CITOMETRIA A FLUSSO CENNI STORICI. Tecnica nata alla fine degli anni 60, fortemente connessa alla microscopia ottica.

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1 CITOMETRIA A FLUSSO CENNI STORICI Tecnica nata alla fine degli anni 60, fortemente connessa alla microscopia ottica. Semplificando, trattasi di microscopio con sistema automatico di trasporto delle cellule e di un misuratore di luce che sostituisce l occhio umano.

2 CITOFLUORIMETRO o FACS

3 CITOMETRIA A FLUSSO PRINCIPIO Alla base di questa tecnica vi sono 2 fenomeni fisici: DIFFUSIONE A piccolo (1 ±0,1 ) e grande (90 ±12,5 ) angolo. Selezione di popolazioni cellulari e discriminazione dai detriti. FLUORESCENZA Coniugazione di molecole fluorescenti a soggetti cellulari. Identificazione migliore delle popolazioni, riconoscimento di sostanze cellulari.

4 CITOMETRIA A FLUSSO DIFFUSIONE DELLA LUCE La luce diffusa può esser considerata la sommatoria delle onde diffuse da ogni componente elementare in cui è suddivisibile l oggetto. LUCE INCIDENTE LUCE DIFFUSA OGGETTO IN ANALISI

5 CITOMETRIA A FLUSSO COMPORTAMENTO DELLA LUCE SULLE CELLULE LUCE DIFFUSA LUCE INCIDENTE LUCE TRASMESSA CELLULA

6 CITOMETRIA A FLUSSO FLUORESCENZA Potete «colorar» le cellule!

7 FILMATI INDISPENSABILI

8 SORGENTI Lampade a Mercurio, da UV a 600 nm. Gas di Argon, con emissione a 488 nm, 345 nm e 514 nm. Gas Argon Sintonizzabile, da 350 a 529 nm. Miscela di gas helio-neon, a 544 nm oppure a 633 nm. Miscela di gas argon-kripton, emissioni sintonizzabili dagli UV fino a 630 nm. Dissoluzione di Rodamina (dye laser), da 580 a 650 nm circa. Eccitata con un laser ad argon, emette radiazione laser continua, selezionabili con un collimatore.

9 CITOMETRIA A FLUSSO SORGENTI La sorgente più utilizzata è il laser ad Argon, di potenza tra i 15 mw e 5 W, costosa ed impiegabile a poche lunghezze d onda, ovvero 488 nm (blu), 345 nm e 514 nm. La sorgente al laser Ar possiede una elevata intensità, permette la focalizzazione della radiazione su di una sezione molto ridotta (dimensioni cellulari) e l eccitazione di numerosi fluorofori.

10 CAMERA DI FLUSSO Iniezione ad alta pressione: n di cellule analizzate alto. Iniezione a bassa pressione: n di cellule analizzate basso, ma in colonna stretta, per un ottimale incontro col laser

11 FILTRI Standard Long Pass Filters 520 nm Long Pass Filter Light Source Transmitted Light >520 nm Light Standard Short Pass Filters 575 nm Short Pass Filter Light Source Transmitted Light <575 nm Light

12 Converte l intensità luminosa in un segnale elettrico. Possono essere: Fototubi RIVELATORI Fotomoltiplicatore Fotodiodi Rilevazione della fluorescenza, segnale più debole rispetto alla luce diffusa frontalmente o lateralmente. Rilevazione della luce diffusa frontalmente e lateralmente.

13 CAPACITA DESCRITTIVA DELLA CITOMETRIA A FLUSSO Valore medio Western Blot Intensità della fluorescenza Citometria in flusso

14 CARATTERISTICHE DELLA CITOFLUORIMETRIA A FLUSSO VANTAGGI: - Tecnica quantitativa, molto sensibile. - Possibilità di misurare + caratteristiche di una cellula. - Dipendenza lineare della misura dalla concentrazione della sostanza esaminata. - Assenza di fotobleaching. SVANTAGGI: - Incapacità di descrizione di forme e struttura della cellula. NECESSITA : Campo di luce per l eccitazione uniforme nello spazio e nel tempo.

15 SPETTRO ELETTROMAGNETICO > E ע E = h עc/n λ = < E

16 NUOVI FLUOROFORI FLUORESCEINA Interesse per l IR

17 FLUOROFORI LA FLUORESCEINA Assorbimento Emissione 490 nm 520 nm DIANIONE MONOANIONE NEUTRA CATIONE ACIDIFICAZIONE

18 FLUOROFORI LA FLUORESCEINA La fluoresceina emette fluorescenza solo come monoanione e dianione.

19 PROLIFERAZIONE CELLULARE: CFSE STAINING Carboxyfluorescein Succinimidyl ester O CH 3 -C-O O O O-C-CH 3 Composto fortemente lipofilo. O N-O-C O O O O Passa facilmente la membrana cellulare, ma viene modificato nel citoplasma e diventa fluorescente. VERDE

20 MECCANISMO DELLA CFSE Stabile per settimane e non citotossica.

21 CAMPI DI UTILIZZO DEL CFSE Tramite citofluorimetro e CFSE si possono seguire fino a 8-10 divisioni cellulari. Utilizzabile in vitro e addirittura in vivo : - marcatura di cellule in coltura, - cellule prelevate da animali, trattate con CFSE e reinserite nel soggetto donatore.

22 CARATTERISTICHE DEL CFSE Risposta quantitativa FLUORESCENZA MEDIA 1800 Grande linearità fra la intensità di fluorescenza e la concentrazione del CFSE CFSE (micromoli)

23 % STARTING FLUORESCENCE CARATTERISTICHE DEL CFSE Intensità e stabilità DAYS AFTER CFSE LABELLING Anche dopo 6 mesi dalla colorazione le cellule indivise mantengono circa il 10% della fluorescenza originale; perfetto per esperimenti in vivo a lungo termine.

24 STUDIO DELLA PROLIFERAZIONE CELLULARE MEDIANTE CFSE Divisioni: Divisioni: Lyons and Parish, 1994, JIM, 171;131 CFSE FL-1 (Log) Durante la mitosi, ogni cellula figlia erediterà una quantità dimezzata di CFSE e la fluorescenza di conseguenza dimezzerà.

25 STUDIO DELLA PROLIFERAZIONE CELLULARE MEDIANTE CFSE Uno specifico programma si incarica di determinare quante cellule appartengano ad ogni generazione. Lee, Hodgkin and Lyons (1996), J.Exp.Med. 184; 277

26 CFSE: CONCLUSIONI Vantaggi della tecnica basata sul CFSE:

27 RIASSUMENDO Dimensione Complessità Fluorescenza Il citofluorimetro può studiare caratteristiche proprie delle cellule in esame.

28 PROCESSI STUDIATI CON L IMPIEGO DEL CITOFLORIMETRO

29 CICLO CELLULARE

30 Contenuto di DNA CICLO CELLULARE IL DNA 4N 2N G1 S G2 M G1 Fasi del ciclo cellulare

31 CICLO CELLULARE ANALISI COL CITOFLUORIMETRO Fra le prime applicazioni di citofluorimetria; ciclo cellulare studiato per quantificazione del DNA. Marcatura con Ioduro di propidio Distribuzione delle cellule nelle varie fasi. Quando è anomala (poliploidia, replicazione continua ), probabile trasformazione tumorale.

32 IODURO DI PROPIDIO Lo ioduro di propidio (PI) non può penetrare le membrane cellulari, perciò entra esclusivamente nelle cellule permeabilizzate o morte. Intercalante fluorescente del DNA, - eccitabile a 488 nm, - emissione a 625 nm. Permeabilizzazione delle cellule con soluzione di Triton X 100 e PI

33 ANALISI DEL CICLO CELLULARE CON IODURO DI PROPIDIO = n cellule Le cellule devono essere perfettamente disaggragate.

34 ESEMPIO DI ANALISI DEL CICLO CELLULARE CON IODURO DI PROPIDIO TRATTAMENTO

35 APOPTOSI

36 APOPTOSI MODIFICAZIONI MORFOLOGICHE E FUNZIONALI

37 APOPTOSI E MODIFICAZIONI DELLE DIMENSIONI CELLULARI Condensazione citoplasmatica

38 APOPTOSI E MODIFICAZIONI DI MEMBRANA Esposizione della fosfatidilserina nelle fasi precoci dell apoptosi. Perdita della integrità di membrana.

39 ANNESSINA V Proteina piccola in grado di interagire con alcune membrane in presenza di ioni calcio. Facilmente coniugabile con un fluoroforo.

40 ESEMPIO DI ANALISI DELL APOPTOSI CON ANNESSINA V E IODURO DI PROPIDIO

41 APOPTOSI E MODIFICAZIONI DI MEMBRANA ANALISI COMPLESSIVA

42 APOPTOSI E MODIFICAZIONI MITOCONDRIALI Caduta del potenziale di membrana Aumento della permeabilità Rilascio di citocromo C Attivazione delle caspasi

43 APOPTOSI E MODIFICAZIONI MITOCONDRIALI Rosso Colorante fluorescente lipofilo JC-1. Si aggrega nella membrana mitocondriale (rosso) o rimane come monomero nel citoplasma (verde). Verde A B

44 IL SEPARATORE CELLUARE (SORTER) FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting Il fluido viene frammentato in minuscole goccioline, ognuna contenente una sola cellula. Le placche di deflessione caricano le gocce che contengono cellule positive ai parametri prefissati e le indirizzano in apposite provette.

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46 DIELETTROFORESI Dielectrophoresis of Biological Cells and Single-walled Carbon Nanotubes Jaroslaw (Jarek) Wosik, Divya Padmaraj, Chinmay Darne, Wanda Zagozdozon-Wosik University of Houston University of Houston-Clear Lake ISSO Annual Report Y Formazione di dipoli in particelle dielettriche, se sottoposte a campi elettrici disomogenei. Possibilità di spostare le particelle senza toccarle!

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48 STRUMENTO PER LA SELEZIONE DI CELLULE (Silicon ) Da a cellule possono essere iniettate nel chip. Tutto avviene modificando i parametri dall esterno, senza contatto diretto con le cellule

49 STRUMENTO PER LA SELEZIONE DI CELLULE Ovviamente in sterilità.

50 STRUMENTO PER LA SELEZIONE DI CELLULE L analisi dei campioni è affidata ad un microscopio elettronico. Ad ogni cellula in analisi è assegnato un numero.

51 STRUMENTO PER LA SELEZIONE DI CELLULE Cellule positive per la grandezza impostata dall operatore evidenziati in alto. CELLULE SELEZIONABILI

52 STRUMENTO PER LA SELEZIONE DI CELLULE PRIMA e DOPO la selezione.

53 Sinora si sono utilizzate: Microscopia Marcature fluorescenti dirette o con Ab Quando entra in gioco la dielettroforesi?

54 STRUMENTO PER LA SELEZIONE DI CELLULE Tramite dielettroforesi ogni cellula può essere spostata nella zona desiderata del chip ed estratta da esso!

55 Silicon Biosystems Patented Technology: Moving DEP Cages Chip cross section Cell trapping by DEP cages generated by inphase (+) and counter phase (-) AC voltages - ndep Cage ndep Cage p. 55 Cage motion drags along trapped cell

56 Moving DEP Cages Enables Outstanding Performance in Single-Cell Sorting Recovery Parking 1. Inject, trap and image all cells 2. Move all cells of interest into Parking chamber 3. Move separately to Recovery chamber and flush Main chamber Features Multiparametric image-based sorting Single cell resolution Small cell loads Gentle on cells No a priori thresholds choose best cells Sorting based on slow kinetics (10-100s minutes) possible p. 56

57 STRUMENTO PER LA SELEZIONE DI CELLULE CELLULE ESTRATTE UNA ALLA VOLTA E PRONTE PER SUCCESSIVI ESPERIMENTI.

58 CARATTERISTICHE UNICHE Veicolazione diretta e specifica di farmaci! Cellula Liposoma

59 INTERAZIONI CELLULA-CELLULA Motion DEPArray Enables Individually Organized and Timed Cell-Cell Interactions Separation p. 59

60 RICONOSCIMENTI ALTAMENTE SPECIFICI Cell Ab-coated Microbead SPECIFIC INTERACTION NON-SPECIFIC INTERACTION

61 Corticella (Bologna) - Silicon Biosystems

62 SFRUTTARE LE CELLULE IN COLTURA PER PRODURRE PROTEINE

63 CELL FACTORY Veri e propri condominii per cellule. Affitto pagato in proteine!

64 SCHEMA DI UNA CELL FACTORY Superfici di crescita isolate a liquidi e solidi, ma non ai gas.

65 CONDIZIONI DI LAVORO Preparare la sospensione di cellule in una bottiglia con connettore (sterili) e pinze. STERILITA INDISPENSABILE Si lavora solo sotto cappa

66 FASI PRATICHE Rimuovere il tappo Inserire immediatamente il tubo di connessione

67 FASI PRATICHE Ruotare la cell factory sul lato comunicante

68 FASI PRATICHE Attendere, prego!

69 FASI PRATICHE Ruotare la cell factory sul lato non comunicante

70 FASI PRATICHE Riporre

71 FASI PRATICHE.e terminare.

72 INCUBAZIONE Chiudere con un filtro per l aria (0,2 µm)

73 ALTERNATIVA Chiudere con uno scambiatore di gas Se non serve il controllo della temperatura.

74 SVUOTARE LA CELL FACTORY Quando sostituire il medium? Dipende da: - caratteristiche della proteina secreta - Metabolismo delle cellule Per recuperare il medium con la proteina di interesse prodotta e secreta dalle cellule.

75 METABOLISMO CELLULARE

76 FINE CARRIERA PER UNA CELL FACTORY Terminato l uso, per decontaminare la Cell Factory, si raccomanda l impiego di un autoclave: > 60 min a 132 C

77 STERILIZZAZIONE Stufa a secco: 3 ore a 180 C - per vetreria Autoclave: 1 atm, 121 C 2 atm, 134 C 3 atm, 144 C Filtrazione (0,22 µm) - per filtri e soluzioni - terreni di coltura, soluzioni organiche Raggi γ - Plasticheria

78 SISTEMA ALTERNATIVO BOTTIGLIE ROTANTI PREGI DIFETTI Fasi manuali meno frequenti... ma + numerose (!) Struttura specifico

79 OK, le abbiam nutrite, cullate e coccolate.. MA SE VOLESSIMO UCCIDERLE? Od almeno render più permeabile la membrana?

80 - DETERGENTI LISI CELLULARE Se non volessimo addizionare sostanze chimiche: - CRIOFRATTURA - ULTRASUONI (Sonicazione, Sfrutta il fenomeno della cavitazione).