Modificazioni genetiche degli animali. Embriologia

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1 Modificazioni genetiche degli animali Embriologia

2 Tre metodi principali per iniezione DNA esogeno 1. Iniezione nel pronucleo 2. Cellule staminali embrionali 3. Trasferimento nucleare In passato si usavano anche i vettori retrovirali Trasferiscono solo piccoli tratti ( 8 kb) Genoma ceppo retrovirale si può integrare nel nucleo del transgene

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4 Iniezione pronucleo Subito dopo la fecondazione pronuclei M e F distinti Iniezione di DNA pronucleo più grande

5 DNA iniettato si può integrare nel DNA del pronucleo Embrioni iniettati coltivati fino allo stadio di morula In topo: Iniettati in femmina pseudo-gravida (fecondata con maschio vasectomizzato) ovuli

6 Topo che nascerà eterozigote per il carattere Incrocio da due topi eterozigoti 25 % soggetti con gene in omozigosi Primo esempio Supertopo Palmiter 1982

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8 Vantaggi Non è necessario clonare il frammento in un vettore Svantaggi Si può solo aggiungere e non togliere Evento di integrazione è casuale e di difficile controllo Livello di espressione del gene non è del tutto ereditario Creazione di animali a mosaico

9 Cellule staminali embrionali Cellule indifferenziate isolate dalla massa cellulare della blastocisti Possono essere coltivate in vitro insieme a cellule embrionali di topo (bloccate non si dividono) Superficie idonea all adesione delle cellule ES POTENZIALITÀ DI DARE ORIGINE A TUTTI I TIPI CELULARI PRESENTI NELL ANIMALE ADULTO

10 DNA esogeno può essere immesso in cellule ES ES ricombinanti sono introdotte in una nuova blastocisti Impianto in femmina pseudo-gravida Progenie chimerica

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12 Animale chimerico verrà incrociato con soggetti normali per dare luogo a eterozigoti Vantaggi ES cells Efficienza nei meccanismi di ricombinazione omologa Possibile ottenere dei transgeni mirati

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14 Possibile ottenere dei transgeni mirati Geni deleti o modificati Attenzione Ricombinazione non-omologa Costruito vettore sequenze 5 e 3 fiancheggiano gene da eliminare clonate a dx e sx di un marcatore di selezione (resistenza antibiotici) Vettore contiene gene resistenza timidina-chinasi (tk) Frammento di DNA lineare con queste sequenze transfettato interno cellule ES Selezione cellule ES (tratt. Antibiotico) Ulteriore selezione con ganciclovir analogo sintetico 2 -deossiguanina fosforilato dalla timidina-chinasi origina analogo del dgtp inibisce polimerasi (se frammento inserito a caso la cellula muore)

15 Selezione positiva negativa Positiva: cellule che recano DNA vettoriale integrato in qualsiasi punto del genoma Negativa: contro la sequenza del DNA vettoriale integrato in siti spuri Seq. omologhe a regioni sito bersaglio Seq. resistenza G-418 Transgene Geni timidina chinasi

16 Selezione positiva negativa Trattando con G-418 sopravvivono solo cellule che hanno integrato Neo r Aggiunta composto che uccide cellule che esprimono la timidinachinasi (ganciclovir) permette di selezionare solo cellule che hanno integrato la regione d interesse Doppio crossing-over

17 Altra possibilità per verificare presenza di cellule ES Uso della PCR Vettore di indirizzamento due blocchi di DNA omologhi al sito target Uno a ciascun lato dell insieme (transgene + sequenza DNA non presente in topo)

18 Innesto complementare sequenza interna a quella DNA batterica clonata presente nel vettore Complementare a sequenza DNA che è parte cromosoma adiacente a uno dei due blocchi omologhi

19 Trasferimento nucleare DNA contenuto in ogni cellula contiene tutte informazioni Se riprogrammato può dare origine a nuovo individuo Produzione di animali clonati: produzione proteine ricombinanti conservazione di specie animali in via d estinzione

20 In estrema sintesi due passaggi: Dolly 1. Produzione di uova enucleate micromanipolazione 2. Introduzione di un nuovo nucleo Volendo però entrare nel dettaglio osserviamo come è stata prodotta Dolly Bonnie

21 Cellule donatrici: tessuto della ghiandola mammaria di pecora di 6 anni coltura cellulare primaria 90% cellule epiteliali mammella cellule mio-epiteliali e fibroblasti Induzione nelle cellule donatrici della quiescenza (non nutrendo le cellule) Cellule riceventi: oociti prelevati da pecore adulte Scottish Blackface ore dopo iniezione GnRH

22 Fusione cellulare: indotta attraverso impulsi elettrici 277 fusioni cellulari Crescita e impianto: cellule fuse coltivate in ovidutto di pecora 6 giorni di coltura 29 su embrioni trasferiti per animale 1 sola pecora ha portato a termine la gravidanza

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24 Dolly chimera? SI DNA nucleare dei nuclei immessi DNA mitocondriale oociti enucleati per la fusione Problemi?

25 Alcuni. 1. Processo inefficiente 2. Embrioni con molte anormalità morte fetale e neonatale 3. Molto spesso la prole nata da clonazione è più pesante alla nascita e dopo una gravidanza più lunga 4. Telomeri corti 5. Alterazioni del quadro di metilazione Prospettive?

26 Xenotrapianti Rigetto organi (1,3) galattosil-transferasi (GGTA1) Catalizza formazione disaccaride galattosio- (1,3)-galattosio sulla superficie delle cellule ed è alla base del rigetto Produrre animali con GGTA1 sostituito

27 TERAPIA GENICA Ipotesi di base sostituire gene malato con uno wild Gene wild produce la proteina normale e allevia sintomi malattia Applicabile (per ora) a malattie monofattoriali sindromi genetiche recessive sulle cellule germinali: proibita ovunque su cellule somatiche: si modifica solo il genoma del paziente

28 What are some recent developments in gene therapy research? Nanotechnology + gene therapy yields treatment to torpedo cancer. March, The School of Pharmacy in London is testing a treatment in mice, which delivers genes wrapped in nanoparticles to cancer cells to target and destroy hard-to-reach cancer cells. Results of world's first gene therapy for inherited blindness show sight improvement. 28 April UK researchers have announced results from the world s first clinical trial to test a revolutionary gene therapy treatment for a type of inherited blindness. The results, published today in the New England Journal of Medicine, show that the experimental treatment is safe and can improve sight. The findings are a landmark for gene therapy technology and could have a significant impact on future treatments for eye disease.