2D Gel Principles IEF SDS PAGE. Principi di proteomica. Elettroforesi bidimensionale e spettrometria di massa: determinazione del proteoma

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1 Principi di proteomica Elettroforesi bidimensionale e spettrometria di massa: determinazione del proteoma L elettroforesi bidimensionale separa le proteine in base alla loro carica (come nella IEF) e dimensioni (come nell SDS-PAGE). La prima dimensione (isoelettrofocalizzazione) è eseguita usando gel di poliacrilammide contenuti in stretti tubicini, in presenza di anfoliti, urea e detergente non ionico. Le proteine si separano in base al loro punto isoelettrico. Terminata la separazione, il gel viene recuperato dai tubicini, incubato in un tampone contenente SDS e fissato versando dell agarosio. Polimerizzato l agarosio, può iniziare la corsa nella seconda dimensione e la separazione avviene in base al peso molecolare delle proteine. 2D Gel Principles IEF SDS PAGE 1

2 Con questo metodo si risolvono fino a proteine diverse. La successiva digestione con tripsina, la separazione dei peptidi in HPLC e il sequenziamento con la spettrometria di massa, consentono di portare avanti lo studio del proteoma (separazione e identificazione delle proteine nei tessuti sani e/o ammalati). 2

3 Elettroforesi bidimensionale 1. Preparazione del campione 2. Prima dimensione: focalizzazione isoelettrica 3. Seconda dimensione: SDS-PAGE 4. Visualizzazione ed analisi dei risultati Procedure di analisi Image Master 2D Elite3.01 software (Amersham Bioscience) 1. Identificazione degli spot 2. Confronto tra gli spot del campione e quelli di una mappa di riferimento Vantaggi e svantaggi Buona capacità risolutiva Consente una facile quantificazione Separazione di oltre 3000 proteine Alta riproducibilità Fornisce informazioni su PM, punto Isoelettrico, modificazioni post- traduzionali Poco costosa Range di ph limitato (4-8) Proteine >150 kd non sono visibili in un gel 2D Difficoltà nel rilevare le proteine di membrana (>30% di tutte le proteine) Detezione solo delle proteine maggiormente espresse (30% in genere) L analisi richiede molto tempo 3

4 Spettrometria di massa: è una tecnica che consente di separare e classificare gli ioni gassosi (atomici o molecolari) in funzione del rapporto tra la loro massa e la loro carica (m/c). Quando una molecola, in fase vapore, viene investita da un fascio di elettroni dotati di notevole energia cinetica si può avere la sua ionizzazione a ione monopositivo. Lo ione molecolare positivo, a sua volta, può decomporsi in una serie di frammenti di massa inferiore. Tale processo di frammentazione avviene in modo caratteristico. Lo ione, o l insieme di ioni, vengono separati sfruttando un campo elettrico e/o magnetico. 4

5 Lo ione molecolare carico positivamente si frammenta (in parte), con formazione di molecole e/o radicali neutri, che non vengono rivelati dallo strumento, e di cationi e/o radicali cationi, separati e rivelati dallo spettrometro. Dal punto di vista strumentale uno spettrometro di massa è costituito da quattro parti essenziali: a)camera di introduzione e vaporizzazione campione, mantenuta sotto vuoto spinto del b) sorgente di ioni: un flusso di elettroni viene generato da un filamento incandescente ed accelerato verso la camera di ionizzazione c) analizzatore delle masse ioniche: il raggio di ioni creato nella camera di ionizzazione viene separato per mezzo del passaggio attraverso un campo elettrico e/o magnetico. d) Collettore e rivelatore ionico: i raggi ionici separati vengono raccolti e si misura la corrente ionica. 5

6 Sistemi di introduzione del campione: introduzione diretta per composti puri gassosi, liquidi o solidi gas-cromatografia cromatografia liquida Esistono numerosi sistemi di introduzione del campione. I campioni solidi volatili possono essere introdotti nella camera di ionizzazione per impatto elettronico attraverso una sonda riscaldabile a tenuta di vuoto. Prodotti non volatili (ad esempio proteine) possono essere sciolti in un solvente adatto ed analizzati con un sistema di ionizzazione a pressione ambiente. 6

7 In gas-cromatografia, l'effluente da una colonna capillare puo' essere inviato direttamente nella camera di ionizzazione per impatto elettronico. L'effluente da un sistema HPLC puo' essere inviato ad un sistema di ionizzazione chimica a pressione ambiente. Camera di ionizzazione / trasferimento ioni impatto elettronico ionizzazione chimica Ionizzazione per impatto elettronico Nella camera di ionizzazione le molecole del campione da analizzare, in fase gassosa, interagiscono con un fascio di elettroni generato da un filamento incandescente (Renio o Tugsteno) ed accelerato attraverso un potenziale regolabile dall'operatore. In termini quantomeccanici l'impatto elettronico puo' quindi promuovere eccitazioni elettroniche simili a quelle osservate nella spettroscopia UV, fino ad ottenere anche l'espulsione di un elettrone dalla molecola con formazione di uno ione radicale positivo, lo Ione Molecolare M(.+ ): e - + M ---> M.+ + 2e - 7

8 Ionizzazione Chimica Generalmente in uno spettrometro di massa la pressione e' mantenuta la piu' bassa possibile con efficienti sistemi di pompaggio ( mmhg), e reazioni bimolecolari sono estremamente improbabili. La ionizzazione chimica avviene invece se introduciamo nella camera di ionizzazione un gas reagente, ad esempio metano, in concentrazioni relativamente elevate. Lo ione molecolare del metano generato per impatto elettronico puo' reagire con l'eccesso di metano: CH 4 + e - CH e - CH 4 + CH 4.+ CH 3. + CH 5 + Il catione CH 5+, un acido forte, puo' quindi protonare con una reazione acido-base praticamente qualsiasi molecola organica. Analizzatore di massa quadrupolare, ion-trap 8

9 Filtro di massa a quadrupolo Questo analizzatore e' costituito da 4 barre metalliche parallele cui viene applicato un potenziale. Gli ioni espulsi dalla camera di ionizzazione assumono una traiettoria sinusoidale dipendente dai potenziali applicati alle barre. Solo ioni caratterizzati da un preciso rapporto massa su carica riescono ad attraversare l'analizzatore fino al collettore di ioni; gli altri vengono persi. 9

10 Si ottiene così lo spettro di massa: in ascissa si riportano i valori del numero di massa (m/z) e in ordinata una grandezza proporzionale al numero di ioni (cioè una misura quantitativa delle singole specie ioniche presenti). 10

11 MALDI TOF Voyager-DE STR (Applied Biosystem) Biological Mass Spectrometry (Istituto Scientifico San Raffaele,, Milano) Many Tools are Available to Study Proteins the Central Molecule of Life Coupled Mass Spectrometers Can Determine the Amino Acid Sequence of Protein Fragments 11

12 Biotecnologie Molecolari e Bioinformatica Lo sviluppo delle Biotecnologie ha introdotto nei settori delle moderne scienze biologiche una nuova branca di ricerca: la Bioinformatica. La Bioinformatica nasce agli inizi degli anni 80 in concomitanza con lo sviluppo dei metodi di sequenziamento rapido degli acidi nucleici Lo sviluppo delle Tecnologie del DNA ricombinante e in particolare delle Tecnologie per il sequenziamento degli acidi nucleici resero subito evidente l indispensabilitl indispensabilità degli strumenti informatici per l immagazzinamentol e la caratterizzazione dei dati acquisiti. 12

13 Numerosi sono i messaggi contenuti nelle Biosequenze che l occhio l umano difficilmente avrebbe potuto cogliere senza l ausilio l di specifici algoritmi messi a punto sulla base biologiche d ipotesi Il concomitante sviluppo delle tecnologie genomiche da una parte e delle tecnologie informatiche e delle telecomunicazioni dall altra altra ha favorito l affermarsi della Bioinformatica, che oggi sta assumendo le caratteristiche di una vera e propria disciplina Principali funzioni della Bioinformatica BANCHE DATI BIOLOGICHE Messa a punto dei sistemi idonei per collezionare e interrogare l'enorme mole di dati biologici disponibili. 13

14 Allineamenti e Multiallineamenti Analisi dei dati Ricerca di Similarità Evoluzione Molecolare, Filogenesi Genomica Comparata Predizione di Elementi regolatori (promotori, enhancer, etc.) Predizione di Geni Predizione di strutture di RNA Predizione di strutture proteiche Banche Dati Biologiche Banche Dati Primarie Banche Dati Specializzate Interoperabilità fra le Banche Dati Banche dati Primarie 14

15 Banche Dati DNA e RNA (Acidi Nucleici) Le Banche Dati di sequenze di acidi nucleici sono spesso definite Banche Dati Primarie in quanto contengono solo informazioni molto generiche ovvero quel minimo di informazione da associare alla sequenza per identificarla dal punto di vista specie-funzione. Banche Dati Primarie La prima banca di sequenze di acidi nucleici, sorta nel 1980, è l'embl Data Library costituita nell'omonimo laboratorio di Heidelberg in Germania. Successivamente è stata creata nel 1982 la Banca Dati Americana GenBank avente un formato differente da quello adottato nella banca dati EMBL e sviluppata parallelamente a quest'ultima. Solo nel 1986 è stata istituita la banca dati giapponese DDBJ coll EMBL Datalibrary Release 69 - December ,366,182 Entries 15,383,451,165 Nucleotides 87,862 Species jump 15

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17 Banche dati Specializzate Le banche dati specializzate raccolgono insiemi di dati omogenei dal punto di vista tassonomico e/o funzionale disponibili nelle Banche dati Primarie e/o in Letteratura, rivisti e annotati con informazioni di valore aggiunto Inter-operabilit operabilità fra le Banche dati Di fondamentale importanza e e introdurre nel disegno delle banche dati i meccanismi di cross-referencing referencing che consentono di navigare fra i database anche se dislocati su siti fra di loro remoti Banche dati Specializzate Numerosissime sono le banche dati specializzate disponibili da più parti e raggruppate su vari siti in categorie. Un elenco esaustivo delle banche dati specializzate si può ritrovare sul sito di Nucleic Baxevanis. Acids Research gestito da 17

18 Banche dati Specializzate di Proteine Patterns nucleotidici Patterns proteici Strutture Proteiche Cluster di Proteine Banche dati Specializzate di Geni Genomi Trascritti Pathways Metabolici Mutazioni Banche dati Specializzate di Sequenze di Proteine PIR Esempio Entry SWISSPROT Esempio Entry TREMBL = SPTREMBL + REMTREMBL SWALL = SWISSPROT + REMTREMBL 18

19 Banche dati Specializzate di Patterns Nucleotidici Eukaryotic Promoter Database EPD Esempio Entry Transcription Factors TRANSFAC Translation Terminations TransTERM Vector database VectorDB Repeats Database Repbase Banche dati Specializzate di Patterns Proteici PROSITE Pfam PRINTS SMART ProDOM TIGFRAMs ee2 es1 es3 ee4 InterPRO Esempio Entry ANALISI COMPARATIVA SIMILARITA' E OMOLOGIA Due sequenze si definiscono omologhe se derivano da una comune sequenza ancestrale in seguito ad un processo di duplicazione genica o di speciazione. 19

20 ANALISI COMPARATIVA SIMILARITA' E OMOLOGIA L omologia è un carattere qualitativo che fa riferimento ad una relazione evolutiva presente o assente e non é corretto quindi riferirsi a valori di percentuale di omologia. La similarità, invece, può essere espressa in termini quantitativi, in quanto fa riferimento al grado di similitudine che viene misurato tra due sequenze precedentemente allineate. La determinazione del grado di similarità tra due o più sequenze richiede, dunque, che le sequenze in esame vengano previamente allineate. L allineamento tra due sequenze consiste nella determinazione di una relazione tra i residui della prima sequenza con quelli della seconda in modo da rendere massimo il grado di similarità o analogamente rendere minimo il numero di differenze. In definitiva, l allineamento stabilisce una relazione biunivoca tra due sequenze (o parti di esse) in modo da minimizzare il numero di operazioni necessarie per la trasformazione di una nell altra. S A = E V D Q K I S K W D S B = E V K K I T R P K W D E V D Q K I - - S K W D E V - K K I T R P K W D 20

21 Allineamento semplice L allineamneto semplice si ottiene facendo scorrere una sequenza sull altra un nucleotide alla volta (passo 1) CGCTTCGGACGAAATCGCATCAGCATACGATCGCATGCCGGGCGGGATAAC CGAAATCGCATCAGCATACGATCGCATGC Allineamento con gaps L allineamento semplice non sempre funziona bene CGCTTCGGACGAAATCGCATCAGCATACGATCGCATGCCGGGCGGGATAAC CGCTTCGGACGAAATCGCATCA-GCATACGATCGCATGCCGGGCGGGATAA CGAAATCGCATCACGCATACGATCGCATGC A meno che le sequenze non coincidano perfettamente è molto spesso necessario introdurre gaps Per la determinazione del grado di similarità tra sequenze di proteine possono essere applicati diversi metodi basati essenzialmente sulle proprietà chimico-fisiche degli aminoacidi omologhi 21

22 Per la determinazione del grado di similarità tra sequenze di nucleotidi si utilizza essenzialmente il criterio identità non identità Principali funzioni della Bioinformatica ANALISI DEI DATI Progettazione e sviluppo di metodi matematico-statistici rivolti alla caratterizzazione funzionale e strutturale delle biosequenze. 22

23 Genetica Biochimica Cristallografia Biologia Molecolare Antropologia Immunologia B I O L O G I A Zoologia Botanica Chimica Bioinformatica Microbiologia Farmacologia Paleontologia Informatica Statistica Fisica Matematica Ingegneria BIOTECNOLOGIA La Pubblicazione del Genoma Umano ha comportato l emergere l di nuove e piu complesse problematiche e quindi una Bioinformatica Computazionale TRANSIZIONE alla dalla Biologia La conoscenza del Genoma Umano non e e la fine dell era era genomica ma solo l inizio. l 23

24 Quali gli aspetti rilevanti dell era post-genomica? 1) GLI ORGANISMI MODELLO: MAPPAGGIO E SEQUENZIAMENTO DI GENOMI IN ALTRI ORGANISMI - i dati sono disponibili nelle banche dati primarie ma anche presso i siti genomi- specifici Quali gli aspetti rilevanti dell era era post-genomica genomica? 2) STUDI DI GENOMICA FUNZIONALE Caratterizzazione funzionale dei geni Umani e degli altri organismi modello mediante lo studio del TRASCRITTOMA (DNA chips) e del PROTEOMA (Protein chips) Annotazione nelle Banche dati che evolvono in sistemi sempre piu complessi Quali gli aspetti rilevanti dell era era post-genomica? 3) GENOMICA COMPARATA Analisi comparativa fra i genomi a supporto della Genomica Funzionale 24

25 Quali gli aspetti rilevanti dell era era post-genomica genomica? 4) PROTEOMICA Studio Funzionale e Strutturale del Proteoma Quali gli aspetti rilevanti dell era era post-genomica genomica? 5) DIVERSITA UMANA SNPs: : Single Nucleotide Polymorphisms Comprensione Basi Molecolari delle Malattie Genetiche Quali gli aspetti rilevanti dell era era post-genomica genomica? 6) FARMACOGENOMICA Il termine deriva dalla fusione dei termini farmacologia e genomica Lo studio dell influenza dell eredit eredità genetica sulla risposta al farmaco da parte di ciascun individuo. 25