INVIO DEL MATERIALE E TRATTAMENTO DEL TESSUTO EMOLINFOPOIETICO

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1 INVIO DEL MATERIALE E TRATTAMENTO DEL TESSUTO EMOLINFOPOIETICO PREMESSA Le procedure riportate di seguito fanno segnatamente riferimento al trattamento del tessuto emolinfopoietico (linfonodo, milza, midollo osseo, etc.). La maggior parte di esse, tuttavia, non ha alcun carattere di specificità, corrispondendo ai passi tecnici ottimali che ogni Struttura di Anatomia Patologica applica o dovrebbe applicare nella gestione del materiale bioptico, indipendentemente dal tipo di patologia in esame. Il raggiungimento del pieno successo nell utilizzazione di tali procedure non può prescindere dalla stretta collaborazione fra Anatomo-Patologo e Clinico o Chirurgo. In particolare, Quest ultimo deve avere completa conoscenza di una serie di problematiche di ordine generale, che saranno trattate sinteticamente nel prosieguo. SCELTA DELL APPROCCIO BIOPTICO LINFOGHIANDOLE SUPERFICIALI In linea di principio, è opportuno effettuare l asportazione completa, con rispetto là dove possibile della capsula. Non altrettanto efficace si rivela la biopsia incisionale: essa, infatti, frequentemente si associa a degenerazione filamentosa dei nuclei per danneggiamento delle cellule nel corso del prelievo: ciò può rendere difficile o, perfino, impossibile l interpretazione del dettaglio citologico, con le conseguenti difficoltà diagnostiche, che non dipendono dal Patologo. Nel caso in cui si sospetti un emopatia, assolutamente da proscrivere è l ago-aspirato: questo, infatti, oltre a non dare alcuna informazione topografica, importante nella diagnostica emolinfopatologica, può addirittura ingenerare false impressioni, causate dalla prevalente aspirazione di una delle componenti cellulari del tessuto esaminato. Così, si spiegano le diagnosi errate di linfoma diffuso a grandi cellule B, talora riscontrate in corso di iperplasia follicolare e dovute all aspirazione di soli centroblasti nel contesto di un centro germinativo in fase secondaria di sviluppo. E vero che il rischio di misinterpretazione potrebbe essere ridotto dall avvio di una parte del materiale aspirato allo studio citofluorimetrico, approccio, tuttavia, che comporta costi di gestione piuttosto elevati. Appare, pertanto, difficile giustificare perché si debba basare la diagnosi e, quindi, la terapia su di un cito-aspirato, quando l esame istopatologico dell intera linfoghiandola è in grado di fornire in tempi brevi una quantità molto più sostanziosa di informazioni, consentendo anche di acquisire materiale che opportunamente conservato può rappresentare uno strumento insostituibile

2 per l attività di ricerca. Da ultimo, non è possibile sottacere un rischio connesso con l aspirazione: in un certo numero di casi, essa è seguita dall infarto del linfonodo per lesione dei vasi ematici da parte dell ago. Se ciò si verifica in un Paziente con una singola adenopatia, nel quale l ago-aspirato non ha prodotto la diagnosi, la successiva asportazione del linfonodo infartuato non è di alcuna utilità. Di fatto, il caso rimane non concluso non certo per colpa del Patologo ed il Paziente deve essere strettamente seguito nel tempo, al fine di cogliere tempestivamente la comparsa di eventuali nuove adenopatie: nel caso di una forma sistemica, ciò comporterebbe un ritardo nell inizio della terapia e potrebbe avere implicazioni giudiziarie. Sempre nel sospetto di un emopatia, inopportuna appare la richiesta di un esame estemporaneo. Infatti, quest ultimo comportando il congelamento del materiale causa una significativa alterazione del dettaglio citologico, che ha fondamentale importanza nella diagnostica ematopatologica. MASSE PROFONDE Vale anche per queste la necessità di disporre di un adeguata quantità di materiale da esaminare, elemento che dovrebbe influenzare la scelta dell approccio strumentale più idoneo (laparotomia, laparoscopia, agobiopsia eco/tac-guidata, etc.). E chiaro, comunque, come in relazione alle condizioni del Paziente, si debba di volta in volta ricercare il giusto compromesso fra l invasività e l accuratezza dell esame. Importante è ricordare che per l ago-aspirato valgono in prima istanza le considerazioni di cui sopra. Per ciò che riguarda l esame estemporaneo, questo rappresenta soltanto il mezzo per stabilire la rappresentatività dell area nella quale si sta operando. Il tessuto prelevato per l estemporanea da una massa profonda non potrà, quindi, costituire l unico campione disponibile per la diagnosi: una volta definita in intraoperatoria l idoneità del campo, dovranno essere effettuate nuove prese da avviare alle procedure routinarie. INVIO DEL MATERIALE Il materiale bioptico deve essere sempre accompagnato da esaurienti notizie cliniche, le quali fanno parte integrante degli elementi richiesti per la diagnosi, come previsto dalla Classificazione dell Organizzazione Mondiale della Sanità. L invio del campione va effettuato in maniera tempestiva, rispettando i tempi concordati con l Anatomo-Patologo in base alla modalità prescelta (a fresco od in fissativo). In caso di invio in fissativo, se il campione tissutale non corrisponde ad un ago-biopsia ed il tempo che intercorre fra l exeresi e la consegna alla Struttura di Anatomia Patologica è di alcune ore, è necessario che il Chirurgo esegua un primo sommario sezionamento, seguendo i

3 protocolli che sono riportati su alcuni Trattati (ad esempio il Rosai and Ackerman s Surgical Pathology, 9 a Edizione, Mosby Editore) che possono essergli facilmente trasmessi dal Patologo. Assolutamente da proscrivere, in quanto scorretta sotto il profilo deontologico e possibile motivo di controversie giuridiche, è la suddivisione del materiale bioptico fra due diverse Strutture di Anatomia-Patologica. LINEE GUIDA PER LA MANIPOLAZIONE DEI PRELIEVI CHIRURGICI (con specifico riferimento al linfonodo) Il tessuto può giungere alla Struttura di Anatomia Patologica a fresco/senza fissativo od in fissativo. Essendo le procedure da seguire in queste eventualità differenti, tali vie verranno descritte separatamente. INVIO A FRESCO Questa procedura è preferibile per l ottimale conservazione degli antigeni e degli acidi nucleici. CONSEGNA La consegna del prelievo all Anatomia Patologica di riferimento deve essere effettuata entro 30 minuti dall asportazione chirurgica; laddove il rispetto dei tempi di consegna non possa essere garantito, si sconsiglia di intraprendere tale via. La modalità consigliata per l invio del materiale bioptico consiste nell avvolgere lo stesso in una garza imbevuta di soluzione fisiologica, ponendo il tutto in un contenitore a tenuta; se il pezzo ha grandi dimensioni, può essere ricoperto da molteplici garze imbevute dello stesso liquido. CAMPIONAMENTO/FISSAZIONE Il campione bioptico va sezionato subito dopo la consegna. Si raccomanda di eseguire sezioni dello spessore massimo di 3-5 mm. A questo punto, possono essere allestite 2 o più apposizioni; di queste, una va asciugata all aria e colorata con May-Grünwald-Giemsa, un altra fissata con cytofix e colorata con Papanicolau. Se le dimensioni del pezzo lo consentono, si consiglia di procedere effettuando prelievi (di dimensioni tali da non occupare l intera superficie del supporto impiegato per la criopreservazione o l inclusione) da avviare a: criopreservazione

4 La procedura ottimale consiste nel porre sul fondo di un contenitore CRYOMOLD STANDARD (modelli 25mm x 20mm x 5mm) un sottile strato di O.C.T. Compound, sul quale va appoggiato il prelievo; quest ultimo deve essere poi completamente ricoperto con altro O.C.T. Compound, avendo cura che il gel non fuoriesca dal contenitore. L intero cryomold è posto a congelare in azoto liquido per circa 1 minuto e, quindi, conservato in ultrafreezer a -80 C. Tale approccio garantisce l ottimale conservazione degli acidi nucleici; fissazione ordinaria Il fissativo di elezione è la formalina. Si raccomanda l uso di formalina tamponata al 10%. Quest ultima viene realizzata, diluendo l aldeide formica al 40%, commercialmente disponibile, in acqua distillata, in un rapporto di 1/10; alla soluzione così prodotta viene aggiunto il tampone, seguendo possibilmente la metodica di Lillie (allegato 1). l tempo di fissazione ottimale è di 24 ore, superate le quali il prelievo può essere conservato in alcool 70% fino al momento dell inserimento nel processatore automatico. E vivamente consigliata la fissazione a temperatura ambiente (non in inclusore). Laddove la disponibilità di materiale lo consenta, una parte del tessuto può essere fissata in B5 (allegato 2). In tale caso, ci si deve attenere ai seguenti accorgimenti: a) il prelievo deve avere spessore massimo di 2 mm, b) il tempo di fissazione ottimale è di ore: tale tempistica va osservata scrupolosamente, pena l indurimento eccessivo del campione, con difficoltà di taglio, c) dopo la fissazione, il pezzo va conservato in alcool 70% fino al momento dell inserimento nel processatore automatico, d) il B5 e la miscela fissativa vanno preparate attenendosi alle istruzioni (allegato 2). Tale approccio, che consente di avere il materiale bioptico in visione in tempi molto rapidi e preserva ottimalmente diversi antigeni, non viene tuttavia consigliato quale unica modalità di fissazione a causa della degradazione degli acidi nucleici, che esso produce. Un alternativa al B5 è rappresentata dalla fissazione in liquido di Bouin (allegato 3). Anche in questo caso, vanno eseguiti prelievi sottili, dato lo scarso potere di penetrazione del fissativo, ed il tempo di esposizione deve essere limitato a poche ore (18 al massimo), a causa dell indurimento del pezzo prodotto dal Bouin. Dopo la fissazione, il campione tissutale va lavato in alcool 70%, fino alla quasi completa rimozione del colore giallo da questo assunto durante la fissazione;

5 ulteriori procedure applicabili alla biopsia a fresco per: 1) esami culturali/microbiologici Appare indispensabile che l invio del materiale alla Struttura di Anatomia Patologica avvenga in maniera sterile e che le condizioni di sterilità siano garantite durante la successiva manipolazione/sezionamento del tessuto da parte del Patologo; 2) analisi citogenetiche di cariotipo Come per tutte le procedure che coinvolgono il linfonodo a fresco è necessario che trascorra un brevissimo lasso di tempo tra l asportazione del pezzo e la sua manipolazione che deve seguire le fasi seguenti: a) preparazione della coltura (fase da eseguirsi in sterilità): - mettere circa 2 ml di terreno di coltura (RPMI 1640) in una capsula di Petri (grande) o in un mortaio e provvedere a mettervi una fettina od un pezzetto di tessuto; - sminuzzare il tessuto usando un bisturi monouso (se si usa la capsula di Petri) od il pestello (se si usa il mortaio); - procedere ad una conta automatizzata delle cellule; - prendere una quantità di tessuto che contenga circa 60 milioni di cellule ed aggiungere terreno di coltura fino a 10 ml. (laddove si riesca ad ottenere solo una minore quantità di tessuto utilizzare solo 5 ml. di terreno di coltura); - se possibile, allestire almeno 6 colture ed incubare a 37 C al 5% di CO 2 per tempi diversi (due per 24 ore, 2 per 48 ore, 2 per 72 ore); b) arresto in metafase (fase da eseguirsi in sterilità): - terminata la fase (a) aggiungere 40 microlitri di colcemid lasciando incubare a 37 C al 5% di CO 2 per tempi di 20 e 40 minuti per ogni coppia di colture; c) fase di raccolta ( harvest ): - centrifugare i campioni per 10 minuti a 1200 rpm; - rimuovere il sopranatante; - aggiungere 8 ml si soluzione ipotonica e mixare ; - lasciare riposare per 20 minuti a 37 C; - vortexare aggiungendo 5 ml di fissativo; - centrifugare per 10 minuti a 1200 rpm; - rimuovere il sopranatante; - aggiungere 5 ml di fissativo: i primi 2 ml goccia a goccia; - centrifugare per 10 minuti a 1200 rpm; - fare tre lavaggi con il fissativo; d) allestimento vetrini: - eliminare il sovranatante e risospendere il fondello con il fissativo; - allestire tre vetrini per ogni campione;

6 - conservare il materiale rimasto a 20 C; e) colorazione dei vetrini: - colorare per ogni campione un vetrino con soluzione di Giemsa al 10% in tampone per 3 minuti; - mettere i restanti due vetrini in termostato a -60 C da 1 a 3 giorni e poi colorali mediante bandeggio G; 3) conservazione di cellule vitali selezionate Come per tutte le procedure che coinvolgono il linfonodo a fresco è necessario che trascorra un brevissimo lasso di tempo tra l asportazione del pezzo e la sua manipolazione che deve seguire le fasi seguenti: a) trattamento del campione: - mettere circa 2 ml di terreno di coltura (RPMI 1640) in una capsula di Petri (grande) o in un mortaio e provvedere a mettervi una fettina od un pezzetto di tessuto; - sminuzzare il tessuto usando un bisturi monouso (se si usa la capsula di Petri) od il pestello (se si usa il mortaio); b) separazione delle cellule: - mediante citocentrifugazione per densità, con isolamento dello strato desiderato (procedura opzionale, che può precedere la separazione con biglie); - mediante l uso di biglie magnetiche (con conferma mediante FACS analisi della purezza delle cellule isolate); - conteggio delle cellule isolate; - criopreservazione in aliquote definite delle cellule isolate (4-8 milioni), poste in 60% di siero bovino fetale, 30% di terreno coltura (RPMI 1640) e 10% di DMSO; la criopreservazione avviene a -80 C; a distanza di ore, le aliquote sono trasferite in Azoto liquido, ove vengono conservate fino al momento dell uso. INVIO IN FISSATIVO Quale fissativo si intende generalmente la formalina (con le specifiche di cui sopra). CONSEGNA La consegna del campione bioptico all Anatomia Patologica di riferimento in un contenitore a tenuta deve essere effettuata entro la stessa giornata lavorativa rispetto all asportazione chirurgica. Laddove, per motivi organizzativi delle sale operatorie e/o dei servizi di anatomia patologica, tale modalità non possa essere rispettata, si raccomandano accordi preventivi con i Colleghi Chirurghi, affinché procedano al parziale sezionamento del

7 campione, secondo le indicazioni fornite dal Patologo (vedi sopra), in modo da evitare che le aree più profonde non raggiunte dalla formalina (che ha una capacità di penetrazione di 4 mm in 16 ore) vadano incontro a fenomeni autolitici. Il rapporto volumetrico tra il campione bioptico ed il fissativo deve essere di circa 1/20. CAMPIONAMENTO Il campionamento del prelievo va eseguito preferibilmente entro la giornata di consegna: laddove ciò contrasti con l organizzazione del Servizio, si raccomanda comunque la valutazione macroscopica del materiale da campionare e l esecuzione degli atti necessari a garantire l omogenea fissazione (tagli di ampie masse, aperture di organi cavi giunti chiusi etc). Si raccomandano prelievi dello spessore di 3-5 mm e di non eccessiva ampiezza (nello specifico evitare che il prelievo occupi l intera superficie dell unicassetta, pena il rischio che, nel corso delle operazioni di inclusione, il campione si imbarchi, rendendo poi difficile la completa scopertura della sua superficie di taglio, al momento del sezionamento al microtomo). FISSAZIONE: Dopo la campionatura, in relazione allo stato macroscopico di fissazione del pezzo, il campione può essere ancora conservato in formalina o posto in alcool 70%. In ogni caso, vanno rispettate le indicazioni sopra riportate: a) uso di formalina tamponata al 10%, partendo dall aldeide formica con concentrazione al 40%, commercialmente disponibile, ed utilizzando possibilmente il tampone previsto dalla metodica di Lillie (allegato 1), b) tempo di fissazione medio di 24 ore a temperatura ambiente (non in inclusore). Laddove vi sia la necessità di avere in visione dei preparati in tempi rapidi, incompatibili con le convenzionali 24 ore di fissazione in formalina, si può procedere ad una post-fissazione in B5 per , in modo da avviare la processazione del pezzo in giornata. Per le modalità di preparazione del B5 e della miscela fissativa si veda l allegato 2. Il liquido di Bouin può rappresentare un alternativa al B5 (allegato 3). LINEE GUIDA PER LA MANIPOLAZIONE DELLE AGOBIOPSIE (non osteomidollari) E DELLE BIOPSIE ENDOSCOPICHE Tali prelievi giungono usualmente all Anatomia Patologica già in fissativo. Il fissativo di elezione è la formalina (da usare tamponata al 10%, partendo dall aldeide formica a concentrazione 40%, commercialmente disponibile; per il tamponamento secondo Lillie, si veda l allegato 1). Il tempo di fissazione raccomandato va dalle 12 alle 24 ore.

8 Dopo la fissazione, la biopsia va posta in alcool 70% fino al momento dell inserimento nel processatore automatico. LINEE GUIDA PER LA MANIPOLAZIONE DELLE AGOBIOPSIE OSTEOMIDOLLARI FISSAZIONE Usualmente le biopsie osteo-midollari giungono al Servizio di Anatomia Patologica in fissativo. Per quest ultimo, si prospettano le seguenti alternative: fissazione in B5 Impone molta attenzione nel rispetto dei tempi di fissazione, pena l indurimento eccessivo del campione con importanti difficoltà di taglio. Tali tempi corrispondono a ore per soluzioni preparate presso l Ospedale (vedi anche allegato 2 per la preparazione del B5 e della miscela fissativa) ed a 1.30 ore per soluzioni commercialmente disponibili (tipo BIOPTICA-Mielodec reagente A). GIUDIZIO: ottimale per rapidità e conservazione sia citologica che antigenica; non consente studi molecolari. Presuppone collaboratività con il Personale tecnico-infermieristico, che assiste all esecuzione della biopsia; fissazione in formalina Usare formalina tamponata al 10% (vedi sopra + allegato 1); tempo di fissazione ore; dopo la fissazione porre la biopsia in alcool 70% fino al momento dell inserimento nel processatore automatico. GIUDIZIO: non ottimale per la conservazione del dettaglio citologico; analoga al B5 per la conservazione antigenica; consente studi molecolari; CONSERVAZIONE Dopo la fissazione, la biopsia va posta in alcool 70% per almeno 20 minuti. Si segnala come l alcool 70% costituisca il mezzo nel quale la biopsia osteomidollare fissata può essere conservata anche per tempi lunghi, prima di essere sottoposta alla successiva fase di decalcificazione. Ciò permette anche la spedizione del campione fissato in sedi distanti: il dettaglio citologico ed il profilo antigenico rimangono sostanzialmente immodificati, specie nel caso in cui sia stato usato il B5 quale fissativo. DECALCIFICAZIONE Immergere la biopsia in liquido decalcificante, verificando che questa non tenda a galleggiare (fenomeno possibile nei casi a ricca componente adiposa). Rispettare il rapporto ottimale tra il volume del campione e quello del decalcificante (almeno 1:20).

9 Il tempo di decalcificazione varia in base al tipo di liquido decalcificante utilizzato: a) per soluzioni preparate presso il Laboratorio secondo le indicazioni dell allegato 4: 180 minuti; b) per la soluzione BIOPTICA-Mielodec Reagente B: minuti. Terminata la decalcificazione, la biopsia viene nuovamente posta in alcool 70% fino all inizio della processazione.

10 ALLEGATI Allegato 1: FORMALINA TAMPONATA SECONDO LILLIE Componenti: Aldeide formica 40% 100ml Acqua distillata 900ml Na 2 H 2 PO 4 H 2 O 4g Na 2 HPO 4 6.5g La confezione di aldeide formica va conservata al buio, a temperatura ambiente Allegato 2: B5 PREPARAZIONE DEL B5 (SOLUZIONE MADRE) Componenti: Mercurio cloruro ico 6g Sodio acetato anidro 1.25g Acqua distillata 90 ml Preparazione: - far bollire per 45 una quantità di acqua distillata sufficiente per la soluzione (90 ml) e per il lavaggio della vetreria di lavoro; - dopo 45 di ebollizione, misurare 90 ml di acqua distillata e sciogliervi, con agitazione, prima il mercurio cloruro ico e poi il sodio acetato anidro; - filtrare la soluzione su carta. Il B5 va conservato in bottiglie di vetro scuro con l indicazione della data di preparazione. Sostituire la soluzione madre almeno una volta alla settimana. PREPARAZIONE DEL B5 (SOLUZIONE DI LAVORO) Al momento della biopsia miscelare 9 ml del B5 (soluzione madre) e 1 ml di aldeide formica al 40% (la confezione di aldeide formica va conservata al buio, a temperatura ambiente); il frustolo agobioptico va immerso in tale miscela e da questo momento va calcolato il tempo di fissazione.

11 Allegato 3: PREPARAZIONE DEL LIQUIDO DI BOUIN - Mescolare 75 ml di soluzione satura di acido picrico con 25 ml di formalina madre (soluzione satura di aldeide formica al 40%); - Aggiungere 5 ml di acido acetico glaciale. Allegato 4: PREPARAZIONE DEL DECALCIFICANTE - Portare 1 litro di acqua distillata ad ebollizione; - sciogliere a caldo 37,22g di sale bisodico dell acido etilen-diamino-tetraacetico (EDTA); - raffreddare a 40 C ed aggiungere 70 ml di HCL concentrato; - lasciar riposare una notte e filtrare.

12 PROCESSAZIONE DEL TESSUTO Una volta terminata la fase di fissazione, i prelievi vanno posti nel processatore automatico od inclusore. Relativamente a questa fase, si raccomandano i seguenti accorgimenti: a) evitare la fissazione a temperatura; b) garantire tempi di disidratazione, chiarificazione ed impregnazione in paraffina sufficienti (almeno 45 minuti per stazione); c) applicare un ottimale sequenza di reagenti [ad esempio: alcool 70, alcool 80, alcool 90, alcool 95, alcool 100 (x3), diafanizzante (x3), paraffina con punto di fusione a 56 C, addittivata con polimeri (x4)]; d) garantire la frequente pulizia della macchina ed il ricambio dei vari reagenti (in particolare, scalando possibilmente ogni giorno l ultimo degli alcool, dei diafanizzanti e delle paraffine). INCLUSIONE Le unicassette, prelevate dal processatore automatico, vengono poste nella camera calda della centralina d inclusione ed aperte una alla volta. Il procedimento di inclusione segue modalità standard. Si raccomanda che temperatura della paraffina rimanga compresa tra 56 e 57 C, in ogni fase del processo di inclusione (ivi compresa quella di dispensazione). SEZIONAMENTO Il procedimento di sezionamento segue modalità standard. Si raccomandano sezioni di spessore non superiore a 3 micron (monostrato di cellule) rappresentative dell intera superficie di sezione del campione. RACCOLTA DELLE SEZIONI Il procedimento di raccolta delle sezioni segue modalità standard. Si raccomanda che la temperatura del bagno termostatico non superi i C (necessari controlli sistematici), allo scopo di fare distendere le sezioni in maniera ottimale, eliminando così eventuali ripiegature.

13 I vetrini con le sezioni raccolte vanno posizionati in apposite griglie portavetrini e lasciate asciugare in stufette a 37 C per un tempo massimo di 60 minuti. Se per l indagine immunoistochimica si utilizza un coloratore automatico, si raccomanda di utilizzare vetrini a carica elettrica per la raccolta delle sezioni; se l immunocoloratore lavora per capillarità di risalita del reagente è opportuno che nella fase di raccolta, la sezione venga posizionata nella metà inferiore del vetrino, in modo che possa essere raggiunta agilmente dai reagenti. Le sezioni destinate alla Biologia Molecolare vanno tagliate con uno spessore di 10 micron, raccolte in contenitori eppendorf o su vetrini (opzione definita dal Personale addetto all esecuzione dell indagine molecolare). COLORAZIONI ISTOMORFOLOGICHE Le colorazioni da eseguire routinariamente per la diagnostica ematopatologica sono la Ematossilina Eosina, il Giemsa l impregnazione argentica secondo Gomori (quest ultima almeno per le biopsie osteomidollari). Colorazioni aggiuntive utili ai fini diagnostici sono: l acido Periodico di Schiff (PAS), il Pearls, lo Ziehl-Neelsen ed il Rosso Congo. Tutte le sezioni devono venire sottoposte al processo di sparaffinatura e reidratazione del tessuto. Nell esecuzione manuale, tale processo prevede: alcool etilico 100%: alcool etilico 95 alcool etilico 80 alcool etilico 70 alcool etilico 50 acqua distillata 2 passaggi di 20 minuti ciascuno; 3 passaggi; 1 passaggio (alcuni risciacqui); 1 passaggio (alcuni risciacqui); 1 passaggio (alcuni risciacqui); 1 passaggio (alcuni risciacqui); 1 passaggio (alcuni risciacqui). Qualora le colorazioni vengano effettuate in maniera automatizzata, i tempi di sparaffinatura e di re-idratazione sono indicati nella specifica procedura (vedi sotto). Le colorazioni possono venire eseguite, sia manualmente (evenienza necessaria per il Giemsa) che in coloratore automatico, con possibili modifiche dei tempi previsti per le singole fasi, per cui si daranno prima

14 indicazioni sulle modalità di colorazione manuale e poi di quelle in automatico. COLORAZIONI MANUALI Colorazione Giemsa (secondo Lennert) 1 soluzione di Giemsa (preferibilmente Merck) diluita al 50% con acqua distillata: 5 minuti 2 Soluzione acida (10 gocce di acido acetico puro in 200 ml di acqua distillata): 2-3 passaggi (questo passaggio non si esegue per le sezioni ottenute da biopsie osteomidollari) 3 Alcool etilico 95% : alcuni passaggi 4 Fase di differenziazione : controllo al microscopio ottico dell intensità di colorazione per valutare l eventuale necessità di ulteriori passaggi in alcool 95% 5 Alcool isopropilico 6 : in tale liquido i vetrini possono permanere a lungo. Di regola vi permangono sino alla fase successiva di montaggio In caso di estemporanea: i passaggi osservano la stessa sequenza, ma vengono accorciati i tempi (Giemsa 1 minuto circa, rapido passaggio in acqua acida, rapido passaggio in alcool 95%, rapido passaggio in alcool isopropilico e lavaggio breve in Histoclear). Nel caso in cui il tessuto sia stato fissato in liquido di Bouin, oltre ai prolungati lavaggi del pezzo in alcool 70% prima della processazione, è necessario effettuare lavaggi prolungati delle sezioni, sia in alcool 70% (durante la fase di reidratazione) che in acqua (a reidratazione terminata), prima di procedere alla colorazione in Giemsa. Ematossilina Eosina Ematossilina: Acqua di fonte: Eosina G: Acqua distillata: Alcool 70% : Alcool 80% : Alcool 95% : Alcool 100% : : immersione per 5 minuti lavaggio rapido (10 secondi) immersione per 5 minuti lavaggio rapido (10 secondi) lavaggio rapido (5 secondi) lavaggio rapido (5 secondi) lavaggio rapido (5 secondi) lavaggio con 3 cambi (5-10 secondi ciascuno) lavaggio con 3 cambi (5-10 secondi ciascuno) In caso di estemporanea: i passaggi osservano la stessa sequenza, ma vengono accorciati i tempi [Ematossilina 1 minuto, rapido passaggio in acqua

15 di fonte, Eosina 1 minuto, rapidi lavaggi in acqua distillata, rapidi lavaggi nella scala crescente degli alcooli (100%, 95%, 80%, 70%), lavaggio breve in Histoclear] Impregnazione argentica secondo Gomori: 1. Permanganato di potassio allo 0,5%. acidificato con acido solforico al 3% 2. Lavaggio in acqua distillata 3. Acido ossalico al 5% (lasciare le sezioni in soluzione fino a schiarimento) 4. Lavaggio in acqua distillata 5. Soluzione di ferro ammonio solfato-ico al 2% 6. Lavaggio in acqua distillata 7. Nitrato d argento filtrato 8. Soluzione di formalina al 10% (togliere le sezioni non appena le stesse si scuriscono) 9. Lavaggio in acqua distillata 10. Tiosolfato di sodio al 5% 11. Lavaggio in acqua distillata 12. Alcool 70% 13. Alcool 80% 14. Alcool 95% 15. Alcool 100%: 3 passaggi 16. : 3 passaggi Modalità di preparazione della soluzione di argento ammoniacale: In 10 cc di soluzione acquosa di nitrato di argento al 10% aggiungere goccia a goccia ammoniaca concentrata, fino a scomparsa del precipitato. Aggiungere quindi 10 cc di idrossido di sodio al 3%: tale aggiunta induce la formazione di un precipitato nero. Aggiungere lentamente, goccia a goccia dell ammoniaca, fino a che la soluzione non diventa limpida ed incolore. A questo punto si aggiungono 100 cc di acqua distillata. La soluzione così ottenuta va conservata in un contenitore di vetro scuro a +4 C. ACIDO PERIODICO DI SCHIFF (PAS): 1. Acido periodico all 1%: 10 minuti 2. Lavaggio in acqua distillata 3. Reattivo di Schiff: 20 minuti 4. Lavaggio in acqua di fonte 5. Contrasto con emallume 6. Lavaggio in acqua di fonte 7. Alcool 70% 8. Alcool 80%

16 9. Alcool 95% 10. Alcool 100%: 3 passaggi 11. : 2 passaggi PAS DOPO DIASTASI: 1. Ricoprire la sezione con una soluzione di alfa-amilasi allo 0,1% per 15 minuti. 2. Lavaggio in acqua distillata 3. procedere come per il PAS (vedi sopra) ZIEHL NEELSEN 1. Fucsina pura filtrata: 5 minuti, fiammeggiando e facendo attenzione a non fare asciugare le sezioni 2. Lavaggio in acqua distillata 3. Acido solforico 20% 4. Lavaggio in acqua distillata 5. Acido solforico 20% 6. Lavaggio in acqua distillata 7. Acido solforico 20% 8. Lavaggio in acqua distillata 9. Alcool 95% 10. Lavaggio in acqua distillata 11. Contrasto con blu di metilene 12. Alcool 70% 13. Alcool 80% 14. Alcool 95% 15. Alcool 100%: 3 passaggi 16. : 3 passaggi COLORAZIONI AUTOMATIZZATE Ematossilina Eosina: Alcool 100% Alcool 95% Alcool 80% Alcool 70% Alcool 50% Acqua corrente Ematossilina di Gill Acqua corrente Eosina 10 minuti 10 minuti 25 minuti 25 minuti 25 minuti 25 minuti 25 minuti 30 minuti 5 minuti 10 minuti 3 minuti

17 Acqua corrente Alcool 70% Alcool 80% Alcool 95% Alcool 100% Impregnazione Argentica: Alcool 100% Alcool 95% Alcool 80% Alcool 70% Alcool 50% Acqua corrente Permanganato Acqua corrente Acido Ossalico Acqua corrente Argento Nitrato Acqua Formalina Acqua Sodio Tiosolfato Acqua Alcool 70% Alcool 80 Alcool 95% Alcool 100% 10 minuti 10 minuti 10 minuti 10 minuti 1 minuto tempo indefinito; in base alla contingenza d uso 20 minuti 1 minuto 20 minuti 1 minuto 20 minuto 1 minuto 20 minuti 40 minuti 20 minuti 1 minuto 20 minuti 1 minuto tempo indefinito; in base alla contingenza d uso MONTAGGIO Il montaggio dei vetrini può essere eseguito a mano o tramite un montavetrini automatico. Il montante è rappresentato dalla gelatina Eukitt.