpretare che presenza di HDM sia dovuta ad un effettivo suo legame a p53 (il passaggio cruciale dell esperimento è l immunoprecipitazione preliminare diretta solo contro p53). Se viene ritrovata anche HDM, è plausibile che questa coprecipiti con p53, in quanto formante un complesso con la p53 stessa. Sorprende, tuttavia, che tale HDM si mantenga pressoché costante (vedi pannello inferiore della figura di pagina precedente). La p53 subirebbe delle modifiche post-sintetiche (per esempio: fosforilazione da parte della DNA- PK), che ne compromettono l interazione con HDM/Mdm2. Quindi in effetti la concentrazione di HDM aumenta ma solo una quota minoritaria si lega a p53 in quanto quest ultima (pur aumentando essa stessa, almeno nelle prime 2 ore) viene in parte fosforilata (che non lega HDM). Mdm2 e sarcomi In certe forme di tumore (sarcomi) è stata riscontrata un aumentata concentrazione della proteina Mdm2, senza che sia mutato il gene per p53 (e, apparentemente, neanche quello di Mdm2). Si ritiene che in tali tumori sia sbilanciata la via di degradazione ubiquitina-dipendente, pertanto p53 non è degradata e può trascrivere la Mdm2. Questo meccanismo rappresenta, in pratica, la controparte di quanto illustrato in a) della figura di 2 pagine precedenti. Infatti in a) veniva descritta una interazione alterata per modifiche della p53. Qui si è propensi a ritenere che Mdm2 non leghi la p53, per qualche alterato meccanismo a carico della Mdm2. Si può accennare alla strategia di una moderna chemioterapia dei tumori. Poiché l interazione p53-mdm2 è limitata a pochi amminoacidi nella p53 (dal 18 al 23), si tenta di sintetizzare farmaci che si leghino al dominio della Mdm2 che normalmente lega p53. Tale inibizione del legame tra le due proteine dovrebbe incrementare i livelli della p53, essendo svincolata, per tale mancato legame all Mdm2, dalla sua normale via di degradazione. L aumentato livello della p53 dovrebbe fare entrare la cellula nel programma apoptotico, e conseguente far regredire il tumore. 230

13 Riserve endocellulari di calcio Ne esistono diverse forme e non c è univocità di interpretazione. Comunque: Nel reticolo sarcoplasmatico esistono canali per il Ca ++ sensibili a variazioni di potenziale. Tali canali sono anche sensibili alla rianodina (vedi ADPR-ciclico) e alla caffeina. Nel RER (Reticolo Endoplasmatico Rugoso) esistono recettori per IP 3 che rilasciano calcio (R 2, vedi pag.197). I due recettori sono diversi. Sono stati clonati e sono distinti, anche se correlati. A seconda del tipo cellulare si possono avere recettori sensibili alla rianodina anche nel RER, e viceversa. Sono stati identificati dei particolari organelli (calcisomi), che appaiono come vescicole lisce e molto piccole. Nel reticolo sarcoplasmatico esiste la calsequestrina. In questa pagina è riportato il tracciato in elettroforesi denaturante di estratti: - tracciato 1 = reticolo sarcoplasmatico cardiaco - tracciato 2 = reticolo sarcoplasmatico di muscolo scheletrico. La proteina di Da è la Ca ++ ATPasi (SERCA ATPasi), mentre con PM è ben visibile la calsequestrina. Con PM è indicata una glicoproteina che è inserita nel Reticolo Sarcoplasmatico, a funzione ignota (lega ATP). La calsequestrina contiene ben un 16% di Acido Aspartico e 16% di Acido Glutammico. È una delle proteine più acide che si conoscano. Lega circa 50 ioni Ca ++ per mole! La calsequestrina sembra specifica del muscolo scheletrico. In altre cellule (anche nel fegato) è presente una proteina simile, denominata calreticulina o calregulina. From Campbell e coll. J. Biol. Chem. 258 (2) 1197 (1983) Reticolo Reticolo Sarcoplas. Sarcoplas. Cardiaco Muscolo Fosfolipasi C e fattori di crescita Quando si è parlato dell attività tirosin cinasica si era visto che spesso era presente in recettori per fattori di crescita. In particolare, l EGF stimola l attività tirosin cinasica del recettore (vedi pag.119). Quale/i substrato/i è/sono individuati? È dimostrato che un tipo di fosfolipasi C è substrato dell attività tirosin cinasica del recettore per l EGF (già citato a pag.117 e 119). In seguito a tale fosforilazione si ha attivazione dell attività fosfolipasica C (PL-C). A pag.232 sono illustrate le strutture di alcune PL-C. Ne esistono 4 tipi base (α, β, γ e δ), tutte singoli polipeptidi e tutte prodotti di geni discreti. Tutte idrolizzano PI, PIP e PIP 2 e l attività della δ dipende strettamente da calcio. Anzi il Ca ++ è essenziale e l enzima presenta una caratteristica curva gaussiana. È molto sensibile all attività delle proteasi Ca ++ -dipendenti (come molti altri enzimi dipendenti da Ca ++ ). 231

14 Sono state clonate diverse PLC in cdna di cervello bovino. Esistono regioni X e Y con elevata omologia. Per ogni forma esistono più isoenzimi. È riportata anche la sequenza della PLC-β di Drosophila. Soltanto la PLC-γ è substrato dell attività tirosin cinasica. In essa, tra le zone X e Y, sono comprese zone con omologia di sequenza con prodotti di espressione del gene src (Src Homology; vedi pag.210). Sono state prodotte PLC-γ mancanti delle zone SH2 e SH3: era ancora presente attività PLC. Ciò non succede se si modifica X o Y. Chiaramente le zone SH sono regolatorie. Tali zone SH sono presenti (come abbiamo visto) in molte altre proteine. L attivazione di PLC-γ è interessante perché consente un accettabile interpretazione funzionale e coordinata sia di SH2 che di SH3. from Rhee TIBS (1991) È stato approfondito lo studio sull attivazione della PLC-γ 1. La prima risposta al legame dell EGF al suo recettore è l autofosforilazione di più tirosine (fase a). L enzima PLC-γ 1 è libero (e inattivo) nel citosol. Le tirosine autofosforilate sono riconosciute dai domini SH2 della PLC-γ 1, con formazione di un complesso (fase b) (sono fosforilate le tirosine 771, 783 e 1254 della PLC-γ 1 ). 232

15 Avvenuta tale fosforilazione (della PLC-γ), si ha distacco della PLC-γ 1 ora attiva (fase c), con cambio di conformazione e interazione dei domini SH2 con le tirosine fosforilate sulla PLC-γ. Ciò espone il dominio SH3, che interagisce con proteine del citoscheletro, mentre i domini X ed Y (catalitici, ovvero idrolizzano PIP 2 a IP 3 e DG) esprimono l attività catalitica. La PLC-γ 2 non possiede la Tyr È stato ipotizzato che individua altri tipi di substrato. Quindi, nel suo insieme, il processo è così schematizzabile: (a) autofosforilazione di tirosine del recettore, in risposta al legame con EGF (b) gli SH2 di PLC-γ riconoscono Tyr-P del recettore e si forma il complesso EGF-R/PLC-γ. Le tirosine 771, 785 e 1254 della PLC-γ possono essere fosforilate dal recettore (c) i domini SH2 riconoscono ora le tirosine della PLC-γ stessa, fosforilate; si ha ripiegamento di PLC-γ, esposizione di SH3 e ancoraggio a membrana. X e Y contigui = attivazione di PLC. Attivazione di Ras mediante adattatori molecolari È stata chiarita (vedi Pawson & Schlessinger Curr. Biol. 3, 434, 1993) una via di attivazione della proteina-g di tipo Ras. Esiste una catena di eventi che collegano un recettore attivato per fattore di crescita (per esempio EGFR) alla proteina Ras, cui prendono parte le due proteine Grb-2 e Sos: Grb-2, che riconosce, con un dominio SH2, la tirosina 1068 di EGFR nella forma fosforilata, secondo le proprietà generali dei domini SH2; in particolare la Y-1068 è inserita nella sequenza YINQ (cioè Tyr Iso Asn Gln). La Grb-2 possiede anche due domini di tipo SH3 (vedi pag.117 e 216). Questi domini SH3 si legano a domini specifici di un altra proteina, la Sos. La proteina adattatrice Grb-2 è stata clonata nell uomo. Nella Drosophila esiste il prodotto del gene Drk, e nel nematode Cenorabditis elegans è stata evidenziata la proteina Sem-5. Grb-2, Drk e Sem-5 sono omologhe. Possiamo schematizzarle nel modo seguente: Quali proteine legano i domini SH3? È stata inizialmente usata la 3BP-1, che ha omologia con GAP (vedi pagg ); tale 3BP-1 si lega ai domini SH3 della proteina oncogenica con attività tirosin cinasica, c-abl (vedi pag.113); in tale 3BP-1 la zona che si lega agli SH3 è ricca in prolina. È stato visto che Grb-2 si lega ad una proteina Sos (Son of Sevenless), inizialmente identificata nella Drosophila, che possiede zone ricche in prolina. Quindi Grb-2 (se attivata quando il dominio SH2 si lega alla Tyr-P), si lega alla proteina Sos. È stato dimostrato che il peptide sintetico: Pro Pro Pro Val Pro Pro Arg Arg Arg (stessa natura del peptide di pag.213) blocca l associazione di Grb-2 alla proteina Sos, impedendone il legame con un SH3 di Grb-2. In realtà Sos possiede 2 zone che interagiscono specificamente ciascuna con un SH3 (tali zone sono al C-terminale). Tale dominio determina attivazione della p21-ras, in quanto è promosso lo scambio GDP legato alla Ras (proteina-g inattiva) con GTP ( proteina-g attiva). Possiamo schematizzare la proteina Sos nel modo seguente: 233

16 Quindi possiamo riassumere l intero processo di attivazione della proteina p21-ras: Questo è uno dei modi di attivazione di p21-ras, che è ancorata in membrana con un residuo di acido miristico. Per disattivare Ras interverranno, oltre all intrinseca attività GTP-asica, anche proteine tipo GAP (vedi pagg ). Proteine collettrici (docking-proteins) I domini SH2 possono legarsi a tirosine fosforilate presenti anche in proteine che non fanno parte dei recettori dei fattori di crescita. Un esempio interessante è dato dalla IRS-1 (Insulin Receptor Substrate-1), che possiede più tirosine che sono fosforilate in cellule stimolate da Insulina (contiene ben 10 Tyr fosforilabili; vedi pag.235). La scoperta di tale IRS-1 ha aperto lo studio di proteine che possono trasmettere messaggi multifunzionali. Ogni tirosina fosforilata è riconosciuta da specifici SH2, con la già collaudata regola per il riconoscimento: sono importanti i residui che seguono la Tyr-P in posizione +1, +2, +3 (la più importante è la posizione +3). (Docking deriva da Docks = magazzini). La fosforilazione di 5 tirosine di IRS-1 consente la contemporanea attivazione di: Syp: è una Tirosin Fosfatasi; è la PTP 1D (vedi pag.163 e pag.117). Si lega anche al PDGFR. PI3K: individua su IRS-1 la sequenza P YMXM (come PDGFR; vedi pag.117). Grb-2: con conseguente attivazione della p21-ras, come già illustrato nella figura in alto. Questa IRS-1 fu scoperta da White, Mason & Kahn [Nature, 318, 185 (1985)]. Solo recentemente gli stessi autori [Nature, 352, 73 (1991)] hanno clonato il gene del fegato di ratto, ed hanno dimostrato che IRS-1 è fosforilabile dall insulin-receptor con una K m di circa 50 µm. È stato fatto un importante passo avanti nella comprensione del meccanismo d azione dell insulina. Certamente IRS-1 non è l unico substrato dell azione del recettore per l insulina; comunque la mediazione da parte di IRS-1 è certamente ad ampio spettro d azione. Nella figura qui sopra sono riportate tre proteine che legano Tyr-P. Ma le Tyr fosforilabili di IRS-1 sono 10. Il criterio per la fosforilabilità è la presenza di un AA acido (Glu o Asp) prima della Tyr fosforilabile (vedi pag.119). Gli AA che seguono la Tyr fosforilabile sono determinanti, come è già stato illustrato (vedi pag.117), per il riconoscimento di specifici domini SH2. La IRS-1 è formata da 1235 AA (PM ). 234

17 Vediamo le sequenze consenso: Tyr: 46 e 47 Glu Tyr 46 Tyr 47 Glu Asn Glu - Lys Tyr: 460 Glu Tyr 460 Ile Cys Met - contiene Met in +3 Tyr: 546 Glu Tyr 546 Thr Glu Met - Tyr: 608 Asp Asp Gly Tyr 608 Met Pro Met - contiene Met in +1 e +3 Tyr: 628 Asp Tyr 628 Met Pro Met - Tyr: 658 Asp Pro Asn Gly Tyr 658 Met Met Met - contiene Met in +1, +2 e +3 Tyr: 727 Asp Tyr 727 Met Asn Met Tyr: 939 Glu Glu Tyr 939 Met Asn Met - Tyr: 987 Asp Tyr 987 Met Thr Met - Tyr: 1010 Pro Val Ser Tyr 1010 Ala Asp Met - contiene Met in +3 Quindi 8 siti su 10 presentano una Tyr preceduta da un residuo acido (Glu o Asp): sequenza consenso per fosforilabilità da Insulin Receptor. 7 siti su 10 sono seguiti da Met in +1 e +3. La Tyr- 658 è seguita da 3 Met. Sono tutti siti riconoscibili da SH2. Questa IRS-1 offre una chiara lettura delle proprietà delle sequenze consenso. I recettori per le interleuchine (IL-4) utilizzano le cinasi di tipo JAK (vedi più avanti, pag.237) per fosforilare in tirosina vari substrati. 235

18 La 4PS è un altra docking protein. 4PS IL-4 Phosphotyrosine Substrate. Anche la 4PS lega la PI3 cinasi. Current Biology, 1993, Vol 3, N 10, pag.714 IRS-1: Insulin Receptor Substrate 1 4PS: IL-4 Phosphotyrosine Substrate 236

19 JAK cinasi (da TIBS, 19, 222, 1994) Recentemente è stato accertato che un gran numero di citochine (per esempio l eritropoietina- EPO, le interleuchine-il e gli interferoni-ifn) trasmettono i loro messaggi dall esterno all interno delle cellule mediante particolari recettori che formano una famiglia a sé stante. Tali recettori possiedono un dominio extracitoplasmatico che lega la citochina, ma il dominio interno non presenta una specifica attività tirosin cinasica, come la maggior parte dei recettori per fattori di crescita (possiamo citare il recettore per il PDGF ed il recettore per l EGF che, come abbiamo già visto, possiedono un intrinseca attività tirosin cinasica). Si ha, tuttavia, ugualmente espressione di attività tirosin cinasica perché particolari proteine presenti nel citoplasma (le JAK proteine distinte dal recettore stesso) si associano al dominio citoplasmatico dei recettori sotto stimolo della citochina stessa che si lega al recettore. Le JAK (JAnus Kinase, perché hanno un doppio dominio tirosin cinasico in tratteggio nella figura come Giano bifronte, figura mitologica con doppia faccia) si associano al recettore quando, per esempio, la EritroPOietina (EPO) si lega al recettore. Si innesca un iniziale dimerizzazione del recettore (vedi (a) in figura) e (b) le proteine JAK si associano ad esso. Si ha autofosforilazione su tirosine delle JAK stesse (c); quindi (d) si ha fosforilazione su tirosina sia del recettore per citochine che di substrati cellulari. Sono stati descritti tre tipi di JAK: JAK-1, JAK-2 e TYK-2. Parleremo quindi di un complesso recettore JAK che presenta attività tirosin cinasica espressa dalla proteina JAK. Seguono risposte cellulari variamente differenziate: 1. una risposta è quella già nota, con l arruolamento di proteine tipo PI3K mediante l interazione con i domini SH2. Si può avere anche l attivazione della proteina-g monometrica p21-ras, via Grb-2 e Sos. 2. una risposta specifica dei recettori per citochine è la fosforilazione su tirosine di proteine STAT (Signal Trasducers and Activators of Transcription). Si inducono complesse aggregazioni che portano alla trascrizione di particolari geni (vedi in dettaglio più avanti, pag.258) Struttura primaria delle JA cinasi Le JA Kinasi possiedono diversi elementi strutturali comuni. Nella figura qui riportata in (a) è schematizzata la struttura a blocchi delle JAK. A partire dall N-terminale si trovano tre zone (A, B, C) con non eccessiva omologia, comunque sufficiente a definirli domini specifici delle JAK. I domini D ed E, invece, presentano un elevata omologia di sequenza nell ambito delle JAK sino ad ora sequenziate, ma hanno funzioni non ancora ben definite. Stupisce la mancanza di domini tipo SH2 ed SH3, che invece sono largamente presenti in tirosin cinasi (per esempio la proteina pp-60 c- src ). Importanti indicazioni provengono invece dall analisi delle sequenze verso il C-terminale. Esiste (a partire dal C-terminale) un dominio-1 con evidente attività tirosin cinasica, con elevata omologia di sequenza con il dominio delle proteine cinasi, ed un dominio-2 con modesta omologia di sequenza con le tirosin cinasi, privo, apparentemente, di attività tirosin cinasica. La denominazione Janus è riferita a questa doppia presenza di domini tirosin cinasici. È interessante confrontare le sequenze dei subdomini (da I a IX) dei due domini cinasici con le caratteristiche scaturite dalla classificazione di Hans Quinn Hunter (vedi pag.83-85). 237

20 Il subdominio-i (vedi pag.80) contiene il Rosmann motiv, che rispecchia la sequenza consenso nel dominio-1, mentre è appena accennato nel dominio-2. Il subdominio II contiene la Lys, che è numerata 72 nelle serin-cinasi, e che può essere marcata con FITC. Sia per questi subdomini che per i successivi vedremo che nel dominio-2 sono presenti solo alcuni amminoacidi della sequenza consenso (sono evidenziati con un quadratino od un rettangolino), mentre nel dominio cinasico 1 tutti i subdomini presentano la corretta sequenza consenso. Il subdominio VI serve a differenziare una tirosin-cinasi da una serin-cinasi. Infatti da 386 in poi le tirosin-cinasi devono essere D L A A R N, mentre le serin-cinasi D L K P E N. La differenza più consistente è nel penultimo amminoacido delle sequenze sopra riportate (vedi anche pag.81). Le serin-cinasi presentano un amminoacido nettamente acido (il glutammico E), mentre le tirosin-cinasi, come le JAK, presentano arginina (R), cioè un amminoacido nettamente basico. Il subdominio VIII presenta la nota sequenza APE, che nelle MAP-cinasi è preceduta (vedi pag.147) dalla sequenza TEY, che è doppiamente fosforilata dalla MAPKK o MEK. Infine, il subdominio IX è completamente presente sia nel dominio-1 che nel dominio-2. Substrati delle JA cinasi Ritorniamo a vedere quali sono gli effetti dell attivazione della JAK. Sono stati compiuti studi ben dettagliati sui recettori degli interferoni (IFN), in particolare α e β. Gli interferoni (che appartengono alla famiglia delle citochine) sono glicoproteine secrete da cellule di vertebrati infettate da virus. Legandosi ai recettori di altre cellule, gli interferoni attivano una reattività antivirale delle stesse cellule, inducendo la trascrizione di particolari proteine. Gli interferoni di tipo α sono secreti dai leucociti, mentre quello di tipo β è secreto dai fibroblasti. Dopo attivazione del recettore con IFN-α, si ha il legame della JAK-1 al recettore e, quindi, l attività tirosin cinasica della JAK-1 (a volte anche la TYK-2) fosforila due proteine p-84 e p-91 (omologhe) del complesso di tipo STAT. Nel caso dell IFN-α, il complesso di tipo STAT è denominato ISGF-3. Tale complesso è, in realtà, formato dalle sopra citate p-84 e p-91, che sono fosforilate sulla tirosina 701, ma anche dalle proteine p-48 e p-113. Le p-84 e p-91 sono omologhe, in quanto provengono dallo splicing alternativo dello stesso gene (la tirosina fosforilata è la 701 in ambedue le proteine). Proteine STAT (STAT-1 e STAT-2): vedi meglio pag.258. È interessante che domini sia SH2 che SH3 sono presenti in p-84, p-91 e p-113 e, quindi, è possibile l interazione con altre entità. In definitiva, il complesso ISGF-3 individua sul DNA le sequenze ISRE (Interferon Stimulated Response Element) e si ha la risposta trascrizionale all IFN-α. 238

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