RELAZIONE FINALE STAGE DOTT.SSA MIGLIO ARIANNA. Stage c/o Parchi scientifici o strutture specialistiche o realtà imprenditoriali di livello avanzato

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1 RELAZIONE FINALE STAGE DOTT.SSA MIGLIO ARIANNA Stage c/o Parchi scientifici o strutture specialistiche o realtà imprenditoriali di livello avanzato TITOLO DEL PROGETTO REALIZZAZIONE DI UN LABORATORIO DI ANALISI CLINICHE SPECIALIZZATO IN EMATOLOGIA, CITOLOGIA E PATOLOGIA CLINICA VETERINARIA 1. L ESAME DEL MIDOLLO OSSEO La valutazione citologica del midollo osseo, seppure complicata e poco praticata in medicina veterinaria, è di notevole utilità diagnostica in molti casi ed, inoltre, alcuni disordini del sistema ematopoietico possono essere identificati soltanto tramite l esame del midollo osseo (MO). Oltre ad aver acquisito le capacità di eseguire un esame citologico del midollo osseo è stato fondamentale comprendere le indicazioni e le controindicazioni ad esso connesse. Indicazioni per una valutazione del MO L esecuzione del puntato midollare è indicata in una gran varietà di situazioni: in caso di anormalità ematologiche di difficile interpretazione quali: anemie non rigenerative (nell anemia rigenerativa alcuni indici di rigenerazione quali il conteggio reticolocitario, la presenza di corpi di Howell-Jolly ed eventualmente di eritroblasti nel sangue periferico rendono inutile il prelievo di MO); neutropenie persistenti: è utile osservare il rapporto tra i vari precursori dei granulociti ed il rapporto mieloide/eritroide; trombocitopenie: se il numero dei megacariociti midollari è normale o elevato, allora la piastrinopenia è dovuta a distruzione (es. immunomediata) o consumo (es. CID). Tali citopenie possono manifestarsi isolate o in associazione tra di loro (es. nel gatto positivo al FIV o al FeLV o nell Ehrlichiosi)

2 anormale morfologia eritrocitaria (poichilocitosi) reazioni cellulari atipiche: es. presenza di eritroblasti senza altri segni di rigenerazione, deviazione a sinistra neutrofilica senza lesioni infiammatorie. nelle neoplasie: nei linfomi per valutare il coinvolgimento del midollo osseo a scopo di classificazione clinica e prognosi nelle leucemie, principalmente quelle senza coinvolgimento del sangue periferico nei tumori metastatici (es. mastocitomi, carcinomi, melanomi) nei mielominelle anemie da carenza di Ferro (si esegue la colorazione Blu di Prussia per la valutazione delle riserve marziali midollari) per la ricerca di agenti eziologici quali Leishmania donovani, Hepatozoon canis, Ehrlichia sp., Histoplasma capsulatum, ecc. in caso di alterazione di alcuni dati ematochimici: es. iperproteinemia di origine ignota; gammopatia monoclonale (mieloma, Ehrlichia sp.), gammopatia policlonale (Leishmania sp., linfoma, micosi sistemiche, ecc.); ipercalcemia: tumori metastatici osteolitici (linfoma, mieloma, certi carcinomi, osteosarcoma); Controindicazioni - Sono minime; il maggior rischio è dato da emorragie in animali con disordini dell emostasi. In questi casi il prelievo può essere eseguito da siti più profondi, per esempio la testa del femore piuttosto che la cresta iliaca, poiché le masse muscolari sovrastanti servono a contenere una eventuale emorragia. In ogni caso, raramente ci si trova di fronte ad un considerevole sanguinamento anche in animali con gravi trombocitopenie.

3 2. ASPETTI SANITARI E GESTIONALI DI UN CENTRO EMOTRASFUSIONALE VETERINARIO: La pratica trasfusionale, in medicina veterinaria, ha ricevuto negli ultimi decenni un grande impulso soprattutto negli animali d affezione (cane, gatto e cavallo). Numerosi studi ne hanno supportato l impiego in molte patologie di origine differente (avvelenamenti, coagulopatie, traumatismi, etc.) dimostrando la sua assoluta necessità per la salute animale. La materia riguardante il prelievo e l utilizzo del sangue intero di origine animale, prelevato da animali di proprietà di persone giuridiche e/o fisiche, per lo scopo trasfusionale fino ad ora non era mai stato oggetto di indirizzi precisi, omogenei ed esaustivi. Ciò ha comportato una serie di problematiche, in particolare riferite a questioni sanitarie, riguardanti sia la SANITA PUBBLICA che ANIMALE, etiche e di benessere animale. La pratica trasfusionale, infatti, già molto impiegata in medicina veterinaria, ma non controllata, non è esente da rischi reali per il ricevente e potenziali per il donatore, nonché per l uomo vista la possibile diffusione di ZOONOSI. Sulla base di ciò, vista l importanza e la complessità della materia, è stato recentemente costituito un gruppo di lavoro nazionale, con la compartecipazione di esperti di varia estrazione (Regioni, ASL, ordini professionali, Università, etc.) che ha provveduto ad esaminare la problematica. La normativa recentemente emessa dalla Direzione Generale della Sanità Animale e del Farmaco Veterinario ( Linea guida vincolante relativa all esercizio delle attività sanitarie riguardanti la medicina trasfusionale in campo veterinario repertorio atti 256/CSR), approvata dalla Giunta della Regione Umbria con apposita delibera (DELIBERAZIONE DELLA GIUNTA REGIONALE - REGIONE UMBRIA- n. 34 del 21/01/2008), ha finalmente regolamentato tale materia delineando specifiche norme a cui attenersi e definendo i requisiti minimi igienico-sanitari dei donatori-riceventi, delle strutture, del trasporto e della conservazione del sangue animale ad uso trasfusionale. Alla luce di quanto sopra premesso si rende necessario ed urgente approfondire gli aspetti sanitari e gestionali della materia in oggetto al fine di progettare e realizzare nella nostra Regione una struttura specializzata, idonea sulla base delle recenti norme. Allo stato attuale, purtroppo, la disponibilità di prodotti emotrasfusionali nella clinica degli animali d affezione è legata alla totale assenza nel territorio umbro di centri trasfusionali e/o emoteche e di una distribuzione delle stesse in ambito nazionale assolutamente insufficiente a coprire il fabbisogno attuale. Le vigenti norme, inoltre, rendono difficoltosa l autonomia dei piccoli centri veterinari (ambulatori veterinari, cliniche veterinarie, etc.) nella gestione della pratica trasfusionale per la complessità gestionale e per i costi spesso non sostenibili divenendo, così, necessaria la loro dipendenza nel

4 reperimento, trattamento e stoccaggio del sangue animale da un centro specialistico che si occupi solo di tale materia. Lo stage a Torino mi ha permesso di conoscere un centro di medicina trasfusionale altamente specializzato e, così, di identificare e mettere a punto le metodiche analitiche ad essa connesse più appropriate per ciascuna specie animale considerata (cane, gatto, cavallo) e di conoscere le problematiche sanitarie legate alla gestione di un emoteca veterinaria. La realizzazione della mia idea imprenditoriale è una tappa fondamentale e imprescindibile per la successiva creazione di un EMOTECA VETERINARIA, struttura specialistica necessaria a soddisfare le richieste relative all esercizio delle attività sanitarie riguardanti la medicina trasfusionale che ad oggi si manifestano palesemente nel territorio e che incrementeranno sempre di più in futuro vista la normativa attuale. 3. APPLICAZIONI DELLA CITOMETRIA A FLUSSO IN MEDICINA VETERINARIA La citometria a flusso è una tecnica analitica relativamente recente che permette un analisi multiparametrica di un gran numero di cellule in sospensione. In medicina umana trova largo impiego non solo nell ambito della ricerca, ma anche nella pratica routinaria. In medicina veterinaria tale metodica viene utilizzata in tempi più recenti, e soprattutto nel campo della ricerca, sia per gli alti costi delle attrezzature, sia perché soltanto negli ultimi anni si è avuta disponibilità di anticorpi monoclonali specie-specifici. Uno dei principali problemi che ha ritardato l avvio degli studi in medicina veterinaria è infatti la mancanza di reagenti specifici: solo alcuni anticorpi monoclonali diretti verso antigeni di superficie umani o di una specie animale sono in grado di riconoscere gli antigeni di un altra specie. Anticorpi monoclonali sono stati prodotti in diverse specie di animali domestici tra cui cane, gatto, bovino, cavallo, suino, capra, pollo. Alcuni Workshop hanno analizzato le molecole di superficie cellulari del cane, dei ruminanti e del cavallo allo scopo di identificare anticorpi monoclonali specifici per quelle specie animali. Le applicazioni della citofluorimetria sono numerose e interessano sia gli animali da affezione, sia gli animali da reddito. Il Laboratorio di analisi dell Università di Torino è uno dei pochi centri di eccellenza in Italia in cui vi sono esperti in materia. Tra le principali applicazioni cliniche l oncologia rappresenta una delle più rilevanti, così come in medicina umana. In specie animali quali il cane e il gatto trovano impiego nella classificazione immunofenotipica delle neoplasie emolinfopoietiche a scopo diagnostico e prognostico. Studi vengono effettuati anche sulle sottopopolazioni linfocitarie nella cute di cani e gatti con

5 dermatite atopica. I virus dell immunodeficienza felina (FIV) e bovina (BIV) vengono studiati come modello per l AIDS umana per le analogie che presentano nella patogenesi e nelle alterazioni delle sottopopolazioni linfocitarie. Inoltre nel gatto il numero delle cellule T CD4+ e l inversione del rapporto CD4/CD8 hanno importanti implicazioni nella pratica veterinaria per monitorare la progressione della malattia, prevedere il tempo di sopravvivenza ed attuare appropriate terapie; sono state effettuate ricerche relative al cane e al gatto sul contenuto in DNA e all attività proliferativa, valutata mediante la fase S e l individuazione di proteine correlate al ciclo cellulare quali Ki67, PCNA, p105, p34. Questi studi sono stati condotti in alcuni tipi di tumore per valutare la rilevanza clinica di questi parametri dal punto di vista della diagnosi e della prognosi ed hanno evidenziato differenze nei confronti di analoghi tumori umani. Oltre a questi principali impieghi della citofluorimetria, esistono molte altre applicazioni. Il conteggio citofluorimetrico dei reticolociti, che in medicina umana sta diventando il metodo standard per la valutazione delle anemie, è più preciso e riproducibile del classico metodo manuale, soggetto ad una elevata percentuale di errore; inoltre il metodo citofluorimetrico permette di distinguere anche il grado di maturazione dei reticolociti. Nel gatto è di particolare utilità per la presenza di un elevato numero di reticolociti puntati, più difficilmente rilevabili con il conteggio manuale. La determinazione citofluorimetrica degli anticorpi antipiastrine costituisce un metodo più accurato dei test classici e trova applicazione nella diagnosi della trombocitopenia immunomediata, patologia relativamente frequente in medicina veterinaria. Con metodo citofluorimetrico sono anche state indagate le funzioni dei neutrofili, in particolare l attività fagocitaria, in cani con piodermite o sottoposti a somministrazione di corticosteroidi. Infine, sempre nel campo degli animali da compagnia, la citofluorimetria viene utilizzata per l identificazione di parassiti ematici morfologicamente indistinguibili dai corpi di Howell-Jolly o dalle punteggiature basofile, come l Haemobartonella. Ancora più numerosi sono gli studi citofluorimetrici negli animali da reddito. Ricerche relative ad alterazioni delle sottopopolazioni linfocitarie ematiche sono state compiute in bovini con malattie virali: in particolare esistono studi sulla leucosi enzootica (LEB), sulla immunodeficienza indotta dal BIV e sulle infezioni da virus della BVD e da Herpesvirus. Nella leucosi bovina è stato descritto un aumento percentuale e assoluto dei linfociti B ed anche, se pur in minor misura, delle cellule T in valore assoluto; per quanto riguarda il virus della diarrea bovina, non si sono evidenziate alterazioni delle sottopopolazioni linfocitarie ematiche, mentre si è osservato che tale virus induce apoptosi nelle cellule T CD4+ e CD8+ con un meccanismo dipendente dai monociti. La citofluorimetria viene anche indicata come un buon metodo per individuare il virus nelle cellule

6 ematiche di bovine infette. Alterazioni delle sottopopolazioni linfocitarie sono anche state studiate in alcune malattie parassitarie (Theileriosi, Tripanosomiasi) e in seguito a stress da trasporto, da parto e dopo somministrazione di corticosteroidi. L espressione delle molecole di adesione e le funzioni dei granulociti neutrofili sono stati studiati nella mastite bovina, sia nelle cellule del sangue che in quelle del latte ed inoltre la citofluorimetria viene applicata per valutare la qualità del seme. Per quanto riguarda i cavalli, esistono studi relativi alle popolazioni linfocitarie e alla funzionalità dei neutrofili nel sangue periferico e nel lavaggio bronco-alveolare di cavalli sani e con patologie polmonari. Le ricerche nel campo della citofluorimetria sono, da quanto si può evincere dalla letteratura, in rapida espansione in molti settori della medicina veterinaria. Un maggiore utilizzo di questa tecnologia permetterà di ampliare le conoscenze nel campo delle malattie neoplastiche, immunomediate, parassitarie ed ematologiche. Nella pratica clinica consentirà inoltre un affinamento delle capacità diagnostiche e prognostiche e la messa a punto di terapie più specifiche, nonché il monitoraggio della risposta alla terapia. Sulla base delle esperienze vissute nello stage, quindi, ho potuto verificare che la messa in pratica di tale progetto imprenditoriale assumerebbe un'indiscussa utilità per lo sviluppo economico e scientifico della Regione Umbria che si porrebbe, così, ai primi posti tra le Regioni italiane all'avanguardia nel campo della Medicina di Laboratorio Veterinaria. La messa a punto e, quindi, la creazione di un centro specializzato in grado di offrire prodotti e servizi di fondamentale importanza per la sanità animale nonché innovativi rispetto a quelli esistenti al momento. Facoltà di Medicina Veterinaria Medici Veterinari Liberi Professionisti Ambulatori Veterinari, Cliniche Veterinarie e Ospedali Veterinari ASL (Aziende Sanitarie Locali) Allevamenti di animali d'affezione (cane, gatto, cavallo) Centri del cavallo sportivo, maneggi -Associazioni per la protezione animale

7 Fondamentale è, anche, l'importanza che il servizio offerto dall attività imprenditoriale svolgerebbe in campo di SANITA' PUBBLICA. Il mercato di riferimento è, quindi, piuttosto ampio e va dal soggetto privato a strutture pubbliche correlate con Sanità Animale e Umana. L esperienza vissuta a Torino con molto entusiasmo sarà sicuramente il punto di partenza per l organizzazione e la messa a punto dell idea imprenditoriale da me presentata. Il percorso da affrontare per giungere alla realizzazione del progetto sarà ancora molto lungo e appassionante vista la necessità futura di approfondire ulteriormente le conoscenze nei riguardi della medicina di Laboratorio in altre strutture specialistiche nazionali e, soprattutto, internazionali. L inizio del percorso è comunque segnato dalla necessità di inoltrare la domanda di richiesta di sostegno finanziario a favore dell'imprenditoria giovanile (legge regionale 23 marzo 1995, n 12) al termine del periodo di Dottorato di Ricerca che sto svolgendo.