BAL: TECNOLOGIE PER L ANALISI DI LABORATORIO

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1 Dipartimento di Diagnostica di Laboratorio SODc LABORATORIO GENERALE Dir. f.f. Dott.ssa Alessandra Fanelli SODs MICROSCOPIA E CITOMETRIA EMATOLOGICA BAL: TECNOLOGIE PER L ANALISI DI LABORATORIO Roberto Caporale

2 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL) E una tecnica broncoscopica che consiste nell instillazione di soluzione fisiologica nelle vie aeree distali con seguente aspirazione e recupero del liquido. Si basa sul principio che le cellule e i componenti non cellulari presenti sulla superficie epiteliale degli alveoli sono rappresentativi del sistema infiammatorio e immunitario di tutto il tratto respiratorio inferiore.

3 BRONCOSCOPIO Sol.Fisiologica a 37 C ml in tre aliquote (20-50 ml) VALVOLA 50 ml SIRINGA VACUUM PUMP mm Hg FLUIDO ASPIRATO MICROBIOLOGIA prima Aliquota CITOLOGIA CITOMETRIA

4 Analisi delle cellule infiammatorie nel Lavaggio Bronco-alveolare (BAL) Nelle malattie respiratorie non maligne il BAL raffigura abbastanza accuratamente le reazioni immuni che avvengono nel bronchiolo terminale e nell interstizio alveolare e complementano la TAC ad alta risoluzione (HRCT) Il BAL è fortemente consigliato nella diagnosi differenziale dei processi infiammatori interstiziali: Sarcoidosi, Pneumconiosi, Polmoniti da ipersensibilità, Bronchiolite obliterante (BOOP), Fibrosi polmonare, coinvolgimento polmonare nella Malattie autoimmuni La standardizzazione della procedura e il coordinamento tra medici e laboratorio sono estremamente importanti per ottenere risultati coerenti. E un analisi delicata: le cellule nel fluido del BAL sono stabili fino a 4 ore.

5 Raccomandazioni: Trasporto del campione Processazione Analisi Utilità diagnostica

6 Meyer KC. Am J Respir Crit Care Med 2012; 185:

7 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): preparazione del campione BAL appena prelevato 400 µl per la conta cellulare assoluta AB 12 cd Annotare: apparenza quantità eventuale contaminazione con sangue AB 12 cd Filtrare con garza sterile per eliminare muco e grossi detriti (non aggiungere liquido) AB 12 cd AB 12 cd 400 µl per Cytospin 1 ml per analisi citometrica (FCM) Eventale centrifugazione a 1500 rpm per 10 per scarsa cellularità e risospensione in 1 ml PBS FCM

8 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): preparazione del campione Valutazione della cellularità totale Citogramma Determinazione dell Immunofenotipo Conta su contaglobuli Sysmex XE-5000 con software per liquidi biologici Colorazione con Wright-Giemsa modificato Esame morfologico e conta differenziale dei leucociti su sistema DM96 Vitalità con colorante nucleare 7-AAD Pannello linfocitario completo Determinazione di altri tipi cellulari con pannelli di MoAb specifici.

9 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): conta cellulare SYSMEX XE-5000 (+ body fluid software) Body Fluid Linearity WBC-BF: x 10 3 /µl TC-BF: x 10 3 /µl RBC-BF: x 10 6 /µl

10 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): conta cellulare SYSMEX XE-5000 (+ body fluid software)

11 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): preparazione del cytospin Questa procedura : Concentra le cellule Minimizza la distorsione cellulare Produce un monostrato di cellule Materiale citocentrifuga: Filtri di carta Contenitori ad imbuto Ganci di metallo Vetrini 200 µl Le cellule saranno cosi concentrate in un pellet. La colorazione di Wright- Giemsa modificato è raccomandata perché mostra ottimi dettagli morfologici.

12 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): morfologia cellulare SYSMEX DM96 Scansiona un'area definita dall'utente del vetrino per microscopio Individua e presenta automaticamente le immagini delle cellule su strisci presenti in diversi tipi di campioni È destinato all'uso da parte di operatori esperti

13 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): morfologia cellulare SYSMEX DM96 (+ body fluid software)

16 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): Normale morfologia cellulare cellule per ml Macrofagi: % Linfociti: % Neutrofili: 1 2 % Eosinofili: < 1% Le caratteristiche del Cytospin sono determinanti per l analisi immunofenotipica

17 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): Analisi Citometrica (CFM) Sistema FACSCanto II BD Biosciences La CFM consente l analisi automatica di sospensioni cellulari monodisperse, misurandone le caratteristiche fisiche e/o biochimiche all interno di un flusso laminare che interseca una sorgente di eccitazione

18 Immunofenotipizzazione cellulare Insieme di metodi diretti al riconoscimento, alla quantificazione ed alla localizzazione di strutture cellulari per mezzo di reagenti immunologici (anticorpi monoclonali). L'analisi dell immunofenotipo permette la classificazione delle cellule in termini di: differenziazione (linea di appartenenza) maturazione applicata all'analisi di cellule patologiche ne consente la definizione, in termini di linea, di stadio differenziativo e di clonalità.

19 Valutazione su sangue midollare (Pannelli multicolore) precursori Linfociti maturi

20 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): Analisi Citometrica Cosa possiamo studiare: Vitalità cellulare (colorante nucleare 7-AAD) Linfociti (T, B, NK, ratio CD4/CD8) Monociti / Macrofagi (CD14+, CD36+, CD11b+) Granulociti neutrofili (CD13+, CD15+, HLA-DR neg.) Granulociti eosinofili (CD13+, CD16+ dim. CD9+) Altri tipi cellulari: Linfociti T attivati (CD3+/HLA-DR+) Istiociti (CD1a+, CD45+++) Mastcellule (CD117+, HLA-DR neg.)

21 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): Analisi Citometrica: vitalità cellulare 7-aminoactinomycin D (7-AAD) Cellule morte Cellule vitali Le cellule vitali sono 7-AAD negative

22 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): Distribuzione dei linfociti T CD3+: 70-90% T CD4+: 38-45% T CD8+: 30-40% CD4/CD8 Ratio: Linfociti T attivati (CD3+ / HLA-DR+): 32 45% B CD19+/CD20+: 3-6% NK CD16+/CD56+: 4-7%

23 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): Distribuzione dei linfociti in campione normale CD3/CD4 58% Linfociti 15% CD3 94% CD3/CD8 36% CD4/CD8 ratio = 1,6

24 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): Distribuzione dei linfociti in campione con linfociti T attivati CD3/CD4 14% Linfociti 25% CD3 97% CD3/CD8 74% CD3/HLA-DR 53% CD4/CD8 ratio = 0.18

25 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): Distribuzione dei linfociti in campione con sospetta Sarcoidosi CD3/CD4 87% CD3/CD8 11% Linfociti 27% CD3 96% CD4/CD8 ratio = 7.9

26 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): Distribuzione dei linfociti in campione con LNH-B Linfociti 72%

27 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): Distribuzione dei linfociti in campione con Linfopatia T Linfociti totali: 50% Fenotipo atipico: CD2+, CD5+, CD4+ CD7+, HLA-DR+. Negativi CD3, CD8, TCR alfa/beta e TCR gamma/delta.

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29 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): Linfopatia T EOSINOFILI MACROFAGI LINFOCITI Granulociti eosinofili (CD13+, CD16+ dim. CD9+)

30 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): Linfopatia T

31 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): Sospetta infezione polmonare

34 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): Sospetta infezione polmonare neutrofili neutrofili neutrofili macrofagi Neutrofili: CD15+, CD16+, CD11b+, CD14-, HLA-DR- Macrofagi: CD15- CD16+/-, CD14+, HLA-DR+

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36 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): Valutazione Macrofagi e g. neutrofili NEUTROFILI MACROFAGI NEUTROFILI MACROFAGI Macrofagi: CD13+, CD14+, CD11b+, CD36+ Neutrofili: CD15+ CD13+, CD11b+, CD14-, CD36-

37 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): Valutazione Mastcellule e Istiociti macrofagi macrofagi istiociti linfociti PMN CD1a+ istiociti vs CD45+ FSC / SSC BACKGATING CD1a+ PE istiociti Mastcellule Mastcellule: CD117+ HLADR- (< 1%) Istiociti: CD1a+ CD45+++ (< 2%) linfociti macrofagi

38 BAL Cell Pattern May Suggest the Underlying Disease Meyer KC. Am J Respir Crit Care Med 2012; 185: Lymphocytes > 25% Lymphocytes > 50% CD4 / CD8 ratio > 4 Neutrophils > 50% Eosinophils > 25% Mast Cells > 1% Lymphocytes > 50% Neutrophils > 3% Granulomatous Diseases (Sarcoidosis, Hypersensitivity Pneumonitis, Berillosis), Cellular non-specific Interstitial Pneumonia, Lymphocytic Interstitial Pneumonia, Cryptogenic Organizing Pneumonia, Drug Reactions, Lymphomas. Hypersensitivity Pneumonia Cellular non-specific Interstitial Pneumonia Sarcoidosis (Highly specific, in absence of other inflammatory cells) Acute Lung Injury, Aspiration Pneumonia, Suppurative Infection Acute or Chronic Eosinophilic Pneumonia Acute Hypersensitivity Pneumonitis

39 Le malattie interstiziali del polmone (ILD) sono associate con la prevalenza di T CD4+ o CD8+ nel BAL Sarcoidosi Berillosi Asbestosi Artrite reumatoide Morbo di Crohn Tuberculosi prevalenza di CD8+ prevalenza di CD4+ Alveolite da iperesensibilità (EAA) Silicosi Collagenopatia e Vasculite (con o senza Fibrosi) Bronchiolite obliterante (BOOP) Blastomicosi GVHD AIDS e infezioni da HTLV1 induzione da farmaci Rigetto del trapianto di polmone

40 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): nuove prospettive Immunofenotipo avanzato della funzionalità di CD4 linfociti Th 1: producono IFN- e TNF- (Immunità cellulare) linfociti Th 2: producono IL-4, IL-5, IL-13 (Immunità umorale) linfociti Th 17: producono IL-17 (Immunità innata) CD4+ CXCR3+ CCR6- CD4+ CXCR3- CCR6- CD4+ CXCR3- CCR6+

41 Lavaggio Bronco-alveolare (BAL): CONCLUSIONI Con l introduzione delle tecniche di analisi del BAL l approccio diagnostico alla patologia polmonare è radicalmente cambiato, riducendo di fatto il numero di biopsie polmonari. Particolarmente utile a scopo diagnostico sia nella patologia interstiziale del polmone che nella patologia infettiva e neoplastica. La standardizzazione della procedure e il coordinamento tra medici e laboratori di citologia, microbiologia e citometria sono estremamente importanti per ottenere risultati coerenti. Futuri sviluppi: introduzione di immunofenotipi avanzati che studiano la funzionalità dei linfociti CD4 (TH1, TH2, TH17) e lo studio delle citochine per diagnosi differenziale e attività di malattia.