Analisi di possibili cofattori coinvolti nell eziopatogenesi del sarcoma di Kaposi

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1 Consorzio 21 Edificio 2- Polaris Programma Master and Back Loc. Piscina Manna Pula Programma di Tirocinio Stage Analisi di possibili cofattori coinvolti nell eziopatogenesi del sarcoma di Kaposi 1. Soggetto Proponente Ragione Sociale: Istituto di Clinica Dermatologia, Dipartimento Strutture Specialità Microchirurgiche, Università degli Studi di Sassari, Indirizzo: Viale San Pietro 43/b, Sassari Telefono: Fax: Rappresentante Legale: Prof. Alessandro Maida Referente per il Programma: Prof.ssa Francesca Cottoni Tipologia: Università Breve Presentazione del Soggetto Proponente Operante in Sardegna L attività dell Istituto di Clinica Dermatologica è incentrata sulla diagnosi, sul trattamento e sulla prevenzione di tutti i tipi di patologie che interessano la cute, le mucose e gli annessi cutanei, nonché sulla didattica e ricerca. L attività assistenziale si svolge presso il reparto, l ambulatorio divisionale e gli ambulatori specialistici (Fototerapia, Malattie Sessualmente Trasmesse, Studio e Prevenzione dei tumori della pelle, Dermatologia Allergologica). La struttura è centro di riferimento per la cura della psoriasi (PSOCARE) e per lo studio e la cura del Sarcoma di Kaposi (SK) classico/mediterraneo. E presidio di rete per le Malattie rare dermatologiche per la provincia di Sassari. Nell Istituto di Clinica Dermatologica è presente il laboratorio di Immunodermopatologia dove vengono svolte attività di ricerca e diagnosi delle malattie autoimmuni ad interessamento cutaneo e sistemico. L attività didattica dei docenti afferenti all Istituto di Clinica Dermatologia si svolge nel Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia, Corso di Laurea in Odontoiatria e Protesi Dentaria, Corso di Diploma Universitario per infermieri, Scuola di Specializzazione in Dermatologia e 1

2 Venereologia e Master 1 livello in Medicina della Cooperazione. Nell ambito della ricerca l Istituto di Clinica Dermatologica ha sviluppato numerose collaborazioni con Ospedali ed Enti di Ricerca in Italia e all estero: Istituto Superiore di Sanità-Roma, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologia Università di Roma la Sapienza, Dipartimento di Patologia Umana ed Ereditaria Sezione di Biologia Generale e Genetica Medica Università di Pavia, Cattedra di Genetica Medicina Università di Cagliari, Departments of Dermatology and Pathology Helsinki University Central Hospital, Department of Veterans Affairs Connecticut Healthcare System West Haven Connecticut ecc. E stata coinvolta in numerosi progetti di ricerca Nazionali ed Internazionali riguardanti lo studio del SK classico, la Sindrome di Werner, le Malattie Bollose a patogenesi autoimmunitaria ed altre patologie ad interessamento cutaneo. 2. Soggetto Ospitante Ragione Sociale: Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologica, Università degli Studi di Roma "La Sapienza Indirizzo: Viale Regina Elena, Roma Telefono: Fax: Rappresentante Legale: Prof. Mario Piccoli Referente per il Programma: Prof. Antonio Angeloni Tipologia: Università Breve Presentazione del Soggetto Ospitante Il Laboratorio di Virologia Oncologica, presso il quale saranno condotti gli studi descritti, è parte del Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologica dell Università degli Studi di Roma "La Sapienza. Nel Laboratorio e nei locali del Dipartimento sono disponibili le apparecchiature richieste per poter eseguire il programma presentato. Inoltre afferiscono al Laboratorio di Virologia Oncologica oltre al Prof Angeloni, Referente del presente progetto, numerosi laureati e personale tecnico con esperienza ormai pluriennale sulle problematiche che verranno analizzate. La competenza scientifica del gruppo ospitante è testimoniata dalle numerose pubblicazioni su riviste internazionali aventi come oggetto il virus HHV-8 e le patologie umane ad esso associate. 3. Accordo/Programma di Collaborazione Tipologia dell Accordo/Programma di Collaborazione Sviluppo della Ricerca Scientifica e Tecnologica. Formazione del Capitale Umano. 2

3 Descrizione dell Accordo/Programma di Collaborazione Obiettivi Il programma di collaborazione promosso dalla Clinica Dermatologica dell Università di Sassari e il Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologica dell Università degli Studi di Roma "La Sapienza" e inserito nell ambito di una serie di progetti riguardanti lo studio del virus erpetico Human Herpesvirus-8 (HHV-8) e la sua associazione con il sarcoma di Kaposi (SK). La Sardegna rappresenta una delle aree geografiche a più alta prevalenza d infezione da parte di HHV-8 ed al contempo a più alta incidenza della variante classica del SK. Tuttavia i meccanismi che sottendono al processo neoplastico che fa seguito all infezione non sono noti e certamente altri cofattori sono implicati. Da questo punto di vista, è senz altro importante il complesso network di informazioni che si stabiliscono tra cellule infettate e virus, nonché il ruolo della risposta immunitaria nel controllare l andamento dell infezione e la proliferazione delle cellule infettate. L obiettivo del presente studio e quello di valutare le alterazioni nell espressione dei fattori di crescita che si verificano a livello locale nelle biopsie ottenute da pazienti affetti dalla forma classica del SK e le interazioni virus-cellula che conseguono allo stabilirsi dell infezione in vitro di colture primarie di cheratinociti, nonché l andamento della risposta immune cellula mediata nel controllo dell infezione da parte di HHV-8. Attività Realizzate e/o Previste Il Sarcoma di Kaposi (SK) è una neoplasia vascolare multicentrica, caratterizzata da macule, noduli e placche angiomatoidi a prevalente interessamento cutaneo. Si distinguono quattro varianti: forma classica o Mediterranea, forma endemica o Africana, quella conseguente a trapianti renali o a terapie immunosoppressive e infine la variante epidemica o AIDS-associata. Un ruolo fondamentale nello sviluppo del SK è svolto dal virus Human Herpesvirus 8 (HHV-8), il quale è stato visto essere invariabilmente legato a tutte le forme di SK. Uno studio epidemiologico, comprendente il periodo fra il 1977 e il 2003, condotto nelle province di Sassari e Nuoro, con una popolazione di (censimento 2001), ha evidenziato una incidenza del SK classico pari a 4,06/ /abitanti/anno che rappresenta la più alta incidenza nell'ambito di una popolazione altamente omogenea dal punto di vista genetico. Dal 1977 presso la Clinica Dermatologica dell Università di Sassari è stata raccolta un ampia casistica di pazienti affetti da SK e vengono condotti studi volti a valutare gli aspetti epidemiologici, genetici ed ambientali del SK classico. Ormai da numerosi anni, alcuni di questi studi sono condotti in collaborazione con il Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologia dell Università degli Studi di Roma "La Sapienza". La Clinica Dermatologica dell Università di Sassari intende dare la possibilità ad un giovane ricercatore sardo, di partecipare ad esperienze formative on the job di eccellenza nell ambito del programma di collaborazione per lo sviluppo della ricerca scientifica col Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologica dell Università degli Studi di Roma "La Sapienza". 3

4 Il presente programma di ricerca si propone di valutare le alterazioni nell espressione dei fattori di crescita che si verificano a livello locale nelle biopsie ottenute da pazienti affetti dalla forma classica del SK e le interazioni virus-cellula che conseguono allo stabilirsi dell infezione in vitro di colture primarie di cheratinociti, nonché l andamento della risposta immune cellulo-mediata nel controllo dell infezione da parte di HHV-8. Risultati Attesi Il presente progetto è finalizzato ad esaminare a livello molecolare le interazioni tra HHV-8 e cellule infettate sia a seguito di infezione de novo in vitro sia mediante l indagine condotta su prelievi bioptici ottenuti da pazienti affetti da SK. I risultati attesi sono pertanto quelli di conseguire nuove informazioni sul coinvolgimento di fattori di crescita, citochine e loro recettori nel processo che sottende allo sviluppo del Sarcoma di Kaposi in soggetti infettati da HHV-8. Un ulteriore aspetto che verrà preso in esame sarà lo studio del coinvolgimento del sistema immune ed in particolare della risposta cellulo-mediata nell eziopatogenesi del SK. I risultati attesi in questo ambito saranno pertanto legati alla determinazione delle eventuali alterazioni del pattern di risposta cellulo-mediata paragonando soggetti affetti da SK, individui sani sieropositivi o sieronegativi per HHV-8. Piano di Lavoro Con Il presente programma di collaborazione intendiamo valutare un duplice aspetto: le interazioni virus-cellula che conseguono allo stabilirsi dell'infezione in vitro. la risposta immunologica mediata da cellule T nei confronti del virus HHV-8. Lo studio delle interazioni tra HHV-8 e cellule infettate in vitro sarà condotto seguendo l andamento dell infezione de novo di colture primarie di cheratinociti, di cellule dendritiche isolate da sangue periferico e di colture di cellule endoteliali microvascolari dermiche, già note per essere suscettibili all infezione da parte di HHV-8. In particolare, si valuterà se l infezione da parte di HHV-8 sia in grado di indurre una variazione nel pattern di citochine, di fattori di crescita e dei rispettivi recettori nelle colture di cellule esaminate. Ancora oggi i modelli cellulari disponibili per lo studio in vitro di HHV-8 risultano ostici al momento di permettere il rilascio di nuovo virus infettante. Recentemente il Laboratorio del Prof. Angeloni ha raggiunto risultati soddisfacenti nella produzione di nuova progenie virale: ciò ci fa guardare con fiducia alla possibilità di poter sviluppare dei modelli sperimentali consistenti d infezione. Una volta che il virus sarà stato messo in contatto con le colture cellulari sopra indicate, si verificherà l avvenuta infezione sia cercando la presenza di DNA virale, mediante PCR, che analizzando mediante immunofluorescenza acquisita l espressione di antigeni virali. Questi dati saranno messi in rapporto a quelli per l espressione dei vari fattori di crescita, citochine e loro recettori prendendo in particolare considerazione i prodotti genici appartenenti ai tessuti epiteliale e connettivale, tessuti che risultano coinvolti nel processo patologico del SK. In caso di variazioni del pattern di 4

5 espressione di geni cellulari, si passerà poi allo studio del ruolo di singoli geni di HHV-8 nella modulazione dell attività cellulare, procedendo a singole transfezioni geniche in luogo dell infezione. Particolare riguardo sarà posto nei confronti di quei geni virali che si è visto codificano proteine che presentano notevoli omologie con citochine di nature cellulare, di fattori di crescita e di loro recettori. Inoltre sarà oggetto d indagine l eventuale ruolo svolto sul ciclo biologico di HHV-8 dal trattamento di suddette colture cellulari infettate con citochine e/o fattori di crescita secrete fisiologicamente o a seguito di uno stato infiammatorio dagli elementi cellulari presenti in una lesione di sarcoma di Kaposi. Un secondo aspetto che sarà preso in esame è il ruolo del sistema immune nel controllare l andamento dell infezione in vivo. In particolare, per quanto attiene lo studio del coinvolgimento della risposta immune T-mediata nello sviluppo del C-KS, lo studio procederà attraverso le seguenti fasi: a. Frazionamento di linfociti di sangue periferico (PBL) di pazienti affetti da C-KS in 2 popolazioni: cellule aderenti (monociti/macrofagi) e cellule non aderenti ed esame della presenza di HHV-8 nelle due popolazioni mediante PCR nonché di trascritti latenti e litici virali mediante RT-PCR. I risultati ottenuti saranno paragonati con quelli delle stesse cellule prelevate da soggetti sieropositivi per HHV-8 ma sani, così come da individui sieronegativi; b. Coltivare i monociti/macrofagi di soggetti affetti da C-KS e di controlli sani HHV-8+ e HHV-8- con GM-CSF e IL-4 allo scopo di valutare la capacità di differenziazione in cellule dendritiche (DC). Valutare le eventuali differenze tra le cellule dendritiche dei malati e dei gruppi di controllo in termini funzionali (processazione e presentazione dell antigene) e in termini fenotipici (analisi al citofluorimetro dell espressione di molecole implicate nella presentazione dell antigene e di molecole co-stimolatorie). Verrà anche analizzata la produzione di citochine che promuovono una risposta Th1 o Th2 da parte delle DC dei pazienti affetti da C- KS (IL-12 o IL-10) per correlare poi la produzione di citochine da parte delle DC ad un eventuale alterazione del rapporto Th1/Th2 e Tc1/Tc2 nel sangue periferico dei pazienti stessi o dei controlli sani. Peraltro è stato riportato che le DC dei pazienti affetti da C-KS sono ridotte nel numero e presentano una diminuita produzione di IL-12. c. Valutare l efficienza della risposta T-specifica nei confronti di HHV-8 analizzando contemporaneamente la risposta T nei confronti di antigeni di richiamo comuni. In particolare sarà determinata sia la funzione di stimolo delle DC dei pazienti C-KS che quella di risposta da parte dei linfociti T in presenza di HHV-8 purificato o di peptidi sintetici derivati da proteine virali ad alta affinità per l HLA dei donatori. Infine sarà interessante correlare la risposta immune cellulare alla risposta immune umorale e al viral load di HHV-8 valutato mediante real time PCR, soprattutto nelle fasi di remissione e riacutizzazione di malattia. E stato riportato che il titolo sierologico sia direttamente correlato al viral load e inversamente correlato all efficienza della risposta immune cellulare. Altro aspetto che verrà preso in esame sarà il tentativo di misurare le citochine, quali ad esempio la IL-6 e il VEGF, prodotte localmente così come il livello di quelle circolanti in rapporto alle varie fasi della malattia. Ciò potrebbe essere interessante in rapporto al fatto che il C-KS 5

6 sembra dipendere per il suo sviluppo ed accrescimento dalla presenza di alcune citochine prodotte dalle stesse cellule tumorali o da altre cellule infiltranti il tumore. Risorse Professionali Impegnate Per l attuazione del piano di lavoro, inserito nel programma di collaborazione, è prevista la partecipazione di un ricercatore con esperienza di laboratorio in ambito dermatologico. Il tirocinante collaborerà con i ricercatori e dottorandi afferenti al Dipartimento Ospitante ed avrà il supporto da parte del Referente per il Programma Prof. Antonio Angeloni. Risorse Finanziarie Impegnate Le risorse finanziarie necessarie per lo svolgimento delle attività previste dal programma di stage saranno rese disponibili dal Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologica dell Università di Roma "La Sapienza. Il Dipartimento Ospitante fornirà supporto logistico mettendo a disposizione la strumentazione da laboratorio e i materiali di consumo necessari per la realizzazione del programma di ricerca. I costi previsti per il materiale di consumo che sarà utilizzato in questo progetto sono valutabili in Euro. Modalità di Formalizzazione dell Accordo/Programma di Collaborazione La collaborazione fra le due Istituzioni Scientifiche Universitarie è stata formalizzata mediante un Accordo di Collaborazione firmato dalle due parti. 4. Piano del Tirocinio/Stage Obiettivi Formativi La partecipazione al programma di Tirocini/Stage darà al soggetto beneficiario la possibilità di approfondire la propria formazione scientifico-metodologica: acquisendo competenze utili per l allestimento di sistemi di colture primarie, per la produzione di virus infettante e per l impiego di quest ultimo nell infezione delle colture suddette. acquisendo competenze necessarie per individuare eventuali modifiche nell espressione dei geni cellulari, con particolare riguardo per quelli codificanti fattori di crescita, citochine e loro recettori. acquisendo esperienza sull isolamento, arricchimento e caratterizzazione funzionale delle cellule coinvolte nella risposta immune cellulo-mediata. 6

7 Obiettivi Professionali Acquisizione di competenze nel campo della biologia cellulare e molecolare da spendere in ambiente accademico o nell industria biotecnologia, in particolare nello studio di malattie virali ad alta incidenza. Raggiungimento di una certa autonomia nell analisi ed interpretazione dei risultati scientifici, nel proporre, scrivere e condurre progetti di ricerca. Con le competenze acquisite il tirocinante potrà arricchire il proprio curriculum professionale in modo da proporsi sul mercato partendo da una posizione sicuramente vantaggiosa rispetto a quella attuale. Piano Analitico delle Attività Formative e Professionali Periodo compreso fra il 1 e 6 mese di Stage Isolamento di colture primarie umane di cheratinociti ricavati da prepuzio, di cellule dendritiche da sangue periferico e di cellule endoteliali microvascolari dermiche isolate da capillari; Produzione di HHV-8 infettante ottenuto da linee cellulari disponibili nel Laboratorio del Prof. Angeloni, in grado di rilasciare virus nel sovranatante; Infezione de novo delle colture suddette. Periodo compreso fra il 7 e 12 mese di Stage Analisi mediante tecniche di Western Blot, Immunoistochimica e Northern Blot delle eventuali modifiche nell espressione di fattori di crescita, citochine e loro recettori conseguenti all infezione; Analisi dell espressione delle stesse proteine mediante tecniche di Immunoistochimica in campioni ottenuti da pazienti affetti da SK paragonando tali dati con quelli ottenuti da cute sana; Analisi dell espressione di specifiche proteine virali nelle cellule infettate in vitro. Tale studio sarà condotto mediante tecniche di Immunofluorescenza e Western Blot; Periodo compreso fra il 13 e 18 mese di Stage Isolamento di monociti/macrofagi da sangue periferico e studio delle loro capacità di differenziamento in cellule dendritiche. A tale scopo ci si avvarrà di tecniche di separazione mediante FACS e analisi dell espressione proteica tramite Immunofluorescenza e Western Blot; Periodo compreso fra il 19 e 24 mese di Stage Analisi delle capacità funzionali delle cellule dendritiche ottenute da individui affetti da SK, sani HHV- 8 positivi o negativi nel presentare l antigene ai linfociti T e nell evocare la risposta T mediata nei confronti di HHV-8. In questo ambito saranno utilizzate tecniche per la valutazione della proliferazione cellulare mediante test di incorporazione della Timidina. 7

8 Requisiti Professionali Richiesti Il candidato ideale deve essere in possesso dei seguenti titoli e requisiti professionali: Punteggio Laurea in Scienze Biologiche, con votazione non inferiore a 110/110 e lode Votazione pari a 110/110 e lode: punti 5 Votazione inferiore 110/110 e lode: punti 0 Dottorato di ricerca in Dermatologia Oncologica Titolo acquisito: punti 25 Titolo non acquisito: punti 0 Esperienza di laboratorio in ambito dermatologico per un periodo minimo di tre anni (certificata da parte del responsabile dell Istituto/del laboratorio) 3 anni o piu : punti 10 Meno di 3 anni: punti 0 Costi del Tirocinio/Stage 1000 Euro mensili per un periodo di 24 mesi (600 Euro mensili in caso di beneficiari con reddito annuo superiore a 7747,00 Euro) per un totale di Euro più Euro di spese viaggio. Partecipazione Finanziaria degli Organismi Proponenti Il Dipartimento ospitante fornirà supporto logistico mettendo a disposizione strumentazione da laboratorio, compatibilmente con le proprie attività di ricerca e fornirà inoltre i materiali di consumo necessari per la realizzazione del programma di ricerca. I costi previsti per il materiale di consumo che sarà utilizzato in questo progetto sono valutabili in Euro. Piano di Valorizzazione Professionale del Tirocinante/Stagista L Istituto di Clinica Dermatologica dell Università di Sassari si impegna ad attivare contratti di collaborazione a progetto da stipulare con il ricercatore beneficiario per i 12 mesi successivi alla conclusione dal tirocinio/stage, in modo da valorizzare le competenze acquisite. I contratti di collaborazione verteranno su progetti di ricerca volti a studiare patologie virali ad alta incidenza, sia a livello umano che animale, con quindi importanti risvolti positivi sul piano socio-economico. L esperienza acquisita nel periodo trascorso presso il Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologica dell Università degli Studi di Roma "La Sapienza sarà fondamentale per la futura carriera professionale del tirocinante. Allo scopo di offrire opportunità d inserimento nel mondo del lavoro alcune delle attività programmate saranno svolte anche in collaborazione con imprese sarde del settore biotecnologico (Nurex e Proteomics). 8

9 Data di Presentazione delle Candidature per il Tirocinio/Stage Le candidature per la partecipazione al tirocinio dovranno essere presentate entro 15 Luglio 2006 Data di Inizio del Tirocinio/Stage 01 Agosto 2006 Data di Conclusione del Tirocinio Stage 31 Luglio 2008 Durata del Tirocinio/Stage (mesi) 24 mesi Data, (Firma Legale Rappresentante del Soggetto Proponente) Si autorizza la Regione Autonoma della Sardegna, anche attraverso i Soggetti Attuatori del Programma Master and Back a: - pubblicizzare sul sito internet del Programma Master and Back e su altra documentazione specifica la presente scheda relativa al Programma di Tirocinio/Stage per il quale si richiede l erogazione del voucher; - fornire i propri riferimenti di posta elettronica ai Soggetti interessati a partecipare al Programma di Tirocini/Stage presentato nella presente scheda. Data, (Firma Legale Rappresentante del Soggetto Proponente) 9

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