Tecniche Immunologiche

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1 Tecniche Immunologiche

2 Reazioni Antigene (Ag)/Anticorpo (Ab) Modello Chiave-Serratura Legami non covalenti: Ag Interazione Lisozima/Anti-Lisozima Legami Idrogeno Legami Elettrostatici Legami Idrofobici Molti legami tra Ag e Ab Processo Reversibile H L

3 Affinità dell anticorpo La forza della reazione tra un singolo determinante antigenico ed un singolo sito di legame dell anticorpo Alta Affinita Ab Bassa Affinita Ab Ag Ag Affinita = Somma delle forze attrattive e repulsive

4 Avidità dell anticorpo La forza totale del legame tra un Ag con molti determinanti e Abs multivalenti K eq = 10 4 Affinita 10 6 Avidita Avidita

5 Specificità dell anticorpo n La capacita per un singolo anticorpo di reagire contro un solo determinante antigenico. n La capacita per una popolazione di anticorpi di reagire contro un solo antigene.

6 Reazione Incrociata (Cross- Reazione) La capacita di un singolo anticorpo di reagire contro piu determinanti antigenici. La capacita di una popolazione di anticorpi di reagire contro piu antigeni. Cross-Reazioni Anti- A Ab Anti- A Ab Anti- A Ab Ag A Ag B Epitopo condiviso Ag C Epitopo simile

7 Test Basati sulle Reazioni Ag/Ab n Tutti i test basati sulle reazioni Ag/Ab permettono di misurare piccole quantita degli immunocomplessi. n Tutti i test basati sulle reazioni Ag/Ab possono essere utilizzati per misurare l antigene o l anticorpo presenti nel campione.

8 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA): Saggio di Immunoassorbimento Legato ad Enzima

9 Principio dell ELISA 1 componente (Ag o Ab) immobilizzato su piastra 1 componente (Ag/ Ab / Anti-Ig) marcato con enzima L enzima (perossidasi) reagisce con il substrato La reazione produce una colorazione misurabile Substrato incolore Substrato dopo la reazione Anti-Ig marcato Enzima Ab specifico Piastra ELISA Ag

10 ELISA Diretto per Ag n Rilevamento dell Ag n Immobilizare l Ab n Incubare con il campione da misurare n Aggiungere l Ab marcato con un enzima n La quantita di Ab legato e proporzionale alla quantita di Ag nel campione del paziente. Ø Test Quantitativo Ag nel campione del paziente Immobilizato Ag Fase Solida Ab marcato

11 ELISA Diretto per Ab n Rilevamento dell Ab n n n n Immobilizare l Ag Incubare con il campione da misurare Aggiungere l anti-ig marcato con un enzima La quantita di anti-ig legato e proporzionale alla quantita di Ab nel campione del paziente. Ø Test Quantitativo Ab nel campione del paziente Immobilizato Ag Fase Solida Anti-Ig marcato

12 ELISA Competitivo per l Ag Metodo: 1) Determinare la quantita di Ab necessario per legare una quantita nota di Ag marcato con un enzima. 2) Usare le quantita predeterminate di Ag marcato e di Ab. Aggiungere il campione da misurare contenente l Ag non marcato come competitore. Prima del Test Test + = Ag marcato + + = Ag marcato Campione del paziente +

13 ELISA Competitivo per l Ag n Metodo: Test 3) Determinare la quantita di Ag marcato che si e legato all Ab Fase Solida + + = Ag marcato Campione del paziente Fase Solida + - La concentrazione viene determinata dal confronto con una curva standard usando quantita note di Ag non marcato Ø Test Quantitativo

14 Immunofluorescenza e Citofluorimetria

15 Immunofluorescenza Preparazione dei campioni Accessibilita Ag Antigeni sulla membrana citoplasmatica: -direttamente accessibili Antigeni intracellulari: -inaccessibili senza trattamento preventivo 1) Fissazione 2) Permeabilizzazione

16 Immunofluorescenza Preparazione dei campioni Marcatura Ab Traccianti Fluorescenti: -1 tracciante per singolo Ab = 1 tracciante per singolo Ag - Fino a 4 traccianti diversi per un campione

17 Fluorescenza e Fluorocromi I fluorocromi sono molecole utilizzate come coloranti fluorescenti: -Assorbono l energia della luce Eccitazione -Emettono fluorescenza nel visibile Emissione Fluorocromo Eccitazione (nm) Emissione (nm) Fluoresceina (FITC) Rodammina Ficoeritrina (PE) Texas Red

18 Immunofluorescenza Diretta L anticorpo che riconosce l antigene e marcato con un fluorocromo (molecola fluorescente) Ab marcato con fluorocromo Ag Sezione di un tessuto

19 Immunofluorescenza n Indiretta n L Ab che riconosce l Ag non e marcato n Viene utilizzato un anti-ig marcato con un fluorocromo per rilevare il legame del primo Ab. Ø Test Qualitativo/Semi- Quantitativo Ab non marcato Ag Anti-Ig marcato con fluorocromo Sezione di un tessuto

20 Immunofluorescenza Area T (Paracorticale) Area B (Follicoli) Linfociti T e B all interno di un linfonodo

21 Immunofluorescenza Analisi di Tessuti Analisi di Singole Cellule

22 Citofluorimetria Preparazione dei campioni Accessibilita Ag Antigeni sulla membrana citoplasmatica: -direttamente accessibili Antigeni intracellulari: -inaccessibili senza trattamento preventivo 1) Fissazione 2) Permeabilizzazione

23 Citofluorimetria Preparazione dei campioni Marcatura Ab Traccianti Fluorescenti: -1 tracciante per singolo Ab = 1 tracciante per singolo Ag - Fino a 3 traccianti diversi per un campione

24 Citofluorimetria La sospensione di cellule da analizzare viene marcata con una molecola fluorescente La marcatura avviene con Fluorescenza Diretta o Indiretta Il campione di cellule viene analizzato con un citofluorimetro (FACS)

25 Citofluorimetria Analisi del campione al FACS Istogramma con 1 Parametro Istogramma con 2 Parametri Cellule non marcate Numero di Cellule Cellule fluorescenti Intensita Fluorescenza Verde Intensita Fluorescenza Verde Intensita Fluorescenza Rossa

26 Citofluorimetria Esempio: Analisi cellule da sangue periferico - Miscela di linfociti, monociti e granulociti - Colorazione con Ab monoclonali: 1) Anti-CD14 (specifico per monociti) marcato con ficoeritrina (PE) 2) Anti-CD45 (presente su tutti i leucociti: linfociti>monociti>granulociti) marcato con fluoresceina (FITC)

27 Citofluorimetria Analisi cellule da sangue periferico (1 parametro) CD45 FITC CD45=linfociti>monociti>granulociti (1) (2) (3) CD14 PE CD14=monociti Intensita Fluorescenza

28 Citofluorimetria Analisi cellule da sangue periferico (2 parametri) CD14=monociti CD45=linfociti>monociti>granulociti CD14 PE CD45 FITC R1=monociti (CD14+) R2=linfociti (CD45>monociti) R3=granulociti (CD45<monociti)