METODI ALTERNATIVI PER LA VALUTAZIONE DELLA FLORA TOTALE NEL LATTE CRUDO: CONSIDERAZIONI E CRITERI DI VALIDAZIONE
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- Martina Calabrese
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1 METODI ALTERNATIVI PER LA VALUTAZIONE DELLA FLORA TOTALE NEL LATTE CRUDO: CONSIDERAZIONI E CRITERI DI VALIDAZIONE Anna Maria Ferrini LNR per il latte e i prodotti a base di latte riunione tecnica a chiusura del progetto: Aggiornamento dell'equazione di conversione per la determinazione della carica batterica nel latte tramite apparecchiature automatiche operanti in citometria di flusso: conversione nazionale Bactoscan FC - anno 2012
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3 Metodo di riferimento definizione secondo EN ISO 16140: internationally recognized method and widely accepted I metodi di riferimento in microbiologia degli alimenti sono standardizzati a livello internazionale (ISO) ed europeo (CEN) e sono principalmente basati sulla microbiologia convenzionale massima applicabilità nella microbiologia degli alimenti a livello internazionale massimo consenso
4 Metodo Alternativo definizione secondo EN ISO 16140: method of analysis that demonstrates or estimates, for a given category of products, the same analyte as is measured using the corresponding reference method The alternative method exhibits attributes appropriate to the users' needs, for example: speed of analysis and/or response; ease of execution and/or automation;analytical properties (precision, accuracy, limit of detection, etc.); miniaturisation;reduction of cost.
5 Conta Batterica Totale (UFC/ml) METODO DI RIFERIMENTO EN ISO 4833 Singole cellule batteriche o singoli aggregati in grado di sviluppare colonie in opportune condizioni Risultato espresso in UFC/ml Tempo di risposta : ~ 72 h METODO DI ROUTINE (Metodo a citometria di flusso - Bactoscan FC/ Bactocount) Aggregati batterici disaggregati in cellule singole, citometria di flusso, conversione fascio di luce in impulsi elettronici Risultato espresso in IBC/μl Tempo di risposta: ~ 10 min
6 avanzamento sull armonizzazione dei fattori di conversione per la valutazione della CBT Kiel 2006 Richiesta del LCR milk ad ogni paese di elaborare una propria retta di conversione nazionale ISO : 2004 Milk: Quantitative determination of bacteriological quality- Guidance for establishing and verifying a conversion relationship between routine method and anchor method results
7 avanzamento sull armonizzazione dei fattori di conversione per la valutazione della CBT
8 avanzamento sull armonizzazione dei fattori di conversione per la valutazione della CBT
9 avanzamento sull armonizzazione dei fattori di conversione per la valutazione della CBT Maisons-Alfort 2010 Singola retta di conversione/tipo di strumento/paese Validazione dei metodi alternativi per la conta della flora totale nel latte crudo secondo il protocollo EN ISO Preparazione di un documento da parte di EU-RL for milk and milk products per criteri di validazione per combinare EN ISO 16140, EN ISO 21187, draft revision IDF 161 (ISO/DIS 16297, 2010) e in alcuni casi, IDF 128-3/ISO
10 EN ISO ISO/DIS ISO Max*/tentative value PARAMETRI DI VALIDAZIONE DEL METODO ALTERNATIVO Lim quantificazione inf x Lim quantificazione sup x Linearità x calcolo x Carry over x protocollo Stabilità Precisione: x x ripetibilità intralab x *Sr: 0,12 log 10 riproducibilità (Studio interlaboratorio) Valutazione dei fattori che impattano sui risultati x *SR: 0,16 log 10 Accuratezza x Sy,x: 0,40 log 10 x
11 Protocollo per la validazione (EN ISO 16140) Nello specifico, per la determinazione della flora totale con citometria di flusso occorre che i laboratori partecipanti producano risultati comparabili due opzioni: i laboratori partecipanti utilizzano il fattore di conversione stabilito dall organizzatore i laboratori partecipanti inviano all organizzatore i dati grezzi (espressi in unità del citofluorimetro) che vengono poi trasformati in UFC/ml dall organizzatore
12 avanzamento sull armonizzazione dei fattori di conversione per la valutazione della CBT Maisons - Alfort 2011 Verifica della possibilità di armonizzare i fattori di conversione a livello europeo Analisi dei dati grezzi ottenuti dai diversi LRN
13 Protocollo per la validazione (EN ISO 16140) definizione secondo EN ISO 16140: Demonstration that adeguate confidence is provided that the results obtained by the alternative method are comparable to those obtained using the reference method Due fasi: Studio comparativo dei metodi (MA vs MR) studio inter-laboratorio sui due metodi in parallelo Stima dell accuratezza e precisione del metodo alternativo rispetto al metodo di riferimento (EN ISO 16140)
14 Obiettivi progetto conversione nazionale Bactoscan FC - anno 2012 Produrre una retta unica di conversione nazionale statisticamente sostenibile, rappresentativa dell intero territorio nazionale e aggiornata Produrre dati in previsione della produzione della conversione unica europea
15 Progetto conversione nazionale Bactoscan FC Invito ai Laboratori deadline adesioni Raccolta adesioni Invio protocollo e format Analisi dei campioni/risultati LCR milk Report preliminare Invio individuale report rev1 Invito per la verifica strumentale Raccolta adesioni Invio liofilizzati Verifica strumentale/risultati Report giu-11 ago-11 set-11 nov-11 gen-12 feb-12 apr-12 mag-12 lug-12 set-12 ott-12 dic-12 feb-13 mar-13
16 RANGES OF IBC/ml richiesti per la selezione dei campioni IBC ranges Lab 2011 Lab circuiti 2009 e 2011 % di campioni sul n totale di campioni campioni % di campioni sul n totale di campioni campioni
17 Progetto Aggiornamento retta di conversione Obiettivo raggiunto: Produzione di una retta unica di conversione per l Italia elaborazione complessiva (2.732 dati) rappresentatività del territorio nazionale
18 Progetto Aggiornamento retta di conversione conclusione: Passaggio alla nuova retta di conversione nazionale 2012 (retta unica per l Italia)
19 Grazie per l attenzione annamaria.ferrini@iss.it
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