Il ProGRP nella diagnosi differenziale dei tumori polmonari a piccole cellule (SCLC)

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1 Il ProGRP nella diagnosi differenziale dei tumori polmonari a piccole cellule (SCLC) Maria Teresa Sandri 1, Cristian Mauro 1, Maria Teresa Roth 1, Ermenenziana Soccio 1, Domenico Galetta 2, Davide Radice 3, Claudio Galli 4, Rita Passerini 1 1Divisione di Medicina di Laboratorio, 2 Divisione di Chirurgia Toracica, 3 Divisione di Epidemiologia e Biostatistica, Istituto Europeo di Oncologia, Milano 4Scientific Affairs, Abbott Diagnostics, Roma Il presente contributo è stato selezionato fra i poster presentati in occasione del 19 Simposio Ligand Assay 2013 per l assegnazione del premio ELAS RIASSUNTO I marcatori tumorali sono stati a lungo studiati nel carcinoma del polmone, ma al momento non vi sono marcatori specifici. Il ProGRP (Pro Gastrin-Releasing Peptide) è stato recentemente identificato come marcatore tumorale nei pazienti con microcitoma. Lo scopo di questo studio è stata la valutazione del ProGRP e del NSE (Neuron Specific Enolase) in 501 pazienti con sospetto clinico di neoplasia primitiva polmonare. Sono stati considerati cut-off di normalità i valori indicati dai produttori, rispettivamente 37,7 pg/ml per Pro-GRP, e 18,3 ng/ml per NSE. Alle soglie di normalità indicate, le sensibilità di ProGRP e NSE sono risultate di 93,5% e 51,2%. Le specificità nei confronti della patologia benigna sono risultate 43,1% per ProGRP e 98,6% per NSE. La combinazione dei due marcatori determina un incremento della sensibilità rispetto al solo ProGRP di 2,1% (da 93,5% a 95,6%) a fronte di una sostanziale immutata specificità (da 43,1% a 43,0%). In conclusione, i nostri dati mettono in evidenza una spiccata complementarietà diagnostica del ProGRP e del NSE, anche se sono necessari ulteriori studi per stabilire una soglia diagnostica ottimale. Parole chiave: ProGRP; NSE; SCLC. ABSTRACT ProGRP in the differential diagnosis of small cell lung cancer. Numerous studies have been performed to determine diagnostic utility of tumor markers in patients with lung cancer, but at present there are no well-established molecular prognostic markers consistently associated with patient survival. The ProGRP (Pro-Gastrin-Releasing Peptide) was recently identified as a tumor marker in patients with small cell lung cancer. The aim of this study was to evaluate the diagnostic usefulness of the tumor markers ProGRP and NSE (Neuron Specific Enolase) in 501 patients with clinically suspected lung cancer. The values specified by the manufacturers, 37.7 pg / ml for Pro-GRP, and 18.3 ng / ml for NSE, were considered as normal cut-off. According to these values, the sensitivity of ProGRP and NSE were 93.5% and 51.2%, respectively. The specificity were 43.1% for ProGRP and 98.6% for NSE. The combination of the two markers results in an increase in sensitivity of 2.1% (from 93.5% to 95.6%), with no significant changes in specificity (from 43.1% to 43.0%). In conclusion, our data highlight an interesting diagnostic complementary between ProGRP and NSE, although further studies are needed to establish optimal diagnostic threshold. Key-words: ProGRP; NSE; SCLC. INTRODUZIONE Nei paesi industrializzati il carcinoma del polmone è la causa principale di morte per tumore; in particolare, nella Comunità Europea rappresenta il 29% delle cause di morte per patologia neoplastica ed il 21% dei decessi per cancro negli uomini 1. La sopravvivenza è legata principalmente al tipo istologico di tumore ed allo stadio clinico: vi sono differenti tipi istologici di carcinoma polmonare raggruppati in due gruppi principali, il carcinoma a piccole cellule o microcitoma (SCLC, Small Cell Lung Cancer) e il carcinoma non a piccole cellule (NSCLC, Non-Small Cell Lung Cancer), che vengono trattati in maniera differente e hanno una diversa prognosi 2-4. Lo SCLC è responsabile del 20-25% dei tumori polmonari ed è una forma aggressiva, a crescita rapida, che spesso si presenta come malattia metastatica ai linfonodi regionali o in altri organi, ma altamente sensibile alla chemio e radioterapia. I NSCLC comprendono tre tipi istologici principali: il carcinoma a cellule squamose, che è la forma più frequente nei fumatori, l adenocarcinoma, più frequente nelle donne e nei non fumatori, e il carcinoma a grandi cellule, la cui diagnosi è purtroppo spesso tardiva. In queste neoplasie l unico approccio terapeutico è il trattamento chirurgico, mentre la radioterapia è principalmente palliativa e il ruolo della chemioterapia è ancora in discussione, dal momento che si ottengono solo modesti miglioramenti nella sopravvivenza 5,6. I marcatori tumorali nei tumori polmonari sono stati oggetto di numerosi studi, ma al momento non vi sono marcatori specifici. L antigene carcinoembrionario (CEA), l antigene del carcinoma squamo cellulare (SCC) e le citocheratine (CYFRA, TPA, TPS) sono le molecole maggiormente studiate nelle forme NSCLC, ma nessuno di questi LigandAssay 19 (2)

2 marcatori è specifico per il carcinoma del polmone, dal momento che livelli patologici si riscontrano anche in altre patologie 7,8 ; inoltre spesso è necessario associare il dosaggio di due o più molecole per raggiungere una sensibilità accettabile 9. In aggiunta, la relazione tra alcuni di questi marcatori e il tipo istologico di tumore non è chiara: i livelli di CEA sono in genere più elevati negli adenocarcinomi, mentre la concentrazione di CYFRA è superiore nelle forme squamo cellulari, ma è possibile osservare livelli elevati di questi marcatori anche in altri tipi istologici, compresi i microcitomi 7-9. L unico marcatore impiegato nelle forme NSCLC che abbia una chiara relazione con l istologia è lo SCC: la probabilità che livelli elevati di SCC indichino una forma NSCLC, soprattutto di tipo squamocellulare, è superiore al 95% 9,10. Il microcitoma (SCLC) è un tumore associato con la differenziazione neuroendocrina, quindi marcatori specifici dei tessuti neuroendocrini, come NSE, cromogranina, sinaptofisina, bombesina e la molecola di adesione delle cellule neurali (NCAM) hanno dimostrato utilità nella caratterizzazione immunoistochimica di queste neoplasie 11. Alcune di queste sostanze vengono anche rilasciate in circolo e possono quindi essere utilizzate come marcatori tumorali. NSE è il marcatore di elezione in questi tumori, sia nella diagnosi che per la prognosi ed il follow-up 12 ; la sensibilità del marcatore è però bassa (40-60%) 13, soprattutto nei pazienti con malattia limitata, e quindi il dosaggio è spesso associato a quello di altri marcatori meno specifici, come il CEA e il CYFRA Anche la specificità non è ottimale, livelli di NSE fino a due volte oltre il limite di normalità sono rilevabili nel 10-20% dei casi di NSCLC, mentre livelli superiori sono rilevabili anche in altri tumori neuroendocrini 9. Recentemente al NSE si è aggiunto un nuovo marcatore, il precursore del peptide di rilascio della gastrina, o ProGRP (Pro Gastrin-Releasing Peptide). Il GRP è l equivalente nei mammiferi della bombesina negli anfibi: si tratta di un ormone gastroenterico originariamente isolato nello stomaco di maiale; è distribuito in tutto il sistema nervoso dei mammiferi, nel tratto gastroenterico e nel tessuto polmonare Diversi studi hanno dimostrato che il GRP è prodotto dalle cellule di SCLC, ed è stato pertanto ipotizzato un suo possibile ruolo sia nella diagnosi differenziale del tumore polmonare che nel monitoraggio dei pazienti affetti da carcinoma polmonare a piccole cellule 19,20. A causa della sua breve emivita (circa 2 minuti), il GRP circolante è difficile da dosare 18 ; al contrario il suo precursore ProGRP è molto più stabile nel circolo. Alcuni studi hanno evidenziato che il ProGRP è un marcatore specifico di microcitoma Scopo del presente studio è quello di stabilire il valore aggiunto della determinazione quantitativa di ProGRP nella diagnosi differenziale di pazienti con sospetto clinico di carcinoma polmonare. PAZIENTI E METODI I pazienti con sospetto clinico di neoplasia primitiva polmonare presentatisi presso la divisione di Chirurgia Toracica dell Istituto Europeo di Oncologia tra settembre 2009 e marzo 2012 sono stati prospetticamente arruolati. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell Istituto, e ogni paziente ha firmato un consenso informato. Al momento dell arruolamento i pazienti sono stati prelevati per il dosaggio di ProGRP e NSE. Immediatamente dopo il prelievo, i campioni sono stati centrifugati a 3000 rpm per 10 minuti, quindi il siero è stato separato e stoccato a -80 C fino al momento dell esecuzione dei test. Il dosaggio dei marcatori è stato eseguito con metodica quantitativa in chemiluminescenza, utilizzando le piattaforme ARCHITECT (Abbott Diagnostics, Roma) per ProGRP e LIAISON (DiaSorin, Saluggia, VC) per NSE. Sono stati considerati cut-off di normalità i valori indicati dai produttori, rispettivamente 37,7 pg/ml per Pro-GRP, e 18,3 ng/ml per NSE. Per ProGRP è stato considerato anche un valore soglia alternativo di 100 pg/ml, in base a precedenti esperienze 24 e al fatto che i dati dell inserto indicano una scarsa frequenza di valori >100 nelle patologie benigne e nelle altre forme di patologia neoplastica polmonare. Dal momento che livelli elevati di creatinina possono interferire con i valori del ProGRP, a tutti i pazienti è stata determinata la concentrazione di questo analita, con il metodo standard in uso nel laboratorio, e valori superiori a 1,30 mg/dl hanno determinato l esclusione del paziente dallo studio. Sono inoltre stati esclusi anche i pazienti a cui era stata riscontrata la presenza di altri tumori neuroendocrini, nei quali un aumento del ProGRP poteva essere di dubbia interpretazione. Per tutti i pazienti è stata effettuata la tipizzazione istologica del tumore, parametro di riferimento per le diagnosi; erano inoltre disponibili le informazioni relative ad altre procedure diagnostiche eventualmente eseguite (radiografie, tomografia computerizzata, broncoscopia). Le caratteristiche categoriche dei pazienti (numerosità, sesso, precedenti trattamenti e stadio clinico) sono state descritte mediante conteggi; età e valori di ProGRP e NSE mediante conteggi, mediana, minimo e massimo. Il logaritmo del valore basale è stato utilizzato per la rappresentazione grafica della loro distribuzione empirica mediante box-plots. Il confronto dei valori di ProGRP e NSE tra tipi istologici è stato effettuato mediante test di Wilcoxon a due code. Sensibilità e specificità (e relativi Intervalli di Confidenza al 95%) sono state calcolate utilizzando come valori soglia di normalità 37,7 pg/ml per ProGRP e 18,3 ng/ml per NSE. L accuratezza di ProGRP e NSE nella diagnosi differenziale tra SCLC e malattia benigna o SCC e adenocarcinoma è stata stimata tramite l area sottesa (AUC) alle pertinenti curve ROC. Tutte le analisi sono state condotte mediante l uso di SAS 9.3 (NC, Cary USA). RISULTATI Nella tabella 1 sono riportate le caratteristiche dei 501 pazienti arruolati nello studio, di cui 46 con microcitoma, 258 con adenocarcinoma, 94 con carcinoma squamoso e 103 affetti da patologia benigna; 80 pazienti avevano ricevuto un trattamento chemioterapico prima del prelievo basale. La mediana e i valori minimo e massimo di ProGRP e NSE nei diversi tipi istologici di tumore sono riportati nella figura 1: ProGRP e NSE sono risultati significativamente incrementati nello SCLC sia rispetto agli altri tipi di tumore polmonare che rispetto ai casi di patologia polmonare benigna. 162 LigandAssay 19 (2) 2014

3 Tabella 1. Caratteristiche dei pazienti arruolati nello studio Stadio clinico Istologia pazienti (n) M/F mediana età (min- max) trattamento precedente SI/NO IA IB IIA IIB IIIA IIIB IV SCLC 46 35/11 65 (43-86) 17 / adenocarcinoma /90 65 (32-85) 46 / carcinoma squamoso 94 77/17 67 (42-87) 17 / patologia benigna /31 60 (20-83) / / / / / / / / Totale / (20-87) 80 / SCLC: carcinoma polmonare a piccole cellule (Small Cell Lung Cancer) Marcatore istologia n mediana min, max P-Value a ProGRP SCLC 46 86,4 20, ,5 - SCC 95 44,0 21,0-192,0 < 0,001 ADK ,1 12,8-214,5 < 0,001 NMLD ,0 17,3-1051,4 < 0,001 NSE SCLC 43 17,7 8,6-166,9 - SCC 94 11,6 4,5-41,5 < 0,001 ADK ,4 3,9-61,7 < 0,001 NMLD ,6 0,4-21,9 < 0,001 Figura 1 Valori basali di ProGRP e NSE nei diversi tipi istologici di tumore. avs SCLC SCLC: carcinoma polmonare a piccole cellule (Small Cell Lung Cancer); SCC: carcinoma squamo cellulare (Squamous Cell Carcinoma); ADK: adenocarcinoma; NMLD: malattia polmonare benigna (Non Malignant Lung Disease) LigandAssay 19 (2)

4 Tabella 2. Sensibilità (%) e Specificità (%) con IC 95% di ProGRP e NSE nello SCLC Sensibilità (IC 95% ) Specificità (IC 95% ) ProGRP a 93,5 (82,1-98,6) 43,1 (31,4-55,2) NSE b 51,2 (35,5-66,7) 98,6 (92,5-100) Valore di cut-off: a 37,7 pg/ml; b 18,3 ng/ml Figura 2 Curve ROC per ProGRP e NSE nei diversi tipi istologici di tumore A,B: ProGRP (SCLC rispettivamente vs malattia benigna e NSCLC) C,D: NSE (SCLC rispettivamente vs malattia benigna e NSCLC) La tabella 2 mostra i valori di sensibilità e specificità di ProGRP e di NSE, considerando gli SCLC rispetto alla popolazione affetta da patologie benigne: alle soglie di normalità indicate, le sensibilità di ProGRP e NSE sono risultate di 93,5% (IC 95% : 82,1-98,6%) e 51,2% (IC 95%: 35,5-66,7%). Le specificità nei confronti della patologia benigna sono risultate 43,1% (IC 95%: 31,4-55,2) per ProGRP e 98,6% (IC 95%: 92,5-100%) per NSE. La combinazione dei due marcatori (considerati come indicatori di presenza di malattia nel caso in cui almeno uno dei due abbia superato la pertinente soglia di riferimento) determina un incremento della sensibilità rispetto al solo ProGRP di 2,1% (da 93,5% a 95,6%) a fronte di una sostanziale immutata specificità (da 43,1% a 43,0%). La figura 2 mostra le curve ROC per ProGRP e NSE nella diagnosi differenziale di SCLC vs malattia benigna e SCLC vs SCC o adenocarcinoma. DISCUSSIONE Il tumore a piccole cellule del polmone rappresenta circa il 20-25% di tutti i tumori polmonari ed è una neoplasia aggressiva, che spesso si presenta già in fase avanzata con presenza di metastasi ai linfonodi regionali e in organi periferici. Il marcatore più utilizzato in questa patologia è il NSE. Studi recenti hanno però evidenziato come il ProGRP abbia prestazioni migliori sia in termini di sensibilità che di specificità. I dati emersi dal nostro studio evidenziano che il ProGRP è risultato superiore alla soglia di normalità in 43 pazienti con SCLC su 46, presentando quindi una sensibilità del 93,5%, decisamente superiore al 51,2% rilevato per NSE. E opportuno notare che la combinazione dei due marcatori, intesa come indice della presenza di malattia qualora almeno uno dei due presenti un valore superiore al valore soglia, incrementa, anche se marginalmente, la sensibilità (+2,1%), in quanto uno dei tre casi non identificati da ProGRP aveva valori patologici di NSE. Malgrado i numeri siano contenuti, questo dato è in linea con quanto pubblicato da alcuni autori che suggeriscono l uso congiunto dei due marcatori 1,25. E stato suggerito da più autori che ProGRP possa essere di aiuto nella diagnosi differenziale istologica dei tumori polmonari: diversi studi hanno tuttavia evidenziato che, accanto ad una elevata sensibilità per SCLC, il progrp può presentare valori elevati anche in pazienti con patologia benigna, come riportato da Molina et al 26. Valori elevati sono inoltre riscontrabili anche nel caso di NSCLC: l inserto del metodo indica che oltre il 23% dei pazienti con NSCLC presenta valori di ProGRP superiori a 46 pg/ml, come riportato anche da altri autori 10,26. Nei nostri pazienti, usando il cut-off proposto dalla azienda, abbiamo riscontrato valori elevati in 230 (62,0%) pazienti affetti da NSCLC su 371: tuttavia solo 5/230 presentavano un valore superiore alla soglia alternativa di 100 pg/ml 24. Un vantaggio sicuramente da non sottovalutare nell uso di ProGRP è rappresentato dal fatto che i livelli circolanti non sono dipendenti dalla presenza di emolisi, che invece è noto interferire sul dosaggio di NSE, presente in concentrazione significativa nei globuli rossi e nelle piastrine I metodi automatizzati introdotti di recente garantiscono inoltre una adeguata riproducibilità dei dati analitici, consentendo di usare e studiare il marcatore in maniera più estensiva. Un limite all utilizzo del ProGRP potrebbe invece essere rappresentato dalla presenza di insufficienza renale che ne aumenterebbe i livelli 1,26, dato però ancora molto dibattuto, in quanto non confermato in lavori più recenti 30. In conclusione, i nostri dati suggeriscono che nella valutazione iniziale delle neoplasie polmonari volta alla identificazione dei possibili casi di SCLC può essere maggiormente utile associare la determinazione dei due parametri ProGRP e NSE, che appaiono dotati di una spiccata complementarità in termini diagnostici (l uno più sensibile, l altro più specifico). Sono tuttavia necessarie altre osservazioni per la selezione di una soglia diagnostica ottimale e un analisi multiparametrica che preveda l eventuale inclusione di altri biomarcatori circolanti, allo scopo di definire un possibile algoritmo combinatorio. Ringraziamenti Il lavoro è stato realizzato grazie al supporto di Abbott Diagnostics. 164 LigandAssay 19 (2) 2014

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