ID4452/2007 PROGETTO R&S PISTA: Piattaforma Interdisciplinare Staminali e Terapia Antitumorale.

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1 DG Industria, Artigianato, Edilizia e Cooperazione SCHEDE TECNICHE INTERVENTI CONCLUSI ATI STEMGEN - STEMGEN Spa Milano - ISB Ion Source & Biotechnologies Srl Milano - BioRep Srl Milano - ISE Integrated Systems Engineering Srl Brugherio (MI) - CNR-ITB Istituto di Tecnologie Biomediche Segrate (MI) ID4452/2007 PROGETTO R&S PISTA: Piattaforma Interdisciplinare Staminali e Terapia Antitumorale. AREA MD BIOTECNOLOGIE DURATA MESI 36 QUADRO ECONOMICO PREVISIONE INIZIALE ,00 COSTO FINALE ,04 INTERVENTO FINANZIARIO EROGATO ,60 COS È P.I.S.T.A PROGETTO Il progetto P.I.S.T.A. nasce con il fine di utilizzare una combinazione di tecnologie innovative e proprietarie, per l identificazione, lo sviluppo e la messa a punto di nuove metodologie diagnostiche e terapeutiche per la forma più frequente, incurabile e letale di tumore cerebrale umano, il

2 glioblastoma multiforme (o glioma di IV grado, GBM). Il GBM è il tumore cerebrale gliale umano con il più alto grado di malignità. Essendo una tipologia di tumore priva di margine, infiltra e distrugge il tessuto sano circostante rendendo poco efficaci la resezione chirurgica ed i trattamenti chemio- e radioterapici, dando quindi una aspettativa media massima di vita nei pazienti di 14 mesi. Ad oggi, la sotto-popolazione di cellule staminali tumorali identificata nei tessuti di tumore cerebrale di altro grado viene ritenuta la reale responsabile dell inizio del meccanismo di tumori genesi. Iniettate ortotopicamente nel cervello di topi immunodepressi, le cellule staminali tumorali di glioblastoma (GCSCs) sono in grado di produrre fenocopie identiche al tumore originale. La possibilità di isolare linee stabili di queste cellule, unita alle nuove tecnologie in dotazione ad altre unità operative, ha permesso di sviluppare una piattaforma tecnologica assolutamente innovativa, capace di focalizzarsi e studiare nel dettaglio biochimico, funzionale e molecolare la componente cellulare veramente responsabile della formazione dei glioblatomi, la cellula staminale del cancro o cancer stem cell, permettendo screening più selettivi, precisi e sensibili per la ricerca di nuovi bio-marcatori specifici per questa patologia, con gli ovvi risvolti in ambito prognostico, diagnostico e terapeutico. PARTNERS Il progetto nella sua completezza è stato gestito sinergicamente dalle diverse unità operative, ognuna secondo le proprie competenze qui di seguito elencate: Stemgen Spa: ha coordinato la raccolta, il processamento e la distribuzione di materiale biologico proveniente da campioni di tessuti umani sani e di glioblastoma. Tale materiale consisteva in sezioni di tessuto tumorale primario proveniente dalle resezioni chirurgiche dei singoli pazienti e di tessuto secondario sviluppatosi nei topi, nonché da cellule neurali staminali e tumorali isolare da entrambe le tipologie di tessuti. Parallelamente Stemgen ha utilizzato tali cellule staminali tumorali per selezionare e

3 produrre nuovi potenziali anticorpi monoclonali capaci di riconoscere biomarcatori specifici del glioblastoma multiforme umano. Biorep: ha sviluppato e standardizzato un nuovo protocollo di criopreservazione delle cellule staminali tumorali, necessario per la creazione di criobanche, utilizzando agenti protettori non tossici basati sull uso della molecola di trealosio. Integrated Systems Engineering (ISE): grazie alla tecnologia dei tissue microarray (TMA) in house, ISE ha analizzato l espressione di biomarcatori selezionati in sezioni paraffinate di tessuto tumorale di glioblastoma e di tessuto normale. I marcatori selezionati sono stati rilevati attraverso un pannello di anticorpi commerciali utilizzati di routine dalla Stemgen. Questa piattaforma di TMA è stata inoltre utilizzata per validare i nuovi potenziali bio-marcatori selezionati e prodotti da Stemgen Spa. ISB Ion Source & Buiotechnology: attraverso la tecnica liquid chromatography profiling mass spectrometry (LC-Profiling-MS), ha sviluppato una metodica per l identificazione di biomarkers da estratti proteici di cellule staminali tumorali sulla base di uno screening differenziale basato sulla diversa ionizzazione dei composti biologici a basso peso molecolare. L Istituto di Tecnologie Biomediche del Consiglio Nazionale delle Ricerche: l immunofenotipizzazione, mediante Paraffin-Embedded Cell Line Microarrays (CLMA), di cellule derivate dal glioblastoma multiforme e coltivate in vitro è stata utilizzata per valutare e caratterizzare in vitro i medesimi marcatori identificati ed analizzati attraverso la tecnica del TMA. OBIETTIVI La recentissima identificazione di una rara popolazione cellulare nei tessuti di GBM, avente proprietà analoghe alle cellule staminali sane e allo stesso tempo capacità di iniziare e propagare tale tumore cerebrale anche a livello di singola cellula, ha aperto nuove ed impreviste prospettive nello studio dei glioblastomi umani e delle loro possibili terapie. L obiettivo del progetto P.I.S.T.A. è stato quello di identificare e

4 successivamente validare nuovi potenziali marcatori bio-molecolari specifici per le cellule staminali tumorali (GCSCs) isolate da glioblastoma, attraverso la costituzione di una piattaforma tecnologica multidisciplinare, rappresentata dall integrazione delle tecnologie fornite dai singoli partners. I bio-marcatori identificati potrebbero identificare all interno della massa tumorale la componente cellulare realmente responsabile del fenomeno di inizio e propagazione del meccanismo tumorale e e costituire così un valido ed innovativo strumento diagnostico e terapeutico. METODO E FASI DI RICERCA I ricercatori di StemGen S.p.A. hanno isolato e caratterizzato dai tessuti di glioblastoma umano, una popolazione cellulare che si identifica nelle tipiche proprietà delle cellule staminali ma che, allo stesso tempo, conserva anche le caratteristiche peculiari delle cellule tumorali. La possibilità di generare in modelli murini, attraverso iniezione intracerebrale, fenocopie identiche al tumore originario ha reso disponibile, per la prima volta, modelli di glioblastoma umani in grado di permetterne uno studio riproducibile nel tempo, anche su vasta scala.

5 La prima parte del progetto ha riguardato l isolamento e la caratterizzazione di 4 nuove linee di glioblastoma cancer stem cells (GCSCs): , , , Queste linee cellulari di GCSCs hanno costituito il materiale per produrre poi, in animali immunodepressi, anticorpi monoclonali specifici per i bio-marcatori di interesse di seguito isolati. In collaborazione con il consorzio CAPRI di Rijeka (CROAZIA), si è poi sviluppata la fase di selezione di nuovi bio marcatori. Considerato il titolo elevato di anticorpi prodotti nel modello murino, l immunizzazione iniziale è stata effettuata con estratti proteici provenienti da lisati di membrane cellule delle GCSCs iniettate direttamente nei topi (n=3). La quantità di proteine da ottimale per una buona immunizzazione degli animali, è stata di 300 µg (100 µg per animale) pari a 5 x 10 7 cellule, somministrata mediante tre infusioni successive a distanza di un mese. Considerata la bassa resa qualitativa proteica, si è deciso di utilizzare come fonte di antigeni direttamente le stesse cellule staminali tumorali, fissate in paraformaldeide al 1% (PFA 1%), da iniettarsi nell animale in numero di Questa fase di immunizzazione ha richiesto circa 4 mesi di tempo, dopodiché è seguita la misurazione del titolo anticorpale prodotto, mediante prelievo di campioni di sangue e al sacrificio dell animale, rimozione della milza, fonte primaria di produzione e secrezione di anticorpi monoclonali. Per supplire alla ridotta capacità moltiplicativa delle cellule spleniche sono state create linee di hybridoma derivate dalla fusione di queste con cellule di mieloma, tumore linfocitario, così da ottenere una risultante immortalizzata, in grado di duplicare all infinito e con la capacità di secernere nel medium di coltura eventuali anticorpi. Successivamente si è proceduto all identificazione ed espansione dei soli cloni cellulari in grado di produrre anticorpi diretti in modo specifico verso le nostre GCSCs. Questo screening è stato possibile mediante l utilizzo di tests ELISA effettuati sul surnatante prodotto dai singoli cloni di hybridoma in coltura su un substrato di GCSCs fissate (come controllo negativo le stesse GCSCs in condizione differenziata e U87, una linea di astrocitoma

6 umano commerciale). I cloni selezionati sono stati successivamente testati su sezioni di tessuto tumorale secondario, ottenuto, come già menzionato, tramite iniezione di GCSCs nel cervello di topi immunodepressi. I tests per escludere eventuale specificità e cross-reattività, sono stati eseguiti con linee di cellule staminali neurali murine, indifferenziate e differenziate e con sezioni di tessuto derivato da trapianti xenografici, dove la positività alla marcatura rimane confinata all interno del tessuto tumorale umano e non nel circostante tessuto murino. La successiva purificazione degli anticorpi ha permesso di selezionare 4 cloni che evidenziano differenze di marcatura tra GCSCs in attiva fase di proliferazione e GCSCs indotte a differenziare. Le analisi immunocitochimiche confermano il dato precedentemente ottenuto sui surnatanti; la messa a punto della metodica ha permesso inoltre di stabilire una concentrazione ottimale di utilizzo per tutti e quattro gli anticorpi (diluizione 1:500). Stesso pattern di espressione, anche se con differente intensità, è emerso da studi di immunocitochimica con cellule staminali neurali sane. Gli anticorpi stemg03 e stemg04 evidenziano una marcatura nucleare e una down regolazione del segnale durante il differenziamento rispettivamente del 28 e 60 % paragonato alle cellule indifferenziate, mentre in immunoistochimica la positività rilevata è dell 80% per stemg03 e dell 84% per stemg04. Si è inoltre deciso di avviare una collaborazione con ARETA International, società italiana specializzata nella produzione di anticorpi monoclonali per mettere a punto un protocollo di immunizzazione differente che prevedeva l utilizzo di cellule vive come materiale immunogenico. Dopo 4 successivi boost nell arco di 3 mesi sono stati ottenuti 20 cloni anticorpali. La selezione è avvenuta tramite tests ELISA dove il substrato era rappresentato dalle nostre GCSCs utilizzate come controllo positivo e dalle stesse cellule in condizioni differenziate. Da queste analisi, sono stati selezionati 17 cloni, testati poi su fibroblasti umani, per eliminare quelli che non manifestavano una marcatura tessuto-

7 specifica. Questo procedimento ha ridotto il numero iniziale a 5 cloni interessanti e potenzialmente specifici per le GCSCs. Questi 5 cloni sono stati studiati sia sulle GCSCs utilizzate per la precedente immunizzazione sia su cellule staminali neurali immortalizzate, come controllo negativo. Al fine di identificare target anticorpali ed il meccanismo di funzionamento, ci si è rivolti ad un ulteriore tecnica, innovativa nel suo genere, utilizzata da Ion Source & Biotechnology s.r.l. (I.S.B.). Con la LC-profiling-MS, è stato possibile analizzare analiti standard aggiunti ad una matrice complessa, selezionati per coprire un ampio range di polarità e di peso molecolare. Nella prima parte del progetto si è proceduto alla messa a punto del sistema per poi impiegare tale tecnologia con estratti proteici di campioni provenienti dalle 4 diverse linee GCSCs utilizzate per l immunizzazione e da una linea di cellule staminali neurali umane, utilizzata come controllo, fornite dall unità Stemgen. A questo punto, dopo aver validato i risultati mediante ripetizione in triplo delle misure, su linee cellulari diverse, le attività si sono concentrate sull'identificazione dei potenziali bio-marcatori tumorali. Le misure di massa esatta associate alla tecnica di elaborazione dati Top Down approach hanno consentito di identificare 2 proteine espresse maggiormente dalle cellule staminali tumorali. Dei potenziali marcatori selezionati, sono stati successivamente analizzati dalle altre unità operative solo quelli prodotti da Stemgen perché per le due proteine evidenziate nell analisi di spettrometria di massa non sono al momento disponibili anticorpi commerciali. Grazie alla tercnologia dei tissue e cell line microarray (TMA e CLMA) in house, I.S.E. ha analizzato l espressione dei biomarcatori selezionati in sezioni paraffinate di tessuto tumorale di glioblastoma, di tessuto normale e cellule derivate dai rispettivi tessuti; i marcatori selezionati comprendevano anticorpi attualmente utilizzati da Stemgen per caratterizzare il GBM umano e gli anticorpi prodotti da Stemgen mediante le immunizzazioni. La tecnologia TMA utilizzata da Integrated Systems Engineering s.r.l. (I.S.E.) ha richiesto la costruzione di un blocchetto di paraffina (recettore) contenente centinaia di campioni differenti per essere analizzati per via immunoistochimica contemporaneamente; i blocchetti tissutali sono stati quindi forniti da

8 Stemgen e consistevano di tessuti cerebrali e sottocutanei ottenuti dopo trapianto xenografico di 3 diverse linee di cellule staminali tumorali umane. I blocchetti di tessuto sono stati utilizzati come donatori di materiale che, opportunamente carotato con il Galileo CK4500 (www.isenet.it), è stato specificamente posizionato secondo una matrice ordinata in un blocchetto di paraffina ricevente. Sono stati ottenuti due TMAs che, appositamente equilibrati per 10 a 50 C, sono stati sottoposti al taglio al microtomo per poi condurvi analisi immunofenotipiche. Parallelamente I.T.B.-C.N.R ha utilizzato un approccio molto analogo al TMA chiamato paraffin embedded Cell Line MicroArray (CLMA). Questa tecnica ha richiesto l inclusione in agarosio delle linee cellulari, le medesime con cui sono stati generati trapianti xenografici. Il lavoro è stato quindi suddiviso in due fasi: nella prima sono stati identificati i parametri biologici da analizzare per determinare la conta cellulare più opportuna per formare il blocco donatore; è stato quindi necessario ottimizzare la tecnologia in funzione delle cellule fornite. Le sezioni paraffinate ottenute mediante taglio al microtomo dei blocchetti di CLMA sono state sottoposte ad analisi immunofenotipiche con gli stessi anticorpi utilizzati per il TMA. Parallelamente al lavoro descritto dagli altri partners, Biorep si è focalizzata a sviluppare e standardizzare protocolli di criopreservazione delle cellule utilizzando agenti protettori meno tossici. Fino ad ora il metodo di crioconservazione più utilizzato contempla l utilizzo di una sostanza, il dimetilsulfossido (DMSO) come agente criopreservante che però risulta essere molto tossico e, secondo meccanismi non del tutto chiari, induce differenziamento cellulare che in cellule totipotenti come quelle staminali tumorali è fortemente sconsigliato. Gli esperimenti sono stati effettuati con

9 cellule già a disposizione di Biorep. Sono state quindi determinate condizioni di conservazione delle cellule staminali in terreno privo di proteine animali in cui si è ridotto drasticamente la concentrazione di DMSO. Le cellule sono state sottoposte a congelamento lento (diminuzione di 1 C/minuto) in presenza di diversi tipi di terreno di congelamento introducendo nelle cellule il Trealosio, un disaccaride non riducente in grado di ridurre la formazione e la dimensione dei cristalli di ghiaccio preservando l integrità delle membrane plasmatiche durante il processo di congelamento e che contrariamente al DMSO non va ad influenzare fenomeni importanti come la metilazione e l acetilazione del DNA. Lo scongelamento è stato successivamente eseguito immergendo le cryovials contenenti i campioni in bagno termico a 37 C per circa 2 minuti. Il campione così scongelato è stato posto nuovamente in coltura ed è stata verificata la vitalità delle cellule 24 ore dopo lo scongelamento, in quanto in questa fase temporale si ha il picco di mortalità. RISULTATI Il primo batch di anticorpi prodotto dal Consorzio CAPRI ha permesso di ottenere ben 11 cloni selezionati sulla base dei tests ELISA eseguiti utilizzando come controllo negativo la stessa linea cellulare utilizzate per l immunizzazione, in uno stato differenziato.

10 Le prime analisi sono state condotte sui surnatanti contenenti le immunoglobuline corrispondenti agli anticorpi di potenziale interesse. Sono state eseguite analisi immunocitochimiche condotte sulla linea utilizzata per l immunizzazione, sia in attiva fase di proliferazione sia spinta al differenziamento, su fibroblasti umani (per verificare la tessuto-specificità della marcatura) e su cellule staminali neurali umane sane. Da questa prima analisi è emerso che 4 degli 11 cloni, provenienti dalla selezione iniziale, mostravano un pattern di netta e specifica marcatura: i cloni stemg03 e stemg04 che mostrano una marcatura nucleare che diminuisce durante il differenziamento (rispettivamente del 28% e 60 %); i cloni stemg09 e stemg10 hanno evidenziato una marcatura di membrana anch essa differenziale tra cellule in attiva fase di proliferazione rispetto alle stesse cellule poste a differenziare. I surnatanti sono stati successivamente inviati alle altre unità operative per la validazione attraverso le metodiche TMA e CLMA. Sono seguite analisi immunoistochimiche su tessuti tumorali secondari che confermano i risultati prodotti dai cloni stemg03 e stemg04.

11 È con grande piacere che riportiamo che il clone Stem03 è risultato efficace nel rilevare il 100% delle cellule tumorali umane dopo trapianto nel topo, ed è cosi stato utilizzato per una serie di validazioni per il trattamento dei tumori cerebrali, i cui dati, sottoposti alla commissione congiunta AIFA e ISS pe la fase pre-ind, sono stati ritenuti sufficienti per permettere il deposito di una domanda d inizio sperimentazione umana con questa proteina, validando, nei fatti e nella forma, il metodo di cui sopra. (11 ottobre 2010). Gli animali immunizzati con le GCSCs (da ARETA Int.) sono stati sacrificati e dalla generazione di hybridomi è stato possibile selezionare, con tests ELISA, 20 cloni madre. Così come per il primo batch di anticorpi, anche in questo caso sono state effettuate analisi immunocitochimiche per evidenziare una tessutospecificità ma soprattutto la presenza di differente marcatura di GCSCs proliferanti o differenziate. Il numero di cloni è quindi considerevolmente sceso a 5: 11G5, 14B6, 15C6, 24D5, 25G7, tutti con evidente marcatura di membrana. Sono stati identificati inolte due cloni con alta affinità e selettività per le TNSCs che sono attualmente in fase di scale up e

12 validazione al fine di trasformarli in tools diagnostici e, possibilmente, terapeutici sperimentali. Gli altri membri di questo secondo batch di anticorpi sottostanno attualmente ad una fase di approfondimento dello studio delle loro caratteristiche. Al momento non è stato possibile eseguire la validazione tramite analisi TMA e CLMA che, a breve, verrà però eseguita prima di passare alla fase di identificazione del bio-marcatore corrispondente attraverso tecniche di spettrometria di massa. Al fine di testare un diverso approccio metodologico, nell ultima fase le cellule GCSCs sono state fornite all unità ISB (Ion Source Biotechnologies). L'analisi LC-MS ad alta accuratezza di massa ha mostrato risultati sorprendenti ed è stata selezionata come tecnica di riferimento per l'identificazione di bio-marcatori candidati alla differenziazione tissutale;

13 l'unica in grado di giungere alla rivelazione di due potenziali molecole proteiche, aventi rapporto m/z rispettivamente pari a e 4746,5 e corrispondenti alle proteine DIPLA-antisense e alla proteina BAGE5, differenzialmente espresse, che saranno ora oggetto di nuovi e più approfonditi studi a livello di espressione genica in quanto per ora la possibilità di utilizzare tecniche di TMA o CLMA è minima in quanto non esistono in commercio anticorpi che permettano la visualizzazione di queste molecole così come fatto per gli anticorpi prodotti e selezionati da Stemgen. Le sezione ricavate dal CLMA descritto in figura sono state processare per validare la specificità degli anticorpi forniti da Stemgen; come controllo positivo, è stata effettuata una marcatura con SOX-2, antigene tipicamente espresso da cellule staminali neurali in stato proliferativo. Parallelamente l analisi immunoistochimica di tessuto tumorale secondario proveniente da topi inoculati con GCSCs. Gli anticorpi stemg01, stemg02, stemg09 e stemg10 sembrano in grado di marcare le cellule di glioblastoma anche in vivo. Per l anticorpo Stem01 è stato inoltre possibile vedere una immunopositività su tutte le linee cellulari analizzate, visualizzando uno prevalentemente una marcatura citoplasmatica. Tutti gli anticorpi non mostrano marcatura positiva su

14 cellule U87 e cellule staminali neurali umane sane; in immunoistochimica su tessuti tumorali secondari si conferma, nella zona di sviluppo della massa tumorale (SOX2 positiva) una forte positività per stemg01 e stemg02 e meno intensa per stemg09 e stemg10. Le regioni sane analizzate sono risultate negative per tutti gli anticorpi utilizzati, a conferma della specificità di questi anticorpi per le cellule di origine umana. I TMA degli xenograft cerebrali e sottocutanei confermano le analisi CLMA evidenziando come solamente gli anticorpi stemg01, stemg02, stemg09, stemg10 possano essere considerati potenziali markers per le cellule GCSCs.

15 Lo sviluppo di nuovi terreni per la crioconservazione delle linee cellulari stabilite è indispensabile per la creazione di crio-banche al fine di conservare questo prezioso materiale. Sono stati paragonati diversi medium di congelamento, alcuni contenenti dimetilsulfossido (DMSO), molecola largamente impiegata nella crio conservazione, ma con effetti tossici sulle cellule conservate, ed altri contenenti una molecola, il Trealosio un disaccaride non riducente in grado di ridurre la formazione e dimensione di cristalli preservando l integrità della membrana plasmatici durante i processi di congelamento. Lo scongelamento è un momento estremamente importante per la vitalità cellulare ed è necessario che venga eseguito in tempi rapidi. E stato eseguito immergendo ed agitando costantemente le cryovials contenenti i campioni in bagno termico a 37 C per circa 2 minuti. Successivamente il campione è stato recuperato con terreno, centrifugato per 5 minuti a 1250 rpm, risospeso nel terreno di coltura completo e trasferito nelle apposite fiasche. Al fine di determinare l efficacia della soluzione sperimentale di congelamento sono stati effettuati tests di vitalità con l impiego sia della metodica di inclusione/esclusione del trypan blue sia con analisi via FACS (Guava ) eseguendo il test EasyCyte; i tests sono stati eseguiti 24 ore dopo lo scongelamento, momento critico ed importante per valutare la vitalità cellulare in quanto in questo particolare momento si ha il picco di mortalità che permette di valutare l efficacia delle soluzioni criopresevanti utilizzate. I risultati ottenuti dimostrano che l utilizzo della molecola di Trealosio (da 0,5 M a 1,0 M) nei medium di congelamento riduce considerevolmente la mortalità delle cellule congelate, a 24 ore dopo scongelamento rispetto all uso di DMSO. E quindi auspicabile l introduzione di questa molecola da sostituirsi al DMSO per creare crio-banche dove le cellule ricoverate possano mantenere invariate le proprie caratteristiche geno e fenotipiche non essendo quindi influenzate da molecole che se da una parte ne permettono la crio-conservazione, dall altra influenzano le proprietà di queste cellule ad ogni successivo congelamento/scongelamento. Il lavoro svolto dalle diverse unità durante i tre anni del progetto ha consentito l identificazione di nuovi potenziali marcatori specifici per la

16 componente cellulare più rara, ma anche la più aggressiva all interno del GBM nonchè responsabile della formazione di recidive. Le analisi immunoistochimiche e immunocitochimiche, condotte con le nuove piattaforme dei partners hanno permesso di validare gli anticorpi prodotti e selezionati partendo dall immunizzazione di GCSCs. L anticorpo stemg03, sebbene per ragioni imputabili ai metodi di preparazione del campione istologico, non sia stato visualizzato attraverso le piattaforme TMA e CLMA è risultato di estremo interesse per la tracciatura di cellule staminali tumorali in vivo, al punto che si sta provvedendo ad una serie di validazioni per il trattamento dei tumori cerebrali i cui dati sono stati sottoposti alla commissione congiunta AIFA e ISS per la fase pre-ind. Và inoltre considerato che la componente cellulare target verso cui abbiamo focalizzato il nostro lavoro è anche la più rara e quindi, partendo da un materiale eterogeneo, quale può essere il materiale utilizzato per l immunizzazione, le cellule, sia molto più difficile poter ottenere anticorpi potenzialmente utili a scopo diagnostico e terapeutico. In virtù di quanto appena discusso, è proprio grazie a questo approccio selettivo e stringente che gli anticorpi isolati risultano poi essere di grande valore per le applicazione intese. Confermiamo, quindi, come l approccio utilizzato per produrre anticorpi monoclonali sia il migliore, in virtù dell attuale assenza di biomarkers specifici, capaci di discriminare tra le varie popolazioni cellulari presenti nella massa tumorale. L approccio attraverso la spettrometria di massa ha fornito una valida alternativa ai metodi fino ad ora utilizzati nella ricerca di biomarker in quanto l analisi differenziale tra cellule staminali tumorali e cellule staminali neurali sane ha permesso di evidenziare differenze di espressione di alcune proteine, tra le quali, DIPLA1 antisense in tempi più brevi, considerando che, per quanto riguarda gli anticorpi monoclonali prodotti, al momento non è ancora stata individuata la molecola target corrispondente visualizzabile con esperimenti di spettrometria di massa. I risultati ottenuti, hanno mostrato come una piattaforma multidisciplinare sia indispensabile per proseguire nell opera d identificazione di bio-marcatori che identifichino all interno del glioblastoma, ma che possono essere poi traslate ad altre forme tumorali, la

17 popolazione cellulare con proprietà di cellule staminali, quelle cellule iniziatrici del tumore capaci anche in numero esiguo, di generare recidive nei pazienti che si sottopongono ad operazioni di resezione chirurgica. Le nuove tecnologie utilizzate dai partners partecipanti al progetto PISTA permettono inoltre operazioni di screening su più campioni temporaneamente e la possibilità di verificare sullo stesso campioni più marcatori, apportando a livello diagnostico una diminuzione dei tempi canonici di una analisi istochimica. Data l eterogenità del glioblastoma multiforme umano, è necessario poter derivare il maggior numero di linee cellulari da pazienti per aumentare l attendibilità delle future nuove terapie oltre che per essere in grado di selezionare nuovi bio-marcatori prognostici della malattia; a tale scopo si rende quindi necessaria la costituzione di criobanche e quindi la possibilità di utilizzare nuove sostanze crio-preservanti che rispetto a quelle tradizionali, evidenzino minori effetti citotossici che incidono sulla vitalità delle cellule durante le fasi di scongelamento impedendo così possibili fenomeni di pressione selettiva che potrebbero rendere le linee cellulari, nei vari passaggi di coltivazione in vitro, differenti da quella originalmente derivata dal tumore umano. SCOUTING TECNOLOGICO & SVILUPPI FUTURI Il progetto in questione avrà un notevole impatto sia a livello del settore biotecnologico, sia per l industria farmaceutica. Infatti l isolamento di una popolazione rara di cellule staminali tumorali, responsabile dell iniziazione e della propagazione del tumore, rappresenta un modello innovativo per lo studio della malattia e per lo sviluppo di terapie innovative che potrebbe significare un miglioramento della qualità della vita. L identificazione di nuovi bio-markers unitamente allo sviluppo di nuove tecnologie di screening, più sensibili e rapide, potrebbe aprire la strada per la messa a punto di nuove metodologie diagnostiche che permettano una diagnosi precoce della malattia che consentirebbe di rendere più efficaci le terapie ad oggi utilizzate. Conseguentemente anche il settore medico/farmaceutico, in seguito agli importanti risultati proposti, trarrebbe dei vantaggi per la

18 progettazione di farmaci antitumorali di nuova generazione. In particolare, i risultati appena descritti delineano ora un sistema globale di tecniche, saggi e reagenti che è in fase di assemblamento, al fine di costituire una innovativa piattaforma tecnologica che permetterà lo screening high-throughput di nuovi farmaci e molecole terapeutiche attive sul vero colpevole dello sviluppo di glioblastoma, vale a dire le cellule staminali del glioma umano. Si tratta di un tool non disponibile sul mercato attuale che potrebbe non solo permettere lo sviluppo d intere nuove classi di agenti terapeutici ma permettere anche l identificazione di nuovi ed ad oggi sconosciuti meccanismi molecolari di sviluppo dei glioblastomi umani.

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