Agobiopsia ecoguidata linfonodale con studio citofluorimetrico nelle malattie linfoproliferative

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1 Agobiopsia ecoguidata linfonodale con studio citofluorimetrico nelle malattie linfoproliferative V. Iovino, S. De Lorenzo, G. D Adamo, M.R. Tagliamonte, B. Fimiani, A.M. D Arco U.O. Medicina Interna ed Ematoncologia - Ospedali Riuniti delle Tre Valli - Nocera Inferiore - ASL Salerno 1 Comunicazione orale premiata al XVI Congresso Nazionale SIUMB 2004 Parole chiave: Malattie linfoproliferative; Tipizzazione citofluorimetrica; Biopsia ecoguidata Scopo. Valutare il ruolo diagnostico della tipizzazione citofluorimetrica (CFM) su Fine Needle Aspiration Citology (FNAC) eco-guidati di linfonodi in pazienti con sospetto linfoma. Materiali e metodi. Abbiamo raccolto retrospettivamente i dati di 63 pazienti consecutivi studiati per sospetto linfoma; su tutti i pazienti è stato praticato FNAC ecoguidato per CFM su linfonodo ecograficamente patologico; la conferma diagnostica è stata ottenuta con esame istologico del linfonodo e/o esame morfologico del midollo osseo. Risultati. In 7 casi il prelievo per CFM è stato non diagnostico. In 49 pazienti vi è stata concordanza fra diagnosi morfologica e tipizzazione con CFM, con 20 veri negativi (espansione policlonale reattiva o metastasi), mentre 29 sono stati i veri positivi di cui 27 sono stati linfomi non Hodgkin (LNH) a fenotipo B e 2 a cellule T. Le diagnosi non concordanti sono state 7 delle quali 5 hanno riguardato linfomi di Hodgkin (LH), 2 LNH a cellule T. La sensibilità della CFM per la diagnosi di linfomi è stata del 74% e la specificità del, raggiungendo il di sensibilità estrapolando solo i LNH di derivazione B linfocitaria. Conclusioni. I nostri dati confermano che la valutazione citofluorimetrica dell immunofenotipo delle cellule prelevate con FNAC linfonodale ha una buona concordanza con l esame morfologico e immunoistochimico su campione bioptico. La metodica in particolare ha dimostrato un alta sensibilità e specificità () per la diagnosi dei LNH a fenotipo B. Tale metodica, rispetto all esame morfologico, mostra indubbi vantaggi di facilità di esecuzione, economicità e rapidità. Ultrasound-guided fine-needle cytology and flow cytometry in lymphoproliferative disorders Key words: Lymphoproliferative disorders; Flow cytometry; Ultrasound-guided biopsy Purpose. To evaluate the diagnostic role of flow cytometry on ultrasound-guided fine-needle aspiration cytology (FNAC) of lymph nodes in the work-up of lymphoproliferative disorders. Materials and methods. We retrospectively analyzed 63 consecutive cases of suspected lymphoma. Lymph nodes with pathological features on ultrasound were subjected to ultrasound-guided FNAC with flow cytometry. All diagnoses were confirmed by histological examination of lymph nodes and/or bone marrow. Results. In 7/63 cases, flow cytometry results were non-diagnostic. In 49 cases, the cytometric and histological diagnoses were concordant (20 true negatives, 29 true positives, including 27 diagnoses of Non-Hodgkin lymphoma (LNH) phenotype B and 2 that were phenotype T. Discordant diagnoses emerged in 7 cases (five patients with Hodgkin lymphoma (LH) and 2 with T LNH. The sensitivity of FNAC with flow cytometry was 74% and specificity was among all the lymphoma cases; sensitivity was for B LNH. Conclusions. Our data confirm that flow cytometry evaluation of lymphocytes obtained by lymphnode FNAC is highly concordant with biopsy diagnoses. This approach is highly sensitive and specific for B LNH phenotyping. Although histology remains the gold standard for diagnosing lymphoproliferative disorders, flow cytometry evaluation of lymph-node FNAC is a simple and economic alternative that could be useful for routine use. Introduzione Il problema della valutazione diagnostica di pazienti con linfoadenopatia è molto comune nella pratica clinica. Anche se soltanto l 1% di tutti pazienti che richiedono una prima valutazione clinica per linfoadenopatia ha una malattia neoplastica [1], la precoce caratterizzazione di una linfoadenopatia di natura potenzialmente maligna è di fondamentale importanza nella gestione diagnostica e terapeutica dei pazienti. Infatti la precisa e veloce identificazione di una malattia neoplastica linfonodale con esami di primo livello può essere determinante nell indirizzare l algoritmo decisionale del clinico, con un netto risparmio in termini di tempo e risorse. Anche il followup dei pazienti con linfoadenopatia neoplastica già diagnosticata e sottoposta a trattamento presenta notevoli difficoltà nella ristadiazione della malattia. Il ruolo dell ecografia ad alta risoluzione per lo studio dei linfonodi è ormai validato Giornale Italiano di Ecografia 2005; 8(4):

2 FNAC ecoguidato linfonodale con citofluorimetria nei linfomi dalla letteratura internazionale. Sono stati, infatti, ben definiti i criteri morfologici (dimensioni, forma, ecogenicità dell ilo, caratteristiche della corticale) per la diagnosi differenziale delle linfoadenopatie [2-4], ed anche l introduzione dello studio ecografico della vascolarizzazione linfonodale con il Color e il Power Doppler ad alta sensibilità ha aggiunto ulteriori informazioni alla ecografia di base in scala di grigi [5-8]. Le potenzialità della diagnostica ecografica, inoltre, sono state più di recente esaltate con lo studio perfusionale con imaging armonico dopo iniezione di mezzi di contrasto, che forniscono un dettaglio molto superiore a quello consentito con le tecniche Doppler [9]. Tuttavia, nonostante siano numerose le evidenze della validità delle tecniche ultrasonografiche per lo studio delle linfoadenopatie, la diagnostica per immagini delle linfoadenopatie in campo oncologico necessita di ulteriori studi per aumentarne l accuratezza [10] e, ad oggi, l esame istologico con studio immunoistochimico sul linfonodo escisso chirurgicamente è ancora l imprescindibile gold standard della diagnostica dei disordini linfoproliferativi. Nel vasto campo della diagnostica delle linfoadenopatie, d altro canto, lo studio di campioni citologici ottenuti con aspirazione con ago sottile (FNAC) è stato oggetto di dibattito scientifico. Il FNAC infatti è una metodica veloce e poco invasiva che offre degli indubbi vantaggi nella diagnosi di metastasi linfonodali di tumori solidi, mentre il suo ruolo nell identificazione di malattie linfoproliferative resta ancora controverso. Il FNAC, infatti, raggiunge un grado di attendibilità dell 80-90% nell identificazione dei linfomi non Hodgkin (LNH) e del 76-80% nella classificazione dei suoi sottotipi; la diagnostica citologica dei linfomi di Hodgkin (LH) dipende dalla identificazione delle cellule di Reed Sternberg e raggiunge circa l 85% [11,12]. Le problematiche nella diagnostica citologica dei disordini linfoproliferativi riguardano soprattutto la corretta identificazione di un gruppo di tumori a piccole cellule rotonde, delle leucemie acute non linfoidi e dei LH. Molte riserve inoltre sono state espresse per ciò che riguarda l efficacia della citologia nel differenziare l iperplasia reattiva florida dai linfomi maligni di basso grado; gli stessi LNH follicolari e la variante a sclerosi nodulare dei LH non sono diagnosticabili con la sola citologia in quanto la loro identificazione si basa su criteri classificativi strettamente istologici [11,12]. Nell ultimo decennio un altra metodica si è affiancata alla citologia morfologica per lo studio dei campioni ottenuti con FNAC, cioè la citofluorimetria a flusso (CFM), che è in grado di effettuare uno studio del pattern immunofenotipico cellulare, soprattutto linfocitario, evidenziando con analisi qualitative e quantitative la presenza di eventuali popolazioni clonali. Tale applicazione ha notevolmente migliorato l accuratezza diagnostica della citopatologia nei confronti dei disordini linfoproliferativi [13-22], raggiungendo per alcuni autori il di concordanza con la classificazione istologica in caso di LNH con cellule a fenotipo B [23]; anche in tale settore però le esperienze non sono del tutto univoche, in quanto per altri autori la metodica citofluorimetrica può conservare un alta percentuale di falsi negativi in caso di linfomi B a grandi cellule [24]. Lo scopo del nostro lavoro è di riportare la nostra esperienza nell uso della tipizzazione citofluorimetrica su FNAC eco-guidati di linfonodi in pazienti studiati per un primo inquadramento diagnostico in caso di sospetta malattia linfoproliferativa. Materiali e metodi Disegno dello studio e caratteristiche della popolazione. Lo studio è stato di tipo retrospettivo. Sono stati considerati retrospettivamente 63 pazienti, giunti consecutivamente ad una valutazione clinica presso l U.O. di Medicina Interna ed Emato-Oncologia del Presidio Ospedaliero di Nocera Inferiore - ASL Salerno 1 per linfoadenomegalia di recente insorgenza clinicamente palpabile associata o meno a sintomi sistemici (febbre, perdita di peso, anemia) nel periodo compreso dal Gennaio 2003 al Dicembre Tutti i pazienti non erano mai stati osservati né presso la nostra unità operativa né presso altri centri per lo specifico problema clinico legato alla linfoadenopatia. Tutti i pazienti erano stati ricoverati per la valutazione diagnostica o in regime di ricovero ordinario (10 pazienti) o in regime di DH (53 pazienti). Dopo essere stati edotti circa il tipo di esame da dover praticare, i potenziali rischi ad esso connessi ed aver espresso verbalmente e per iscritto formale consenso all esecuzione della metodica, tutti i pazienti erano stati sottoposti ad esame ecografico delle stazioni linfonodali superficiali ed il FNAC era stato effettuato contestualmente all esame ecografico sulla base del riscontro di caratteristiche ultrasonografiche patologiche dei linfonodi esaminati (aumento di volume, ipoecogenicità, forma tondeggiante, perdita di ecogenicità dell ilo) e in considerazione dell indicazione clinica. Tutti i pazienti avevano poi completato il loro iter per la conferma diagnostica con l esame istologico ed immunoistochimico del linfonodo escisso e/o agoaspirato midollare con biopsia ossea. La conferma diagnostica era stata altresì ottenuta con microbiopsia linfonodale con ago tranciante effettuata sul linfonodo in 5 casi, quando la CFM suggeriva un interessamento linfonodale metastatico da parte di neoplasia solida o in caso di evidenza clinico- strumentale di sospetta lesione neoplastica in altro organo. Esame ecografico e FNAC. L esame ecografico e il FNAC erano stati effettuati solo da due operatori, medici internisti con specifica esperienza in ultrasonografia diagnostica in campo emato-oncologico, utilizzando un ecografo della GE Medical Systems (Logiq 500 MD) equipaggiato con sonda lineare ad alta frequenza (10 MHz) per tessuti superficiali. I linfonodi studiati erano stati caratterizzati in relazione al loro sito anatomico, alle loro dimensioni, alla loro forma, e alle caratteristiche di ecogenicità del parenchima e dell ilo, nonchè in base al numero di stazioni linfonodali superficiali interessate. I prelievi erano stati effettuati con guida ecografica mediante tecnica a mano libera. In asepsi con ago spinale da 23 Gauche si effettuava aspirazione gentile con siringa da 10 ml. Per ogni prelievo sono stati effettuati in media 10 passaggi con movimento di va e vieni in aspirazione nel parenchima linfonodale. L aspirato veniva quindi sospeso in circa 5 ml di soluzione fisiologica NaCl allo 0.9%. In 4 casi il prelievo era stato ripetuto in quanto ritenuto troppo contaminato da sangue. 302 Giornale Italiano di Ecografia 2005; 8(4):

3 V. Iovino et al 1a 1b Fig. 1. Rilievi ecografici di linfonodi studiati: a) linfonodo normale; b) linfonodo patologico. Figure 1. Sonographic features of the lymph nodes examined: a) normal lymph node; b) pathological lymph node. Analisi citofluorimetrica. I campioni ottenuti con FNAC sono stati processati entro due ore dal prelievo. I campioni sospesi in soluzione fisiologica NaCl allo 0.9% sono stati centrifugati a 1500 rpm, a 4 C per 5 minuti. Dopo rimozione del sovranatante i campioni sono stati risospesi in 1 ml di soluzione salina tamponata FACS Flow (Becton Dickinson (BD), San Jose, CA). E stata impiegata una tecnica di immunofluorescenza diretta con duplice o triplice marcatura, mediante l uso di anticorpi monoclonali (MoAbs) direttamente coniugati con i fluorocromi fluoresceina isotiocianato (FITC), phicoeritrina (PE), peridinclorofillproteina (PerCP) della BD. Ogni campione diluito in 1 ml di FACS Flow è stato suddiviso in aliquote di 50 microlitri (µl); a ciascuna aliquota sono stati aggiunti 5 µl per ogni soluzione di MoAb impiegato, quindi i campioni sono stati incubati al buio a 4 C, per 30 minuti. Al fine di ottenere la lisi degli eritrociti, i campioni sono stati risospesi in 1 ml di soluzione lisante a base di cloruro di ammonio (BD) ed incubati per 5-10 minuti, al buio a temperatura ambiente. Dopo centrifugazione a 1500 rpm, per 5 minuti a 4 C i campioni sono stati risospesi in 1 ml di FACS Flow e ricentrifugati a 1500 rpm per 5 minuti a 4 C. I pellets di cellule così ottenuti sono stati risospesi in 1 ml di FACS Flow e per ciascun campione sono stati acquisiti eventi mediante un citofluorometro di tipo FACS Calibur (BD, San Jose, CA). I dati ottenuti sono stati memorizzati in file in modalità listmode e successivamente analizzati mediante software CELLQuest (BD, San Jose, CA). Sono stati studiati 5 parametri: forward scatter (FSC) e side scatter (SSC) in scala lineare insieme a tre fluorescenze in scala logaritmica (FL1, FL2, FL3). L analisi è stata effettuata dopo aver fissato dei gates logici per l identificazione dei linfociti, in base ai parametri fisici (FSC/SSC) e fisici e di fluorescenza (SSC/CD45). Ulteriori strategie di gating sono state impiegate qualora necessario per lo studio di sottopopolazioni linfoidi, in base alla dimensione cellulare e all espressione antigenica. Il panel anticorpale utilizzato è stato il seguente: CD20-FITC/CD3-PE/CD45- PerCP, CD5-FITC/CD19-PE/CD45-PerCP, CD1- FITC/HLADR-PE/CD19-PerCP, CD22-FITC/CD23 PE, FMC 7 FITC/CD11C-PE, CD20-FITC/CD38-PE, CD103-FITC/CD25 PE [25]. Sono stati utilizzati controlli isotipici (BD). Panel aggiuntivi sono stati effettuati in caso di sospetto di malattia linfoproliferativa T e NK (Natural Killer) mediante l uso di ulteriori MoAb: CD2, CD4, CD7, CD8, TCRαβ/TCRγδ, TdT, CD16, CD56 nonché eventuali ulteriori marcatori per lo studio dei casi dubbi. Nell analisi dei dati l espressione anticorpale è stata considerata positiva se presente in almeno il 20% delle cellule incluse nel gate. La clonalità per le malattie linfoproliferative B è stata valutata mediante lo studio dell espressione delle catene leggere delle immunoglobuline di superficie (smig) di tipo kappa (κ) e lambda (λ), con triplice marcatura, usando i seguenti MoAbs: smigκ- FITC/smIgλ-PE/CD19-PerCP (BD). L analisi è stata effettuata dopo gate logico per l identificazione dei linfociti B, usando i parametri di SSC/CD19. La popolazione linfoide B è stata considerata monoclonale in presenza di: 1) un rapporto κ:λ > 3:1 o di un rapporto λ:κ > 2:1; 2) mancata espressione di catene κ o λ nella popolazione di cellule B con fenotipo maturo (CD45 bright+, CD20 bright+, CD34-). Per le malattie linfoproliferative T si è ricercata la presenza di surrogati di clonalità in base alla presenza di anomalie di espressione dei marcatori T. Inoltre, in presenza di una popolazione sospetta e apparentemente significativa, evidenziata con un primo screening dall analisi dei parametri fisici (FSC/SSC) e negativa per l antigene panleucocitario CD45 nonché per i marcatori linfoidi, è stata valutata con specifici MoAbs l espressione di ulteriori antigeni da parte di tale popolazione, in particolare di antigeni piastrinici ed eritroidi. La negatività degli stessi ha fatto porre il sospetto di metastasi linfonodale da malattia extraematologica. Analisi statistica. Abbiamo valutato la sensibilità e la specificità della diagnosi ottenuta con indagine CFM su FNAC confrontandola in ciascun paziente con quella ottenuta con caratterizzazione bioptica ed immunofenotipica del campione ottenuto da escissione linfonodale e/o biopsia ossea. Giornale Italiano di Ecografia 2005; 8(4):

4 FNAC ecoguidato linfonodale con citofluorimetria nei linfomi 2a 2b Fig. 2. Differenti grafici delle analisi di citometria a flusso: a) pattern citofluorimetrico policlonale in linfonodo reattivo; b) pattern citofluorimetrico clonale in linfoma a cellule B. Figure 2. Different flow cytometry patterns encountered in the study: a) polyclonal pattern in a reactive lymph node; b) clonal pattern in B-cell lymphoma. Risultati Il nostro campione è risultato composto da 34 maschi e 29 femmine di età compresa tra 13 e 84 anni con una media di 53 ±18 anni. L esame ecografico di base aveva valutato le caratteristiche ecografiche di patogenicità in base alle quali veniva effettuato il FNAB (Fig. 1a,b). Le caratteristiche ecografiche dei linfonodi studiati sono mostrate nella Tab. I. Come si può notare, nella maggior parte dei casi (35 su 63) due o più stazioni linfonodali erano interessate da linfoadenomegalia ed il 74% dei pazienti presentava almeno un linfonodo di diametro massimo superiore a 1.5 cm. In più dell 80% dei casi il linfonodo si mostrava ipoecogeno, con ilo non visibile e tendenzialmente rotondeggiante. La sede del prelievo era stata in più della metà dei casi (39 su 63) laterocervicale e solo in una minoranza il prelievo era stato eseguito in sede ascellare o inguinale. La Tab. II mostra il confronto tra le diagnosi ottenute con CFM su FNAC e quelle ottenute mediante istologia con tipizzazione immunofenotipica. In 7 casi il prelievo per CFM è stato non diagnostico per scarsità di cellule. Tali casi risultavano essere all analisi istologica così ripartiti: 3 LH, 1 metastasi da tumore solido e 3 linfoadenopatie reattive. In 49 casi vi è stata corrispondenza fra diagnosi morfologica e tipizzazione con CFM. In particolare 20 sono stati i veri negativi (espansione policlonale reattiva o metastasi da tumori solidi - Fig. 2a) mentre 29 sono stati i veri positivi di cui 27 sono stati LNH (Fig. 2b) a fenotipo B e 2 a cellule T. Le diagnosi non concordanti sono state 7 delle quali 5 hanno riguardato LH e 2 LNH a cellule T. In tutti questi casi la CFM aveva diagnosticato espansione policlonale reattiva. La sensibilità e la specificità della CFM effettuata su campioni ottenuti con FNAB di linfonodi macroscopicamente patologici all ecografia è riportata in Tab. III. Come si nota tale metodica per tutte le patologie linfomatose prese in esame ha dimostrato una sensibilità del 74% ed una specificità del. Tuttavia nell analisi dei vari tipi di patologia fenotipizzata si nota che il migliore risultato si era ottenuto con i LNH tipo B per i quali, nella nostra casistica, si raggiungeva sensibilità e specificità pari al, Tab. I. Caratteristiche ecografiche dei linfonodi studiati. Table I. Sonographic characteristics of the lymph nodes examined. CARATTERISTICA Stazioni linfonodali interessate (n) N di casi o più 10 Grandezza (cm) > Ecogenicità Ipoecogeni* 57 Iperecogeni* 6 Caratteristiche ilo Visibile 11 Non visibile 52 Rapporto diametro longitudinale/trasversale > Sede FNAC Laterocervicale 39 Ascellare 10 Inguinale 14 * Rispetto all aspetto abituale del linfonodo normale. FNAC: Fine Needle Aspiration Citology 304 Giornale Italiano di Ecografia 2005; 8(4):

5 V. Iovino et al Tab. II. Diagnosi citofluorimetrica ed istologica dei linfonodi esaminati. Table II. Flow cytometry and hystology of the lymph nodes studied. DIAGNOSI CITOFLUORIMETRICA DIAGNOSI ISTOLOGICA N casi N casi LNH B LNH T LH Metastasi Linfoadenite reattiva Prelievo incongruo Totale LNH B LNH T LH Metastasi Linfoadenite reattiva Totale 63 LNH: Linfomi non Hodgkin; LH: Linfomi di Hodgkin. mentre per i LH la sensibilità era pari allo 0%. Infine va detto che due delle diagnosi risultate alla fine concordanti non hanno dimostrato corrispondenza alla prima valutazione; in esse, tuttavia, si è dimostrata una maggiore sensibilità della CFM in quanto in un caso la revisione istologica postuma del campione studiato ha mostrato concordanza con l esame citofluorimetrico; nell altro caso ad una citologia su linfonodo negativa ha corrisposto una positività all esame del midollo in accordo con la CFM (Tab. II). Discussione L interpretazione dell immagine ultrasonografica di una linfoadenopatia è un problema di comune riscontro negli ambulatori di ecografia ed è sempre opportuno che l operatore offra una refertazione completata con un preciso indirizzo diagnostico. Tale esigenza si avverte soprattutto in ambulatori di ecografia dedicati alla diagnostica emato-oncologica, in cui la maggior parte delle richieste dei clinici riguarda proprio la definizione morfologica e quindi prognostica delle linfoadenomegalie [27]. Fatto salvo il concetto che la caratterizzazione istologica ed immunoistochimica è necessaria per la diagnosi e una corretta pianificazione terapeutica, l ultrasonografia ha un ruolo, oltre che di indirizzo diagnostico, anche complementare all indagine istologica, aumentandone l accuratezza. Molto spesso, infatti, si chiede all indagine ultrasonografica l identificazione dei linfonodi più significativi per il campionamento bioptico, che sia istologico o citologico; ciò è ancora più importante nel caso i linfonodi non siano clinicamente palpabili, siano in sedi profonde, che coesistano nello stesso paziente linfoadenomegalie con caratteristiche morfologiche di reattività o di malignità con linfoadenopatie satelliti o che in uno stesso linfonodo siano identificabili gettoni di tessuto neoplastico che ne alterino solo parzialmente la struttura. Di recente le tecniche flussimetriche e l utilizzo dei mezzi di contrasto hanno aumentato l accuratezza diagnostica dell ecografia nella valutazione delle linfoadenopatie, correlando l indice di resistenza dei vasi linfonodali con il grading del linfoma [8-10,26]. Tuttavia la variabilità operatore dipendente, limite tipico dell esame ultrasonografico, in assenza di programmi di training specialistici per gli operatori dediti a tali tipi di indagini, costituisce ancora oggi un ostacolo alla piena utilizzazione di tali potenzialità diagnostiche. La caratterizzazione immunofenotipica dei disordini linfoproliferativi è alla base della pianificazione diagnostica, prognostica e terapeutica dei linfomi, soprattutto dopo l ultima classificazione REAL dei linfomi [27]. Lo studio immunofenotipico è ormai universalmente accettato come indispensabile supporto alla convenzionale diagnostica morfologica ed è stato sufficientemente standardizzato. Gli approcci metodologici all analisi immunofenotipica sono sostanzialmente lo studio dei marcatori di superficie e/o intracitoplasmatici mediante citometria a flusso o microscopia a fluorescenza su sospensioni cellulari e lo studio immunoistochimico di sezioni di tessuto fissato e criopreservato o di sospensioni cellulari. L analisi delle sospensioni cellulari in citometria a flusso ha numerosi vantaggi: è un sistema rapido, versatile, riproducibile, altamente sensibile il quale permette di stabilire la presenza o meno di un determinato antigene di membrana o intracitoplasmatico su un elevato e statisticamente significativo numero di cellule, permette inoltre di rilevare l eventuale clonalità della popolazione campionata. Inoltre, l esame citofluorimetrico consente di valutare l espressione contemporanea di più antigeni Tab. III. Sensibilità e specificità della metodica citofluorimetrica su FNAC nelle varie patologie riscontrate. Table III. Sensibility and specificity of flow cytometry on FNAC in different lymphoproliferative disorders. LNH B LNH T LH Metastasi Linfoadenite reattiva Tutti i linfomi Sensibilità 50% 0% 83% 83% 74% LNH: Linfomi non Hodgkin; LH: Linfomi di Hodgkin. Specificità 84% Giornale Italiano di Ecografia 2005; 8(4):

6 FNAC ecoguidato linfonodale con citofluorimetria nei linfomi sulle stesse cellule e di definire algoritmi diagnostici per le malattie linfoproliferative, in base ai diversi pattern di coespressione antigenica. Partendo da tali premesse, il FNAC, soprattutto quando associato allo studio citofluorimetrico, ha guadagnato buona credibilità nell inquadramento iniziale dei disordini linfoproliferativi. Sebbene, infatti, la biopsia linfonodale con esame istologico ed immunoistochimico resta il gold standard per la diagnostica delle malattie linfoproliferative, soprattutto in prima diagnosi, con l avvento dell esame citofluorimetrico le due metodiche sono divenute complementari e laddove l esame cito/istologico mostra dei limiti (ad esempio nella differenziazione tra iperplasia reattiva benigna e linfoma di basso grado) la citofluorimetria acquisisce potere diagnostico così come nei casi in cui la citofluorimetria può essere limitata (ad esempio nei LH, nei LNH ad alto grado o smig-) l esame citoistologico è di ausilio diagnostico. La metodica citofluorimetrica presenta tuttavia dei limiti. In particolare essa può risentire della selezione cellulare operata in fase di prelievo del campione o di preparazione della sospensione; inoltre è preferibile che la metodica sia effettuata entro poche ore dal prelievo, al fine di limitare il danneggiamento del campione poiché, nonostante la conservazione a 4 C, il numero di detriti e la perdita cellulare aumentano con l aumentare del tempo di processamento del campione e le metodiche di fissazione (es. con paraformaldeide), che consentono un analisi entro 48 ore, possono determinare una possibile riduzione dell accuratezza della stessa. E necessario pertanto avere la disponibilità di un laboratorio di citometria collocato logisticamente in modo tale da poter interagire in tempo breve con il servizio di ecografia, per l analisi tempestiva dei campioni Va inoltre sottolineato che la riproducibilità della metodica citofluorimetrica può essere influenzata dall incongruità del campione. In letteratura sono riportati dal 4% al 30% di casi con incongruità del campione. La riproducibilità può, inoltre, anche essere influenzata dall esperienza acquisita dal citofluorimetrista in campo ematologico. Il training formativo ematologico è fondamentale per ridurre la variabilità interpretativa dei dati. Al fine nel corso degli anni sono stati fatti diversi tentativi di standardizzazione della metodica citofluorimetrica. Nella nostra esperienza abbiamo riscontrato una bassa percentuale di incongruità, pari all 11% dei campioni. Tale risultato è sicuramente legato alla buona tecnica esecutiva del campionamento ed alla immediata processazione dei campioni stessi. I risultati da noi ottenuti dimostrano un alta specificità della metodica con una sensibilità nel complesso soddisfacente, anche se non uniformemente distribuita nell analisi delle varie patologie linfoproliferative. Tali risultati sono facilmente interpretabili tenuto conto della difficoltà di diagnosi citofluorimetrica nel caso di talune malattie linfoproliferative ove non esistono marcatori specifici di clonalità (es. Linfomi di Hodgkin), in talune malattie linfoproliferative T ove non è sempre agevole identificare anomalie immunofenotipiche che possano rappresentare surrogati di clonalità, nonché in alcuni sottotipi di LNH B (es. smig-). In letteratura, infatti, si ritrovano articoli recenti che hanno riportato risultati contraddittori sull accuratezza della metodica citofluorimetrica su campioni di FNAC, registrando falsi negativi nella diagnosi di linfomi, anche in alcuni sottotipi ad immunofenotipo B [24,28] così come d altra parte, sono stati pubblicati numerosi altri articoli che hanno enfatizzato la precisione diagnostica della citofluorimetria nei disordini linfoproliferativi, stressando anche la capacità della metodica di formulare una sottoclassificazione dei linfomi in base alla dimensione delle cellule e a patterns immunofenotipici specifici [29,30]. La nostra esperienza dimostra un alta affidabilità della metodica citofluorimetrica nell identificazione delle malattie linfoproliferative ad immunofenotipo B (sensibilità del ). La metodica appare meno accurata nella diagnostica dei linfomi ad immunofenotipo T, in accordo con la maggior parte dei dati presenti in letteratura ed è di scarso ausilio nella diagnostica dei LH, potendo in tal caso solo escludere altre forme di malattia linfoproliferativa [31,32]. Molto interessante, inoltre, è risultata la possibilità di suggerire al clinico e al patologo il sospetto di malattia linfonodale da metastasi di pertinenza extraematologica, al fine di valutare l opportunità di effettuare ulteriori approfondimenti diagnostici. L esigenza di un corretto inquadramento diagnostico iniziale di una linfoadenopatia è dettata da molteplici esigenze. Naturalmente sono prioritarie quelle relative al singolo paziente studiato, per il quale è importante ottenere al più presto dati precisi sul suo problema clinico sia per motivi di pianificazione terapeutica, sia per giustificati motivi emozionali. Vi sono infatti forme di linfoma clinicamente aggressivo, spesso in pazienti anziani, che hanno una prognosi infausta a breve termine e nei quali anche una escissione chirurgica linfonodale può risultare un intervento gravato da morbidità poco accettabile. A questo si aggiunga che spesso l organizzazione ospedaliera non consente la disponibilità immediata del chirurgo e in alcuni casi del patologo. Tali ostacoli logistico-organizzativi incidono sui tempi di refertazione creando, talvolta, non poche difficoltà decisionali sul piano gestionale. Le stesse difficoltà organizzative si moltiplicano nell affrontare i percorsi diagnostici di tutti i numerosi pazienti afferenti ad un centro ematologico di riferimento nell ambito del proprio territorio. L utilizzo quindi di una tecnica ancillare, quale appunto il FNACecoguidato, che permetta di superare in gran parte tali difficoltà è ben accetta soprattutto se si dimostra avere innegabili vantaggi in termini di rapidità, mini invasività e scarsa morbilità con potenziale riduzione della morbidità postbioptica e dei costi di ospedalizzazione, cosa dimostrata dal fatto che viene effettuata quasi sempre in regime di Day Hospital. Tale tecnica associata allo studio immunofenotipico mediante una metodica rapida e riproducibile quale la citometria a flusso ha mostrato buona affidabilità nella diagnostica delle malattie linfoproliferative (in particolare LNH a fenotipo B e T) in prima diagnosi. Inoltre, in considerazione dei vantaggi citati di entrambe le metodiche appare molto promettente un impiego delle stesse soprattutto in fase di follow-up dei pazienti, al fine di valutare eventuali recidive senza necessità di dover ricorrere a metodiche invasive quali la biopsia chirurgica con esame istologico/immunoistochimico che comporterebbe anche maggiori tempi diagnostici. L esame citofluorimetrico dei FNAC ecoguidati potrebbe essere integrativo di altri esami comunemente 306 Giornale Italiano di Ecografia 2005; 8(4):

7 V. Iovino et al impiegati in fase di follow-up (basti pensare ai falsi negativi della PET). L impiego della metodica, inoltre, potrebbe risultare utile per la diagnostica di linfonodi sospetti a localizzazione profonda raggiungibili sotto guida ecografica, in pazienti non suscettibili di metodiche invasive (laparoscopia, laparotomia) o nei casi in cui si configuri clinicamente un emergenza ematologica, è il caso ad esempio dei linfomi altamente aggressivi, che impone di ottenere una diagnosi quanto più rapida possibile per iniziare un trattamento specifico. In conclusione, i nostri dati confrontati con quelli presenti nella letteratura internazionale dimostrano che l indagine citofluorimetrica su FNAC ecoguidato di linfonodi ecograficamente patologici, pur non sostituendo le metodiche attualmente considerate gold standard, può essere di grande ausilio al clinico nella prima diagnosi di malattie linfoproliferative. L impiego tuttavia di tale metodica su larga scala impone, oltre alla necessaria disponibilità di un laboratorio di citometria a flusso, la possibilità di disporre di operatori con grande esperienza nella valutazione ecografica delle linfoadenopatie in quanto una corretta iniziale caratterizzazione di patogenicità di un linfonodo esaminato ed una buona tecnica esecutiva del prelievo citologico sono alla base dei buoni risultati ottenibili in termini di sensibilità della metodica stessa. Ulteriori studi saranno necessari per valutare la applicabilità di tale tecnica nel follow-up dei pazienti con malattia linfomatosa. Bibliografia References 1) Longo DL, Henry PH. Enlargement of lymph nodes and spleen. In: Fauci AS, Brauwald E, Isselbacher KJ, et al (eds): Harrison s Principles of Internal medicine, 14th ed, New York, McGraw-Hill, 1998: ) Rubaltelli L, Proto E, Salmaso R, Bortoletto P, Candiani F, Cagol P. 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