Pamela Magini Journal Club, Scuola di Specializzazione in Genetica Medica 12 Febbraio 2013, Torino

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1 Pamela Magini Journal Club, Scuola di Specializzazione in Genetica Medica 12 Febbraio 2013, Torino

2 Congenital erythropoietic porphyria (CEP) Patologia AR Mutazioni nel gene UROS (uroporfirinogeno III sintasi) Accumulo non fisiologico di uroporfirina I Correlazione genotipo-fenotipo Clinica Lesioni dermatologiche (fotosensibilità cutanea) Rarefazione dell architettura ossea Anemia emolitica Ipersplenismo massivo secondario Trattamenti Sintomatico: trasfusioni ripetute, splenectomia, fotoprotezione Trapianto di midollo osseo

3 Modello animale per CEP Topo knock-in Lesioni dermatologiche Accumulo di porfirine Anemia emolitica Approccio di terapia genica ex vivo Vettore lentivirale autoinattivante Valutazione degli effetti a lungo termine Trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSC) geneticamente modificate efficace Verneuil et al., 2008

4 Leuchemogenesi dovuta a eventi di inserzione provirale 9 pazienti con SCID X-linked trattati con terapia genica con successo 4 pazienti hanno sviluppato leucemia linfoblastoide acuta Hacein-Bey-Abina et al., 2008 Necessità di metodi di terapia genica più sicuri

5 Sistemi di terapia genica basati su ipscs (Pluripotent Stem Cells) Anemia di Fanconi Sickle-cell anemia Talassemia Emofilia B Vantaggi: ipscs possono essere mantenute indefinitamente in vitro Possibile caratterizzazione dei siti di integrazione provirale (ISs)

6 Scopo principale del lavoro: valutare se le ipscs possono rappresentare una risorsa cellulare adeguata per la terapia genica della CEP Strategia per generazione ipscs e differenziamento in HSCs 1.Produzione ipscs a partire dai cheratinociti epidermici di un individuo affetto vettori lentivirali rimovibili 2.Terapia genica additiva delle ipscs 3.Caratterizzazione dei siti di integrazione provirale 4.Differenziamento in HSCs 5.Valutazione dei livelli di correzione enzimatica e metabolica nelle cellule eritroidi ottenute

7 Genotipo cheratinociti Vettori lentivirali utilizzati: Riprogrammazione cheratinociti Correzione genetica ipscs Attività enzimatica residua: 2% dei livelli normali Parallela riprogrammazione e differenziamento di: cheratinociti da donatore sano cellule CD34 + da cordone ombelicale fibroblasti cutanei da donatore sano

8 Caratterizzazione delle ipscs ipscs mostrano caratteristiche tipiche delle cellule pluripotenti: Morfologia simile alle cellule staminali embrioniche umane Elevata attività della fosfatasi alcalina Espressione dei marker di pluripotenza Mantenimento della pluripotenza in vivo Cariotipo normale per tutti i cloni tranne 1

9 Caratterizzazione ipscs dopo escissione dei geni per la riprogrammazione Selezione dei cloni privi di entrambe le cassette di riprogrammazione Identificazione dei cloni con una sola copia del vettore HAUPins Studio dei siti di inserzione provirale : esclusione del clone 4-e Conferma del mantenimento della pluripotenza dei sottocloni: espressione dei marker e induzione di teratoma Cariotipo normale

10 Linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR) Schmidt et al., 2007

11 Differenziamento ematopoietico delle ipscs Le cellule CD45+ sono più abbondanti nella frazione non aderente (analisi FACS) La popolazione CD34 + e CD45+ è più abbondante nelle cellule derivate da cordone ombelicale (differenza non significativa) Cellule CD volte più abbondanti nella frazione aderente Colony Forming Unit assay: eritroidi (BFUs-Es) granulociti/monociti (CFU-GM) Accumulo fluorescente di porfirina nelle cellule non corrette

12 Differenziamento eritroide delle HSCs (frazione non-aderente) Differenziamento molto efficiente: 10% al giorno 10 76% al giorno 17 Abbondanti eritroblasti senza enucleazione (emoglobina fetale) Valutazione della funzionalità e della specificità del promotore del transgene Trasfezione del clone 10-f con vettore HAEPins Espressione GFP al completamento del differenziamento ematopoietico Progenitori eritroidi contenuti in una sacca e poi in sospensione

13 Correzione enzimatica e metabolica Attività enzimatica del gene UROS nelle cellule eritroidi 11% dell attività nelle cellule geneticamente corrette Conteggio fluorociti al termine del differenziamento scomparsa di fluorociti nelle cellule geneticamente corrette Una singola copia del transgene è sufficiente per la correzione metabolica delle cellule eritroidi

14 Discussione Generazione con elevata efficienza di ipscs da cheratinociti risultati migliori e in più breve tempo rispetto ai fibroblasti Tasso di differenziamento simile tra ipscs generate da cheratinociti e CD34 + espressione di MYC e downregolazione di TP53 escissione delle cassette di riprogrammazione I cheratinociti primari umani sono facilmente ottenibili, riprogrammabili e differenziabili in HSC Efficiente differenziamento in senso eritroide delle HSCs derivate da ipscs Correzione enzimatica e metabolica recupero 11% dell attività enzimatica e riduzione 90% accumulo L approccio clonale delle ipscs potrebbe consentire regime di condizionamento parziale caratterizzazione dei siti di integrazione provirale

15 Conclusioni Per un applicazione clinica sicura, l approccio di terapia genica basato su ipscs richiede un considerevole sforzo per ottenere cloni con: Cariotipo normale Piena pluripotenza Completa escissione delle cassette di riprogrammazione Un unica copia del gene terapeutico Integrazione in un ambiente genomico sicuro (GSH) Alternativa: integrazione del gene UROS wt in un GSH selezionato in silico attraverso nucleasi zinc finger (ZFNs) In futuro: target repair delle mutazioni specifiche

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