Microbiologia Controlli batteriologici con test del DNA e test di tossicità Lucia Bonadonna Istituto Superiore di Sanità

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1 Piani per la Sicurezza delle Acque Nuove metodologie di analisi ed inquinanti emergenti Bologna, 12 ottobre 2017 Microbiologia Controlli batteriologici con test del DNA e test di tossicità Lucia Bonadonna Istituto Superiore di Sanità

2 Acqua : elemento di facile manipolazione a livello analitico caratteristiche chimico-fisiche-microbiologiche: fonte di instabilità quali-quantitativa dei suoi costituenti microrganismi sottoposti a stress ambientale se metabolicamente attivi, possono perdere la capacità di moltiplicarsi in laboratorio, VNC se capaci di moltiplicarsi, possono perdere la capacità di esprimere caratteristiche fenotipiche (distinzione di generi e specie: in base a caratteri fenotipici)

3 Habitat % m. o. rilevabili* Acqua in rete 0,001-0,1 Acqua marina 0,001-0,1 Acqua dolce 0,25 Acque estuariali 0,1-3 Laghi mesotrofi 0,1-1 Fanghi attivi 1-15 sedimenti 0,25 suoli 0,3 *Conta diretta

4 standardizzazione delle procedure e dei metodi sono fondamentali per uniformare i criteri di valutazione della qualità Direttive Europee Metodi standardizzati (ISO, CEN, IDF, AOAC, enti di normazione nazionali.)

5 Controlli analitici: metodi colturali tradizionali VANTAGGI Bassi costi Facilità di esecuzione Risultati qualitativi e quantitativi Possibile identificazione preliminare (poi selettivi) Rilevamento anche di poche cellule in combinazione con tecniche di concentrazione (filtrazione) SVANTAGGI Lunga esecuzione e risposta (>24 ore) Impossibilità di rilevare VNC Non sempre sono analizzabili grandi volumi di acqua Parzialmente selettivi (conferma) Non informazioni sull infettività del m.o.

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7 % Market Shares Evoluzione dei metodi microbiologici colturali MPN MF Cromogeni /fluorogeni Anni

8 METODI RAPIDI attuali normative (acqua, alimenti) diversi metodi colturali rapidi sfruttano l attività metabolica di specifici enzimi cellulari batteri coliformi, Escherichia coli, enterococchi, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens, Salmonella, Candida, Staphylococcus aureus, Vibrio, uso di specifici substrati - per idrolisi enzimatica di cromofori o fluorofori - permette di selezionare i microrganismi ricercati senza conferma dell appartenenza al genere o alla specie VANTAGGI Risultati in ore (vs >24 ore) Selettivi, fatto salvo interferenze No conferma degli isolati

9 Direttive europee sulle acque UNI EN ISO UNI EN ISO UNI EN ISO

10 Rilevamento e identificazione dei microrganismi con metodi molecolari supporto complementare indispensabile, da affiancare ai metodi tradizionali basati sull analisi delle caratteristiche morfologiche e biochimiche progressi fatti nel campo hanno messo a disposizione un certo numero di tecniche che superano la necessità si coltivare i m.o. si basano sulla determinazione di geni o di frammenti di acidi nucleici tipici della specie ricercata

11 Tecniche molecolari Vantaggi Limiti Elevata sensibilità Elevata selettività Elevata specificità Possibilità di identificare m.o. non coltivabili Rapidità (3 4 ore) PCR base di partenza per altre analisi Non è garantito il rilevamento di un singolo m.o. Alcuni composti presenti nell ambiente sono inibitori Falsi positivi (contaminazioni) Nessuna informazione su infettività Nessuna informazione su vitalità Necessitano di laboratori attrezzati Personale con esperienza di biologia molecolare Costi ancora elevati

12 Metodi molecolari PCR : (Polymerase Chain Reaction) reazione di amplificazione in vitro di un segmento specifico di DNA, ottenuta per mezzo di una DNA polimerasi a partire da una coppia di primer specifici. Con questo metodo piccole quantità di DNA possono essere selettivamente moltiplicate. Obiettivo: rapida e sensibile ricerca dei m.o. mediante rilevamento diretto degli acidi nucleici Caratteristiche elevata specificità elevata sensibilità possibilità di identificare m.o. di difficile crescita e con profilo biochimico incerto

13 RT-PCR: serve a valutare l espressione di un gene tramite l amplificazione dell mrna da esso trascritto PCR COMPETITIVA: serve a valutare la concentrazione iniziale di DNA o RNA attraverso l amplificazione in contemporanea con un DNA standard aggiunto in quantità nota alla miscela di reazione. Il campione standard si amplifica con la stessa coppia di inneschi del DNA di interesse NESTED PCR: serve ad ottenere una maggiore specificità del prodotto di amplificazione utilizzando in successione due coppie di inneschi: la prima più esterna mentre la seconda più interna rispetto al segmento di DNA di interesse MULTIPLEX PCR: consente di amplificare contemporaneamente diversi segmenti dello stesso gene di interesse utilizzando coppie di inneschi differenti PCR REAL TIME: consente sia di monitorare in tempo reale l andamento della reazione di PCR utilizzando sostanze fluorescenti e sia di misurare le quantità assolute di molecole di partenza PCR ASIMMETRICA: serve ad ottenere DNA a singolo filamento utilizzando uno dei due inneschi in quantità molto ridotta rispetto all altro

14 ISO/TS 12869:2012 Water quality - Detection and quantification of Legionella spp. and/or Legionella pneumophila by concentration and genic amplification by quantitative polymerase chain reaction (qpcr)

15 FUTURO PROSSIMO The validation report will be presented to RIVM in December 2017

16 Grazie per l attenzione