Workshop nazionale di aggiornamento per gli insegnanti della scuola secondaria Novembre 2005 ACGT del Sequenziamento del DNA

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1 Workshop nazionale di aggiornamento per gli insegnanti della scuola secondaria Novembre 2005 ACGT del Sequenziamento del DNA Loris Bernard DNA Sequencing Unit

2 Sommario Cosa è il DNA Il sequenziamento del DNA Il genoma umano Applicazioni del sequenziamento del DNA: mutazioni, analisi frammenti Cosa ci riserva il futuro?

3 oggi futuro

4 Friedrich Miescher, isola la nucleina 1869 Il botanico Danese Wilhelm Johannsen conia il termine GENE per descrivere l unità ereditaria di Mendel. Dal greco genos nascita Marshall Niremberg, Har Khorana, Severo Ochoa decifrano il codice genetico. We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (DNA). This structure has novel features which are considerable biological interest. Watson and Crick, Nature 1953 Vorremmo suggerire una struttura per l acido deossiribonucleico (DNA). Questa struttura ha delle nuove caratteristiche che hanno un notevole interesse biologico.

5 Essere al momento giusto nel posto giusto Biologo 25 anni Fisico 35 anni Cavendish Laboratory di Cambridge 1953

6 Ma com è fatta la molecola di DNA? 1950 Con l aiuto del collega Maurice Wilkins, ricercatori del King s College di Londra ottengono delle figure di diffrazione ai raggi x per una molecola intatta di DNA.

7 Premi Nobel 1962 insieme a Wilkins. Rosalind Franklin morì a 37 anni di cancro precedentemente. Linus Pauling: studio sulle molecole elicoidali Erwin Chargaff: Composizione del DNA, ugual numero di A-T, C-G

8 Struttura del DNA: 1 Doppia elica antiparallela Convenzione: sequenza 5-3 di un solo filamento (replicazione-trascrizione) Unità ripetuta: Nucleotide = Nucleoside + fosfato Base + Zucchero = Nucleoside Da T.Strachan et al. Genetica umana molecolare

9 Struttura del DNA: 2 dntp (deossinucleotide trifosfato) 1 molecola di zucchero 3 molecole di fosfato 1 molecola per le 4 basi azotate datp dgtp dctp dttp Da T.Strachan et al. Genetica umana molecolare.

10 Struttura del DNA: 3 Polarità del filamento di DNA Legame fosfodiesterico covalente Complementarietà dei due filamenti di DNA Legami idrogeno Da T.Strachan et al. Genetica umana molecolare

11 Il periodo post atomico 1955 A Kornberg Isola DNA polimerasi 1958 M Meselsen, F. Stahl Replicazione semiconservativa DNA

12 Replicazione del DNA Definizione di replicazione Duplicazione del materiale genetico prima della divisione di una cellula. Replicazione patrimonio genetico cellula madre=2 Cellula madre Patrimonio genetico =1 Cellule figlie Patrimonio genetico = 1

13 Replicazione del DNA DNA elicasi DNA Polimerasi dntps liberi Origini di Replicazione (Primers) Da T.Strachan et al. Genetica umana molecolare

14 I padri del sequenziamento del DNA: Premi Nobel per la chimica 1980 Gruppo americano:walter Gilbert Metodo chimico Gruppo inglese: Frederik Sanger Metodo enzimatico

15 Il Metodo di Sanger 1963

16 Definizione di sequenziamento Scoprire l ordine, la SEQUENZA, con cui i dntp sono inseriti lungo la catena polinucleotidica. Per convenzione si ordina la sequenza del DNA da 5 al 3 da sinistra a destra. Spesso si descrive un solo filamento di DNA, ma si sequenziano entrambi i filamenti che compongono la doppia elica.

17 Metodo di Sanger Si basa sulla possibilità di mimare la replicazione del DNA in vitro utilizzando tre trucchi 1. Interruzione della sintesi del DNA dopo l aggiunta di ogni dntp, creando cosi dei frammenti di lunghezza differente (per un solo nucleotide). 2. Separazione dei frammenti 3. Riconoscimento l ultimo dntp inserito

18 Metodo di Sanger 1. Interrompere la sintesi del DNA x DIDEOXYNUCLEOTIDE (ddntp) terminator DEOXYNUCLEOTIDE (dntp)

19 Metodo di Sanger 2. Separazione dei frammenti: Elettroforesi

20 Metodo di Sanger 3. Riconoscimento dell ultimo dntp inserito Radioattivo Fluorocromi

21 Il metodo di Sanger è una forma di sintesi del DNA Il DNA di cui scoprire la sequenza diventa un templato per la sintesi enzimatica di un nuovo DNA strand partendo da un attacco specifico (Primer). L enzima utilizzato è la Polimerasi I ingegnerizzata. L incorporarazione di dideoxinucleotidi blocca la sintesi del nuovo DNA strand.

22 Preparazione templato Campione biologico: Sangue Tessuto Cellule PCR Frammento di DNA inserito in un vettore Coltura in vitro Estrazione Dna Purificazioni Cycle Sequencing Elettroforesi Detection Analisi Elettroferogramma

23 Sequenziamento del DNA - Metodo di Sanger TEMPERATURA DNA DNA polimerasi dntps agttggtttaaagc tcaaccaaatttcg ddatp No elicasi ddntps Marcati in fluorescenza Primer agttgcttcgc ddgtp ddctp ddttp

24 Sequenziamento Automatico del DNA Elettroforesi su vetri Elettroforesi capillare Capillary Laser CCD Camera Buffer

25 Un Sequenziatore

26 Automated DNA Sequence Readouts

27 oggi futuro

28

29 Genoma Umano coppie di basi 170 m m gaps

30 Database Genomici

31 Genomica Anni 90 Post-Genomica 2001 Proteomica oggi futuro Studio delle diversità DNA Spazzatura Banche dati on line Farmaco genomica Personal Genome Project

32 Il DNA ripetuto: microsatelliti microsatellite (ca)n gacctaatc gacctaatc gacctaatc gacctaatc gacctaatc ca ca taccgttaa Allele 1 ca ca ca taccgttaa ca ca ca ca taccgttaa ca ca ca ca ca taccgttaa Allele 2 ca ca ca ca ca ca taccgttaa Allele 3 Allele 4 Allele 5

33 Il DNA ripetuto: microsatelliti Sample + in-lane std. 200 bp Allelic Ladder bp

34 Scena del delitto

35 Esame del Dna Sangue ritrovato sul sospetto Epitelio Victim ref. Suspect ref.

36 Test di paternita

37 Test di paternita Mother? Father Child

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39 Una famiglia normale (o il test con il giardiniere) * Father * Mother * * * * Child * *

40 Mutazioni geniche Il sole splende in cielo Il sale splende in cielo Il sole spende in cielo Il sole splende in chielo wt (normale) sostituzione delezione inserzione Sostituzione di una base in eterozigosi ATTTACCAAACATTGGA ATTTACCGAACATTGGA G

41 Mutazioni del genoma Il gatto dorme sul divano Il ratto dorme sul divano Il gatto dorme sul -ivano Il gratto dorme sul divano wt (normale) sostituzione delezione inserzione Sostituzione di una base ATTTACCAAACATTGGA ATTTACCGAACATTGGA G

42 ASPETTI GENETICI DELLA SINDROME DELL X-FRAGILE La Sindrome di Martin Bell (SMB) o dell X-fragile (FRAXA) è la piu frequente causa ereditaria di ritardo mentale. La trasmissione ereditaria e legata al cromosoma X. La sindrome e causata da una "mutazione dinamica" cosi detta in quanto caratterizzata dall instabilità di un tratto di DNA nel gene FMR1. Nel primo esone e presente una sequenza ripetuta, costituita da triplette CGG

43 SINDROME DELL X-FRAGILE LE PROTEINE NON VENGONO PRODOTTE"

44 4 basi (DNA)...7 note (Musica) lettura espressione

45 Quando il gene è mutato

46 Quanti geni possono suonano insieme?

47 GeneChip tutti i geni su un vetrino Gene ID hcg hcg hcg RefSeqs NM_ NM_ NM_ GenBank Accession L31529 AK AK02 AK BC A BC AF A hct hct hct hct13718 hct28447 hct hcp hcp hcp hcp41357hcp47862 hcp hcg hcg hcg hcg RefSeq_NM NM_ NM_ NM_ RefSeq_NP NP_ NP_ NP_ LocusLink_ID GB_Accession AK AJ BCX16478 Z19554 AF3287AK BC A Gene_Symbol SNTB1 VIM EPB41L3 Gene_Name syntrophin, beta 1 (dystr vimentin erythrocyte membrane Gene_Product basic beta 1 syntrophin vimentin erythrocyte membrane MedLine PubMed OMIM SwissProt Q13884 P08670 Q9Y2J2 UniGene Hs Hs Hs Panther_Family_Name SYNTROPHIN COILED-COIL INTERMEDIATE FILAMENT FAMILY MEMBER MERLIN/MOESIN/E ZRIN/RADIXIN- RELATED PROTEIN 4.1- Panther_Subfamily_Name BETA 1 SYNTROPHIN INTERMEDIATE FILAM RELATED Panther_Function GO_Molecular_Function GO_Biological_Process Cytoskeletal protein - > Other cytoskeletal proteins GO: :calcium ion binding GO: : calmodulin binding GO: : actin binding GO: :intracell ular signaling cascade Cytoskeletal protein - > Intermediate filament GO: :structur al constituent of cytoskeleton Cytoskeletal protein - > Other cytoskeletal proteins GO: :structu ral molecule activity GO: :actin binding GO: :molecular_functio n unknown GO: :biologi cal_process unknown GO: :cytosk eleton GO: : plasma membrane GO_Cellular_Component GO: :cytoskeletoGO: :kinesin co Cytoband 8q23-q24 10p13 18p11.32 Chromosome_Number

48 Grazie. Domande?