Gln-Ile-Arg-Arg-Arg-Arg-Pro-Thr-Pro-Ala-Thr Residui basici fosforilazione

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1 Proteine fosfatasi Ora che abbiamo completato la rassegna delle proteine cinasi, vediamo in dettaglio gli enzimi che determinano la rimozione del fosfato da proteine. L attività di tali enzimi è indispensabile per assicurare fenomeni ciclici di attivazione disattivazione di proteine bersaglio. Si pensi alla glicogeno fosforilasi, che da b viene portata nella forma a (attiva) mediante fosforilazione della Ser 14 della glicogeno fosforilasi. L attività fosfatasica garantisce il ritorno della a nella forma b e, pertanto, è instaurato un ciclo. Anche la p34 cdc-2 va incontro a tali meccanismi fosfo-defosfo (defosfo Tyr-15 cdc-2 attiva; forma fosfo Tyr-15 cdc-2 inattiva). Le proteine fosfatasi rappresentano una famiglia molto numerosa di proteine. (Nel 2000 si sa che nel genoma umano: circa 2000 proteine cinasi e poche proteine fosfatasi). (Nel lievito 124 cinasi e 37 fosfatasi subunità catalitica). Per razionalizzare lo studio è stato stabilito un criterio di classificazione. È stato scelto un substrato ben conosciuto: la glicogeno fosforilasi cinasi (GPK). In particolare: Proteine fosfatasi tipo 1 (PP1) sono quelle fosfatasi che determinano la rimozione idrolitica del P dalla subunità β della GPK (vedi pag.123). PP1 agiscono su β. Proteine fosfatasi tipo 2 (PP2) sono gli enzimi fosfatasi che determinano la rimozione idrolitica del P dalla subunità α della GPK. PP2 agiscono su α. Questo criterio era già stato introdotto quando si è parlato del ciclo della GPK (vedi pag.123). Sono stati inoltre identificati peptidi che sono inibitori solo delle PP1. Sono protein phosphatase inibitor 1 e protein phosphatase inibitor 2 PPI1 e PPI2 con PM e Proteine fosfatasi 1 (PP1) La PP1 è direttamente implicata nell interconversione della glicogeno fosforilasi e della glicogeno sintetasi. L attività della PP1 è direttamente collegata alla presenza o meno di inibitori proteici che possono, a loro volta, essere fosforilati o defosforilati. In particolare, solo PPI1 può essere fosforilato in una treonina dalla PKA (vedi pag.122; sequenza estremamente basica): Gln-Ile-Arg-Arg-Arg-Arg-Pro-Thr-Pro-Ala-Thr Residui basici fosforilazione PPI1, nella forma fosforilata, è attivo come inibitore. Per comprendere il significato fisiologico occorre fare il punto della situazione: L inibitore fosforilato si lega alla proteina fosfatasi 1 e la inattiva, per cui tale fosfatasi non può rimuovere il fosfato dalla Ser 14 della glicogeno fosforilasi. L AMP ciclico blocca pertanto il meccanismo di disattivazione della glicogeno fosforilasi. Quindi mentre AMPc attiva la glicogeno fosforilasi cinasi e la conseguente attivazione della fosforilasi, contemporaneamente blocca (con questo meccanismo mediato dall inibitore PPI1 fosforilato) l inattivazione dello stesso enzima, evitando un assurdo ciclo futile (quello della continua attivazione e disattivazione della glicogeno fosforilasi). E noto che l insulina promuove (indirettamente) la defosforilazione del PPI 1 ( inattivazione della glicogeno fosforilasi stop alla scissione del glicogeno proteina fosfatasi 1 attiva glicogeno sintetasi attiva). Viene quindi bloccata dall insulina una reazione catabolica, e viene promossa un azione anabolica. 158

2 Per quanto concerne la PP1 (quindi la proteina fosfatasi e non l inibitore), occorre ricordare che esiste anche una proteina accessoria G (perché legata al glicogeno), di PM descritta recentemente da Philip Cohen. Questa è di fatto un attivatore della proteina fosfatasi 1. Infatti l insulina (con un meccanismo non ancora del tutto decifrato) porta alla fosforilazione della subunità G (non chiamiamola proteina G per evitare confusione con le ben note proteine G, traduttrici del segnale), che rende la PP1 più attiva ( = defosforilazione della GS con conseguente attivazione, etc.). Inoltre la subunità G tiene la PP1 legata normalmente ai granuli di glicogeno, impedendo che questa PP1 possa agire senza controllo (questo è stato dimostrato nel muscolo scheletrico). Ne consegue che la fosforilazione della G porta al distacco della PP1 dal glicogeno: perché la PP1 è unita alla G, si stacca la G e porta con sé la PP1. Adrenalina stimolo catabolico (degradazione del glicogeno) PKA attiva fosforilazione della β della GFK e quindi attivazione GP fosforilazione dell inibitore PPI 1b e conseguente inibizione della proteina fosfatasi PP1 Proteine fosfatasi 2 (PP2) Le proteine fosfatasi 2 sono caratterizzate dall essere attive sulla subunità α della glicogeno fosforilasi cinasi. Ne sono state descritte tre (PP2A, PP2B, PP2C). Nessuna delle tre forme è inibita da inibitori proteici (abbiamo visto che PPI 1 e PPI 2 sono attivi solo su PP1). Sono noti però inibitori proteici, come l acido okadaico. Tabuliamo alcune proprietà: PP2A (o INH) PP2B PP2C Substrato: subunità α o β della GPK α α α Inibizione da PPI 1 o PPI2 no* no no Dipendenza assoluta da cationi bivalenti no Ca ++ Mg ++ Stimolazione da CaM no sì no *(ma è inibita da acido okadaico; vedi pag.132 la INH che è una PP2A) Proteina fosfatasi 2A: Si lega all antigene T piccolo del polyoma e dell SV-40. Tale T piccolo inibisce la defosforilazione di MEK ad opera di PP2A. E una famiglia numerosa. In genere è formata da 3 subunità. E anch essa implicata nel ciclo del glicogeno, anche se l attività della PP1 è in larga maggioranza nel muscolo. Nel fegato è maggiore l attività della PP2A. È implicata (nel muscolo) nella defosforilazione delle catene leggere della miosina (anche una PP1 lo è, quella di tipo C, cioè la PP1C). L acido okadaico è un importante inibitore della proteina fosfatasi 2A! E ben documentato a pag.132, dove l acido okadaico è citato come inibitore della INH (una PP2A). 159

3 Proteine Fosfatasi 2 A [da Curr. Op. in Cell Biol. 12 (2) 180 (2000)] Le forme attive delle PP2A sono eterotrimeriche, formate da una subunità catalitica (C), e due subunità regolatorie, una subunità A, che interagisce sia con C che con B, ed una subunità B, che è codificata da almeno 13 geni. La subunità A è più grande di B e C, e interagisce con la zona N terminale con B, mentre con la C- terminale interagisce con la subunità C. La subunità A è costituita da 15 ripetizioni (repeat) di 39 aminoacidi. Tale repaeat è denominato dominio HEAT ( da Huntingtin Elongation factor PP2A and Tor kinase). Questo dominio è importante. E stato trovato recentemente nell importina β. In molti tumori della pelle si trova una subunità A mutata. Sia l antigene T piccolo che il T medio possono sostituire la subunità B. Nella prostata si ha un elevata espressione del gene per la proteina pp32, che codifica per la proteina inibitrice (di PP2A): I1/PHAP-1. Nelle forme tumorali della prostata la normale pp32 non è più espressa, per essere sostituita da pp32r1 e pp32r2. Proteina fosfatasi 2B: Presenta un particolare interesse perché è stimolata da Ca ++. Quando è estratta da tessuti nervosi è un eterodimero, formato da una subunità A (61000, subunità catalitica) e da una subunità B (19000, subunità regolatoria). Da tempo era nota una proteina fosfatasi Ca-dipendente denominata Calcineurina, che è molto abbondante nell encefalo (anche 1% delle proteine totali). Quando furono meglio definiti i criteri di classificazione delle proteine fosfatasi, si scoprì che la calcineurina è la PP2B. La subunità B presenta omologia di sequenza con la calmodulina (possiede anch essa 4 EF-hand, vedi pag.45). tra l altro ha l N-terminale miristoilato, per consentire l inserimento in membrana. L omologia riguarda solo le chele che legano il calcio. La restante parte della molecola è molto diversa. Nel complesso l identità riguarda solo il 30% della sequenza. La subunità B della PP2B ha un ruolo singolare. Possiamo, in prima approssimazione, dire che è un inibitore dell attività fosfatasica. Se la subunità B è sostituita dalla CaM, si ha un forte aumento dell attività proteina fosfatasica Ca-dipendente. Stranamente la PP2B è stimolata anche dal solo Ca ++ (A µm). Con CaM saturante A 0.5 non varia, ma V max aumenta di ben 10 volte. Questo fenomeno viene interpretato nel seguente modo: la subunità B stimola la subunità catalitica A via Ca ++. Con CaM si forma un complesso ternario, con extra stimolazione da Ca ++. La subunità B sembra coinvolta nel riconoscimento della proteina substrato che deve subire la defosforilazione. Possiamo qui citare questo fenomeno comune ad altre proteine fosfatasi: esistono, per le proteine fosfatasi, delle zone che riconoscono il substrato e che, pertanto, convogliano la proteina fosfatasi su tale substrato. Tali domini sono denominati ZIP Code. Vedremo che una PTB (Proteina Tirosina Fosfatasi), la PTB1 D o Syp, contiene 2 SH2 che la spediscono sulla tirosina fosforilata. Infatti, fin tanto che la tirosina è defosforilati, i domini SH2 non la riconoscono. Quando invece la Tyr è fosforilata, essa arruola proteine tramite gli essenziali SH2 (vedi Syp a pag.117, che si lega al recettore per PDGF).(vedi inserto zip code a pag.167). 160

4 Ruolo della calcineurina (CN) nell attivazione delle cellule T: L aumento di Ca ++ determina il legame di Ca/CaM (calcio/calmodulina) alla CN (calcineurina), che si attiva e defosforila NF-AT (Nuclear Factor Activation T cells), che può trasferirsi al nucleo (nella forma defosforilati) dove, insieme ad altri fattori di trascrizione (per es. Jun e Fos), si lega a siti promotori sul DNA (per esempio al sito AP-1), con trascrizione del gene per IL- 2 (Interleuchina 2; vedi pagg.267 e 270), uno dei primi geni studiati nell attivazione delle cellule T. Ciclosporine ed attività immunosoppressiva: Le ciclosporine (vedi pag.7) sono importanti agenti immunosoppressori. Si sa che sono composti (non proteici) di basso peso molecolare che inibiscono le ciclofiline (o peptidil-prolil-cis-trans-isomerasi). Non era chiara la loro azione immunosoppressiva. Oggi [vedi TIBS 21, (11) ] è stato chiarito che la ciclosporina forma un complesso stabile con la ciclofilina che si lega alla PP2B legata, a sua volta, alla subunità B della calcineurina stessa. Si tratta quindi di un complesso quaternario che blocca la calcineurina (CN) impedendole di legare il naturale attivatore (la CaM). Non avviene pertanto l attivazione della CN e viene a mancare l essenziale defosforilazione di NF- AT, con attivazione delle cellule T (vedi schema in precedente). Proteina fosfatasi 2C: Dipende strettamente dal Mg ed anche dal Mn (è detta anche famiglia PPM). La Piruvato Deidrogenasi Fosfatasi è una PP2C. Negli Eucarioti la PP2C ribalta la cascata di proteine cinasi che si attiva in risposta a stress o elevati rapporti AMP/ATP. Defosforilazione piruvico deidrogenasi = aumento decarbossilazione ossidativa del piruvato = produzione ATP via catena respiratoria. 161

5 Proteine Tirosin Fosfatasi (PTP) Si è già detto che le proteine fosfatasi sono molto importanti: sono la naturale controparte delle proteine cinasi. Le proteine cinasi sono state classificate in Serin/Treonin cinasi, Tirosin-Cinasi e miste (si ricordi, per esempio, che MEK, detta anche MAPKK, che fosforila la MAP-cinasi sia su treonina che su tirosina in corrispondenza della sequenza TEY del subdominio VIII). Anche le proteine fosfatasi sono classificabili in tre grandi famiglie: Ser/Thr proteine fosfatasi, contraddistinte dalla sigla PP (abbiamo visto PP1 e PP2). Tyr proteine fosfatasi, che sono proteine fosfatasi specifiche per residui tirosinici di proteine (sono contraddistinte dalla sigla PTP). Proteine fosfatasi a funzione mista, nel senso che staccano con meccanismo idrolitico un residuo di acido ortofosforico sia da serin/treonine che da tirosine. Anche in questo caso possiamo citare l esempio della Cdc-25 (vedi pag.132), che stacca il fosfato sia dalla Treonina- 14 che dalla Tirosina-15 del Rossman motiv della Cdc-2. Il capitolo delle protein-tirosin fosfatasi (PTP) è della massima importanza, ed è in continuo aggiornamento. Gli studi sulle PTP iniziarono, in pratica, nel 1988, quando una PTP fu purificata da placenta umana da un gruppo di ricercatori coordinato dal Prof. Edmond H. Fischer (che conseguì, insieme ad Edwin G. Krebs, il premio Nobel nel 1992 per la Medicina e la Fisiologia). Fu una realizzazione importante, e per un certo verso inusuale, nell ambito degli enzimi che partecipano al metabolismo regolatorio. Infatti tali enzimi sono normalmente presenti in quantità molto limitata e sfuggono, in pratica, ai tentativi di purificazione ed isolamento in forma omogenea: gran parte degli enzimi che partecipano al metabolismo regolatorio e che sono stati studiati provengono, in genere, da applicazioni di tecnologie biomolecolari. Con la purificazione di una PTP (si trattava della PTP-1B), fu disponibile la sequenza di una proteina tirosina fosfatasi, e fu possibile constatare, mediante una ricerca su banche dati, che non aveva omologia di sequenza con altre ser/thr proteine fosfatasi. Oggi è anche disponibile (vedi più avanti) la struttura completa, mediante l analisi ai raggi X, della PTP-1B. Mediante la stessa ricerca su banche dati, fu possibile constatare che parte della PTP-1B aveva omologia di sequenza con una proteina transmembrana già nota: si tratta della CD45 che, intorno alla metà degli anni 70, era stata caratterizzata quale maggior componente delle glicoproteina trans-membrana di tutte le cellule della linea ematopoietica. Poiché la CD45 era posseduta solo da tali cellule, fu utilizzata come marker importante a livello clinico, anche se la sua funzione restava completamente ignota. Per esempio la diagnosi di linfomi non-differenziati passa anche attraverso la determinazione della CD45. Seguì l identificazione di altre importanti proteine fosfatasi specifiche per il residuo tirosinico e, a tutt oggi, le proteine studiate sono più di 35. K.M. Walton & J.E. Dixon, Ann. Rev. Biochem., 62, , 1993 I.S. Towbridge, J. Biol. Chem., 266, 23517, 1991 Inserto: NiceProt View of SWISS-PROT: P08575 (CD45) Le PTP presentano, in generale, un elevata attività: si ritiene che per tale elevata attività i residui tirosinici delle proteine (oggetto di fosforilazione) siano, di norma, defosforilati. Le tirosin-cinasi possono in effetti determinare una fosforilazione transiente. Struttura primaria delle Proteine Tirosin Fosfatasi e loro principali proprietà Dalla monografia di Walton & Dixon è qui sotto riportato lo schema delle PTP più studiate. Si fa riferimento alla PTP-1B con un dominio ben caratterizzato, specifico dell attività proteina tirosinfosfatasica, e, quindi, l esistenza del dominio fosfatasico accomuna tutte le proteine riportate in figura. Interessante che tale dominio PTP può essere presente anche due volte (come in CD45). La presenza di altri domini a funzione nota in varie proteine del gruppo PTP può guidare nella ricerca della funzione delle PTP stesse, funzione che, d altronde, è inscindibile dalla localizzazione subcellulare delle medesime, localizzazione ottenuta con sequenze che spediscono la PTP nel suo sito(denominate ZIP-code). Infatti la PTP-1B al C-terminale possiede una sequenza che ne giustifica l adesione al reticolo endoplasmatico, con la PTP-1B che è rivolta al citoplasma. In tale sede potrà agire su particolari substrati. La PTP-1B presenta serine fosforilabili da Cdc-2 (cioè Ser seguite immediatamente da Pro) e il suo coinvolgimento è stato dimostrato nel ciclo cellulare ed anche come mediatore dell azione dell insulina. 162

6 Altre PTP possiedono extra-domini a funzione nota. La PTP-MEG presenta, all N-terminale, un dominio simile ad altre proteine del citoscheletro. In particolare alla proteina della banda 4.1 dei globuli rossi umani. Tale 4.1 collega l actina alla rete adesa al lato interno della membrana che è formata dalle molecole di spettrina. Ma la 4.1 è omologa della talina (che a sua volta è substrato della Src-proteina cinasi; vedi pag.117). È del tutto proponibile il seguente sillogismo: come la 4.1 sta unita al citoscheletro, così può farlo anche la PTP-MEG, ed i suoi substrati andranno ricercati tra le proteine del citoscheletro stesso. La PTP-1C è stata isolata da tessuti umani e di topo: contiene il consueto dominio PTP nella parte C-terminale, mentre all N-terminale contiene due domini di tipo SH2. Questi domini Src Homology di tipo 2 sono di grande importanza. Abbiamo già visto (pag.117) che riconoscono una tirosina della stessa proteina che porta T/SH2 o di un altra proteina (per es. il recettore per il PDGF) solo se è nello stato fosforilato. Abbiamo visto che è stato anche decifrato il codice con il quale sono riconosciute tali tirosine fosforilate (sono gli amminoacidi che immediatamente seguono la tirosina). Ricordiamo che gli SH2 su proteine non si legano alla tirosina se questa non è nello stato fosforilato (in genere autofosforilato). (Già considerato a pag.160). La presenza di domini SH2 su proteine tirosin fosfatasi è estremamente pertinente alla funzione della tirosina fosfatasi stessa: infatti gli SH2 consentono di pilotare la PTP sulla tirosina da defosforilare. Esistono diverse altre proteine riconducibili alla struttura della PTP-1C, alcune delle quali partecipano allo sviluppo dell embrione della Drosophila. A pag.117 era stata introdotta la proteina Syp, che è simile alla PTP-1C, che è anche denominata PTP-1D e che ha affinità per una particolare tirosina in forma fosforilata del recettore per il PDGF. La YOP51 appartiene alla famiglia di proteine tossiche prodotte da batteri del genere Yersinia. È sorprendente che i batteri possiedano attività PTP. Infatti non è nota la presenza di tossine fosforilate nei batteri. Ma l attività enzimatica proteina tirosina fosfatasica è presente su proteine prodotte dai batteri per attaccare cellule eucariote. 163

7 Vedremo più avanti che altri batteri patogeni producono enzimi che producono AMP-ciclico (pertosse ed antrace), e ciò rientra nel medesimo tipo di strategia: l attacco alle cellule bersaglio degli organismi eucarioti mira a disarticolare qualche punto importante della fitta rete dei segnali intracellulari. Del genere Yersinia sono studiate in particolare tre specie: Yersinia pseudotuberculosis: prima specie identificata per essere produttrice di PTP Yersinia enterocolitica: produce PTP contraddistinta dalla sigla YOP51 Yersinia pestis: agente eziologico della peste bubbonica. Produce una PTP dalla sigla YOP2b La YOP51, che è stata molto studiata, possiede un attività PTP da 20 a 1000 volte più elevata di altre PTP. Alcune specie mutanti di Y. enterocolitica, con il gene codificante per YOP51 mutato in modo tale da codificare una PTP mancante dell AA essenziale nel sito attivo (una cisteina), non sono più patogene! La PTP mutata è inattiva cataliticamente ma riconosce ugualmente i substrati e resta associata ad essi. Questo è stato molto utile per identificare i substrati di questa PTP (vedi pag.165: cisteina-215 del sito attivo). VH1. E la proteina con attività PTP dal peso molecolare più basso: Da. Una parte del genoma del Vaiolo Bovino, denominata H1, codifica per la proteinavh1. Tale proteina ha la proprietà di essere, non solo fosfatasica per residui di fosfo-tirosina, ma idrolizza anche fosfoserine e fosfo-treonine. Quindi appartiene alle PTP a funzione mista. Cdc-25. Abbiamo già parlato di tale importante PTP, che in realtà fosforila anche treonina-14 oltre alla tirosina-15 della Cdc-2. Quindi, come VH1, è una PTP a funzione mista. Importante proprietà (già considerata): la cdc-25 è attiva, come fosfatasi quando è, a sua volta, fosforilata. Sino a questo punto abbiamo parlato di PTP intracellulari, o, comunque, interagenti con la membrana. Ora occupiamoci di PTP transmembrana (qualche notizia è già stata fornita per la CD45) ed è interessante esaminare la parte extra-cellulare che scatena (all interno della cellula) una serie di fenomeni mediati da attività PTP. Iniziamo dalla nota: CD45. All inizio di questo capitolo abbiamo già accennato alla CD45, che è una glicoproteina transmembrana presente in tutte le cellule ematopoietiche. Era nota da tempo, ma solo con la definizione della struttura della PTP-1B e della intrinseca attività PTP, fu possibile scoprire che la CD45, in effetti, è una PTP. È da considerarsi come prototipo delle PTP transmembrana. La CD45 era già nota come LCA (Leucocite Common Antigen) ed ha una struttura compatibile con il ruolo di ipotetico recettore. E importantissima per la risposta contro antigeni (produzione di anticorpi), sia da parte di linfociti B che T. Cellule mancanti solo di CD45 non proliferano in risposta all antigene. Lo studio dettagliato della ricerca dei substrati defosforilati dalla CD45 è in corso. Nella parte esterna alla cellula troviamo una regione N-terminale (1-177) ricca di glucidi legati all O. Dal residuo 177 al 542 c è un dominio ricco in cisteina con ben 15 siti di glicosilazione all N. La parte extracellulare della CD45 media interazioni con altre proteine di adesione (per es.cd22). Nella parte citoplasmatica, la CD45 è interessante perché presenta ben due domini di tipo PTP, ripetuti in tandem. Lo studio dettagliato della struttura primaria di tali domini ha rivelato una buona omologia con PTP-1B. Tale omologia è esaltata in un tratto di 11 residui che contengono l amminoacido del sito attivo (una cisteina, che forma un tio-estere con il gruppo fosforico del substrato, cioè con il gruppo fosforico che va incontro a rimozione). Più avanti ci occuperemo della struttura del sito attivo della PTP. HLAR. Nella ricerca di proteine simili alla CD45 (detta anche LCA, Leucocite Common Antigen), sono state identificate diverse LAR (LCA Related molecole), tra cui, nell uomo (Human), la HLAR. Questa ha un dominio extracellulare estremamente articolato. Infatti presenta (a partire dall estremità N-terminale): - 3 domini tipo Immunoglobulina: si tratta di una struttura ridondante fra le proteine di membrana. Ricordiamo i complessi maggiori di istocompatibilità di classe I e II (MHCI e MHCII), i recettori delle cellule T, le IgG e le IgM. - 9 domini di tipo III della fibronectina: li abbiamo già visti a pag.65 (il decimo residuo di tipo III della fibronectina contiene la sequenza RGD che è essenziale per il legame alle cellule, in genere alle integrine). 164

8 Tale struttura è molto simile, nel suo insieme, alle N-CAM (Neuronal Cellular Adesion Molecule) e si ritiene che la HLAR partecipi alla crescita dell assone verso le cellule bersaglio. In tale processo vedremo che è importantissimo il ruolo svolto dal Fattore di Crescita delle Cellule Nervose (NGF). Conformazione delle Proteine Tirosin Fosfatasi e sequenza del sito attivo Nel marzo del 1994 è comparsa sulla rivista Science un articolo di D. Barbord e coll. con la struttura dettagliata della PTP-1B, definita mediante cristallografia a raggi-x. Tutto lo studio è stato portato avanti su di un singolo cristallo di tale proteina, di dimensioni: 0.8x0.15x0.15 mm, che era impregnato di tungsteno di sodio. La proteina presenta diversi tratti ad α-elica e tratti a β-struttura antiparallela. La sequenza di amminoacidi tra la posizione 213 e la 223 è essenziale per l attività fosfatasica, con un residuo di cisteina che forma un tioestere fosforico. Anche un residuo basico di arginina (R) è essenziale. Conoscendo la sequenza di numerose altre PTP, è stato confermato che tale successione di 10 amminoacidi è importante, con alcuni residui invarianti. Gli amminoacidi essenziali sono i seguenti: Rossmann motiv I/V H C 215 X A G X X R 221 S/T G Gly in PTP-1B È diffusa la sigla Cx 5 R, perché, in realtà, tra C ed R possono essere compresi 5 AA (qualsiasi/x). Nella PTP-1B l AA 220 è Gly (anche in altre PTP), per cui è presente il noto Rossmann motiv Gly X Gly X X Gly che è ideale per avvolgere il gruppo fosforico. Normalmente, nelle proteine cinasi, il Rossmann motiv avvolge i tre residui fosforici dell ATP. È interessante che proteine dalla funzione antitetica (le proteine cinasi da una parte e le fosfatasi dall altra) ricorrono agli stessi elementi strutturali anche per assolvere a funzioni così diverse. È anche importante (infatti è sempre presente in PTP-1B), un residuo D (aspartico), che precede in genere la C circa 25 residui prima. Proteine di Adesione Cellulare e attività proteina-tirosin-fosfatasica [CB- 5 (12) 1368 (1995)] Le proteine d adesione cellulare (CAM vedi pag.73-74) sono importantissime per la realizzazione di tanti tipi d interazione cellula-cellula. Abbiamo visto che le CAM con caratteristiche Cadipendenti sono le CADERINE (vedi pag.73), che presentano una caratteristica struttura a moduli di tipo in line (vedi pag.2), come del resto anche le CAM stesse. Le due HLAR e DPTP 10 D, appena citate, sono CAM con, in più, la caratteristica attività Proteina Tirosin Fosfatasica (PTP). Per la DPTP10D (con 12 domini tipo Fibronectina III) è stato trovato un substrato. Si tratta della gp-150 (gp=glico proteina), che è una CAM della Drosophila, con 18 domini extracellulari ricchi di leucina (non ne abbiamo ancora parlato), ed un tratto intra-cellulare dove esistono 4 residui di tirosina fosforilabili, inseriti in sequenze identificabili da domini SH2. E stato dimostrato che la gp- 150 è substrato dell attività PTP, sia in vitro che in vivo. In questo caso ha particolare significato la presenza ridondante di domini ricchi di leucina della gp-150. Tali domini sono stati trovati in numerose altre proteine della Drosophila, che controllano importanti processi cellulari, come l aggregazione dei fotorecettori, dei neuroni motori, dove le interazioni omofiliche (vedi pag.73) tra i domini ricchi di leucina potrebbero coinvolgere la attività PTP ad esse collegate. Citiamo un altra importante CAM con attività PTP: PTPµ: è una CAM che inizia, nella zona extra-cellulare, con un dominio particolare (MAM- Meprin/a5/µ), seguito dal classico dominio tipo immunoglobulina -uno solo- seguito, a sua volta, da 4 residui Fibronectina di tipo III (FN3) in successione. Esiste il tratto transmembrana, quindi, nella parte citosolubile, ritroviamo 2 domini Proteina Tirosin Fosfatasi (PTP). E un caso un po analogo alla già citata HLAR (vedi pag.164). Le interazioni omofiliche tra le zone extracellulari di PTPµ, e la zona extracellulare di alcuni tipi di caderine, determina de-fosforilazione di tirosine delle caderine stesse. 165

9 Infatti esiste una caderina caratterizzata dalla presenza di una tirosina fosforilabile nel dominio intra-cellulare. Tale caderina è normalmente legata, attraverso le catenine, ai microfilamenti di actina del citoscheletro (vedi pag.73). Quindi le interazioni omofiliche tra domini extra-cellulari di PTPµ e domini extracellulari delle caderine determina la veicolazione dell attività PTP sulla tirosina che deve essere defosforilata. E una forma di zip code. 166

10 Inserto: ZIP - code Il termine zip-code indica un codice, ovvero un particolare dominio proteico, che indirizza una proteina, che contiene tale dominio, verso particolari destinazioni cellulari. Le PTP (proteine-tirosinfosfatasi) presentano una molteplicità di zip-code. Ricordiamoci, tuttavia, di non confondere questi zip-code con i leucine-zipper (anch essi contraddistinti dalla sigla ZIP; sono detti anche cerniere di leucina) presenti in diversi fattori di trascrizione (vedi pag.242; per esempio CREB, Cyclic AMP Element Binding, che è una proteina b-zip; b=basica). Gli zip-code di PTP comprendono: 1) domini di associazione a membrana; 2) domini di localizzazione nucleare; 3) domini SH2 (Src Homology di tipo 2) 4) domini di associazione al citoscheletro. Nella figura di fondo pagina (riprodotta da TIBS 19-4, 153, aprile 94) sono indicate alcune di queste destinazioni. Situazione 1): esistono le proteine tirosin cinasi di adesioni focali (FAK), che possono trovarsi in competizione con una PTP (indicata con?), per esempio la PTP1. Situazione 2): nel nucleo è possibile trovare una DPTP 61 F [p61/62n, che nasce per splicing alternativo di un altra, la DPTP 61 F (p61/62m)].la prima, contraddistinta da n finale- n=nucleo, ha una sequenza di 11 AA idrofilici che assomiglia alla sequenza di destinazione al nucleo. Infatti è KRRRGNRLKKSKTK (in grassetto sono indicati gli AA nettamente basici K-lisina o R-arginina). Vedi anche indicazioni di pag.6, ovvero alcune sequenze altamente basiche determinano l importazione nel nucleo delle proteine che le contengono. Situazione 3): sempre nell ambito di associazione a membrana, la PTP2 può legarsi ad un recettore per fattore di crescita (GFR-Growth Factor Receptor), fosforilato su tirosina, tramite il proprio SH2; vedi pag.163 caso comune a PTP1D o Syp. Situazione 4): è possibile un legame alla matrice, come PTPH1, ma anche all ER, oppure alla matrice mitocondriale. Infatti esiste la sopra citata DPTP 61F8p61/62m - m=matrice - che al posto degli 11 AA sopra citati presenta la sequenza KRRSLLTYIAAGVVVGICAYAYTKLG, che è tipicamente idrofobica, e adatta ad attraversare la membrana ER ed anche quella mitocondriale interna. 167

11 Interazione: Caderine - Tirosin Cinasi - Tirosin Fosfatasi [da Curr.Opin.Cell.Biol. 11 (5) 554 (ott.1999)] In relazione alle molecole d adesione (CAM), che costituiscono una famiglia assai articolata, possiamo oggi comprendere nei particolari il funzionamento delle caderine, che rappresentano certamente una classe importante di CAM. Ricordiamo che le caderine sono CAM calciodipendenti. Possiamo far riferimento a quanto già trattato a pag.73 per approfondirlo con la seguente figura. In alto è schematizzata la struttura primaria delle caderine, con i seguenti domini (cominciando da sinistra): CYTO - è il dominio citoplasmatico, che contiene, a sua volta, le zone di legame a β-catenine o alla plakoglobina (β-cat/plak), che a sua volta lega la α-catenina. Quest ultima lega, ancora, l actina o direttamente, oppure attraverso l interposizione di α-actinina, vinculina e altre (vedi figura di pagina seguente). Tutte queste proteine, nel loro insieme, costituiscono il CAC (Cadherin- Associated Complex). Il dominio CYTO comprende anche la zona di legame ad una famiglia di catenine, le p120. Queste ultime furono isolate inizialmente come substrati dell azione della tirosin-cinasi Src. In particolare la proteina p120 ctn (la più nota) contiene 10 copie del dominio armadillo (formato da 42 amminoacidi). La p120 è fosforilabile e diversi riscontri sperimentali depongono a favore di un suo stato de-fosforilato e coesivo in antitesi ad uno stato fosforilato e dissociato, per il contributo (ovvio) della repulsione elettrostatica tra cariche negative portate dal gruppo fosforico. TM - è il tratto transmembrana formato in prevalenza da amminoacidi idrofobici. C5, C4, C3, C2, C1 - sono i domini costituenti l ecto-domain, che legano (non sempre) calcio. L ultimo di questi domini, il C1, vicino all N-terminale, presenta la sequenza HAV tipica delle caderine (vedi figura sopra e pag.73) che è importante per i legami di tipo omofilico. Nella figura (sopra) sono illustrati i domini leganti calcio, ed il calcio stesso. 168

12 E altresì illustrata l interazione di tipo cis, tra caderine cioè della stessa cellula, che si realizza alle interconnessioni tra C2 e C1. Il Calcio determina una maggiore rigidità della catena e consente lo stabilirsi del legame cis. Importanti sono i legami trans (tra caderine di cellule diverse) che sono promossi da un inserimento del triptofano-2 (W2 - secondo amminoacido della catenina, quindi praticamente all N-terminale), che interagisce con l alanina-80, che è al centro della terna HAV. La struttura HAV-W è essenziale per le dimerizzazioni di tipo trans, ma non per quelle di tipo cis. Completiamo ora l analisi di quanto accade nella zona citosolica, che interessa per le connessioni al citoscheletro, e per comprendere il ruolo centrale delle tirosin-cinasi (come Src e, più in generale le RTK- attività tirosin cinasica associata a recettori), nonché delle proteine-tirosin-fosfatasi (PTP) che sono trattate a pag.162 e seguenti. L aggregato che si forma nella parte citosolica è denominato CAC (Cadherin-Associated-Complex) e alla sua formazione contribuiscono una molteplicità di macromolecole. Comunque nella figura qui sotto sono illustrate la β-catenina e la Plakoglobina, fosforilabili in serina (S), tirosina (Y) e treonina (T). Ma l attività più importante è la fosforilazione a carico delle tirosine. La fosforilazione, in generale, dissocia la β-catenina e la Plakoglobina dal CAC, annullando l adesione. Infatti l esposizione ad un certo numero di fattori di crescita (EGF, TGF-β, PDGF, CSF1, HGF) si traduce nella fosforilazione di tirosine diretta (ad opera di recettori con attività RTK) oppure indiretta (attraverso attività tirosin cinasica non-recettoriale come src). Al contrario l azione di tirosin-fosfatasi (PTP) come PTPµ (vedi figura b di pag.166) indirizzate alle tirosine fosforilate dai propri zip-code (il dominio PTP stesso è uno zip-code) porta alla defosforilazione di proteine della famiglia armadillo, ed al conseguente aumento di coesività. CAC: Caderin Associated Complex 169

13 Proteine fosfatasi a funzione mista Con quest approfondimento delle proteine tirosin fosfatasi, possiamo riprendere il discorso con la MAP-cinasi fosfatasi, che era stata introdotta a pag.151. In particolare era prevista, per tale fosfatasi, la funzione mista, cioè la possibilità di idrolizzare sia tirosine che serine/treonine. Diverse fosfatasi con tali proprietà sono state sequenziale, ed ora possiamo confrontare la loro sequenza. Riassumiamo brevemente una serie di esperimenti, condotti peraltro in laboratori differenti: 1) Se fibroblasti NIH 3T3 sono stimolati da siero, si ha una rapida attivazione (5 minuti circa) della MAP-cinasi, ma la sua attività comincia a scendere dopo circa 60 minuti. È stato accertato che l espressione della doppia fosfatasi 3CH134 coincide, nel tempo, con la defosforilazione ed in attivazione della MAP-cinasi. Inoltre in cellule di scimmia 2) COS trasfettate ed arricchite con la doppia fosfatasi 3CH134 si aveva selettivo blocco dell attivazione della MAP-cinasi. 3) Anche nel budding yeast Saccharomyces cerevisiae è stata studiata e sequenziata una MSG5 con analoghe proprietà di doppia attività protein-fosfatasica. È stata studiata anche la PAC1, che è presente nei Mammiferi ed è omologa della 3CH134. Una doppia proteina fosfatasi, già presa in considerazione, è la Cdc-25, che rimuove il fosfato dai residui Thr-14 e Tyr-15 inseriti nel Rossmann motiv della Cdc-2. Ricordiamo (vedi pag.152) che si tratta di un subdominio (il I) diverso dal subdominio (l VIII) fosforilato nelle MAP-cinasi, doppiamente defosforilati dalle MAP-cinasi fosfatasi. Nella seguente figura (da Current Biology, 4, 647, 1994), è riportata la sequenza amminoacidica nei dintorni del sito attivo di diverse PTP, sia solo tirosin fosfatasi che con doppia affinità. La PTP-1B è stata studiata per prima. La VHI (coinvolta nel vaiolo bovino) ha doppia specificità. La CL100 e la MAP-cinasi fosfatasi umana, omologa della 3CH134 espressa dal topo (ambedue presentano doppia specificità). La Pac1 è presente nei mammiferi ed è omologa delle due precedenti. La MSG25 è del lievito, con doppia specificità. La Cdc-25 umana è nota. Si può constatare che non esistono elementi strutturali di tale breve tratto di sequenza per prevedere la semplice o doppia specificità come proteina fosfatasi. Possiamo concludere che tale sequenza è caratteristica di tirosin proteine fosfatasi, che, in alcuni casi, possono essere anche tirosina e serina fosfatasi. Si può constatare la sequenza Cx 5 R caratteristica di tutte le PTP. 170

14 Enzimi che producono AMPciclico e GMPciclico Abbiamo completato lo studio delle proteine cinasi e delle proteine fosfatasi, che sovente partecipano a reazioni in sequenza o cascata, dalla formulazione anche molto complessa. Nel flusso di informazioni che lega un evento extracellulare ad un processo endocellulare, in genere metabolico (per esempio sintesi o degradazione di glicogeno), troviamo gli importanti nucleotidi ciclici AMP C e GMP C, che possono stimolare specifiche proteine cinasi. Vediamo in dettaglio i sistemi enzimatici implicati nella sintesi di tali importanti secondi messaggeri. Adenilato ciclasi (A.C.) Ne sono conosciute 9 forme. Le più studiate sono 2: Adenilato ciclasi calmodulina indipendente. Adenilato ciclasi calmodulina dipendente. Occupiamoci prima della CaM dipendente, che è stata clonata da cdna. È nota altresì la sequenza ricavata direttamente dall analisi di alcuni peptidi, che risultano sottolineati a pag.172. Infatti l Adenilato Ciclasi CaM dipendente è stata purificata con il metodo della cromatografia per affinità, con colonne cromatografiche portanti calmodulina o forscolina (vedi dopo). Facilmente la A.C. purificata porta a sé strettamente legata la subunità α della proteina-g stimolatoria. È stata verificata, quindi, una perfetta corrispondenza fra una parte della proteina effettivamente estratta da cervello bovino ed il gene che codifica per l Adenilato Ciclasi (A.C.) CaM dipendente. È interessante che non presenta omologia di sequenza con l A.C. CaM indipendente, quindi sono due enzimi distinti. In riferimento, quindi, alla struttura primaria putativa (pag.172) vediamo di estrapolare alcune proprietà dell A.C. CaM dipendente. È formata da 1134 AA (P.M Da circa) e contiene 12 tratti idrofobici transmembrana (vedi schema), che sono ripartiti in 2 gruppi da 6 ciascuno. I due gruppi di 6 tratti sono separati da un dominio idrofilico di P.M Da (dall AA 236 all AA 613). Al C-terminale esiste un altra zona idrofilia (36 KDa). Anche l ammino-terminale è idrofilico. Queste tre zone sono coinvolte nel legame con l ATP ed il suo processamento ad AMP ciclico. Poiché la proteina lega ATP, dovrà contenere alcuni elementi strutturali comuni alle proteine cinasi (vedi classificazione HQH pag.82 e seguenti). Analizziamo infatti i residui amminoacidici presenti da 16 a 21 e osserviamo la curiosità dovuta a ben 7 glicine in successione che precedono: Gly 16 Ala 17 Gly 18 Glu 19 Ser 20 Gly 21 Sono evidenziati i residui di glicina, che si susseguono secondo il classico Rossmann motiv Gly- X-Gly-X-X-Gly, e quindi questa è, teoricamente, la zona destinata al legame con l ATP. From Krupinsky et all. Science 244, 1558,

15 172

16 Contiene un sito di glicosilazione extracellulare. Infatti, in posizione 706 esiste l asparagina (N) seguita, in seconda posizione, dalla serina. Trattasi della tipica sequenza Asn-X-Ser, sito di glicosilazione all N (vedi pag.28). Contiene due serine fosforilabili. Infatti la Ser-481 è seguita, in seconda posizione, da Arg-Arg- Lys, e questo è un requisito essenziale per la fosforilabilità da PKC (in realtà possono essere presenti anche AA basici prima del residuo fosforilabile). Infatti una A.C. da globuli rossi di rana, di P.M è fosforilata da PKC. Anche la Ser-1035 è fosforilabile da PKA (è preceduta, in seconda e terza posizione, da Arg-Arg). Queste fosforilazioni sono previste come inibizioni a feed-back. La PKA è attivata, per definizione, da AMP C e può essere regolata dall inibizione dell enzima che produce l AMP ciclico stesso. Anche il recettore β-adrenergico è estensivamente fosforilato e inattivato da proteine cinasi. Contiene un dominio legante CaM al C-terminale. È situato tra la Valina-987 e la Glicina Possiede proprietà comuni ad altri domini leganti CaM di altre proteine. Come tale, l A.C. CaM dipendente sarà proteolizzata dalla calpaina (questo è un tema ricorrente di tutte le proteine che legano calmodulina; per es.: Fosfodiesterasi per AMP C, Ca-ATPasi di membrane plasmatiche, Calcineurina, Proteina Cinasi CaM dipendente). Nel complesso esistono strette omologie con altre GuanilatoCiclasi, mentre esistono nette differenze tra A.C. CaM dipendenti e indipendenti. La maggior parte delle Adenilato Ciclasi sono attivate da concentrazioni micro-molari del diterpene Forscolina (isolato dalla pianta Coleus forskohlii). Infatti, come è stato detto all inizio del paragrafo, la cromatografia per affinità con forscolina consente la purificazione dell A.C. CaM dipendente dal cervello bovino. L Adenilato Ciclasi CaM indipendente è stata clonata ed è formata da 834 AA (P.M da), quindi ha un P.M. inferiore alla CaM dipendente. Non presenta omologie con la CaM dipendente. Funzioni dell Adenilato Ciclasi CaM dipendente È alquanto incomprensibile l attivabilità da CaM dell A.C., in relazione soprattutto al fatto che la CaM è anche un noto attivatore dell enzima Fosfodiesterasi, l enzima cioè che scinde l AMP C (ricordiamo che la CaM fu scoperta per tale proprietà, ed ancora oggi viene denominata attivatore della fosfodiesterasi ). Quindi la CaM, contemporaneamente, attiva sia l enzima che produce l AMP C che l enzima che lo scinde (cioè la fosfodiesterasi) e quindi s instaurerebbe un ciclo futile. In realtà l A.C. non può essere attivata dalla sola CaM e, come è oggi ben noto (ritorneremo sull argomento), svolgono un ruolo importante le proteine-g, cioè attivate da GTP, che sono classici trasduttori del segnale. Interessante è la struttura transmembrana dell A.C., tipica di una proteina che forma canali. È particolarmente marcata la somiglianza tra A.C. e la proteina multidrug resistence, che vedremo più avanti. Può comunque essere ipotizzato che tale A.C. sia anche implicata nell esportazione di AMP C dalle cellule, come nel Dictyostelum discoideum, che lo sintetizza e lo esporta per controllare la chemiotassi, l aggregazione e la differenziazione. AMP ciclico in Eucarioti semplici e in Procarioti Negli organismi superiori, l AMP C media, come abbiamo già visto, segnali intracellulari: attiva una PKA. Nel Dictyostelium discoideum (D.D.), media invece segnali intercellulari ed è prodotto come segnale di carenza di nutrienti e promuove l aggregazione di cellule. In situazione d emergenza, il D.D. produce nel mezzo AMP C, che è percepito da altre cellule le quali, per chemiotassi, si aggregano alla cellula fondatrice e sono, quindi, da questa reclutate. Il D.D. è un eucariote semplice e, quando i nutrienti sono abbondanti, il D.D. esiste come cellula indipendente. 173

17 D altra parte abbiamo visto che, in procarioti, l AMP C si lega alla proteina CAP (vedi pag.88), che si lega al DNA in corrispondenza di certi siti promotori, con conseguente trascrizione di geni che consentono l utilizzo di nutrienti alternativi (per esempio lattosio) ad un nutriente di base (per esempio glucosio). Doppia azione della CaM su Adenilato Ciclasi (A.C.) e Fosfodiesterasi (PDE) Effetto paradosso della Calmodulina: Attiva l Adenilato Ciclasi (che produce AMP C ) Attiva la Fosfodiesterasi (PDE) che idrolizza l AMP C Potrebbe essere assicurata la transitorietà nella formazione di AMP C Potrebbe, l aumento di calcio, smorzare i segnali da AMP C per far risaltare i segnali Ca dipendenti 174

18 Inserto: generalità su tossine batteriche Tossine batteriche Esotossine Endotossine L I P O P O L I S A C C A R I D E polisaccaride lipide A Per es.: fattore ADP-ribosilante del Colera e Adenilato ciclasi di Pertosse e Antrace (vedi pag.176) Botulismo - determina l antigenicità (catena O- specifica) - segmento interno - segmento interno con Kdo - causa di tutti gli effetti nocivi delle endotossine. Per esempio E. coli e Salmonella typhimurium possiedono lo stesso lipide A. da Le Scienze 290, 34, (1992) 175

19 Adenilato ciclasi tossine Già avevamo parlato di questa tossina (vedi pag.88). Analizziamo ora l Adenilato ciclasi prodotta dal batterio Bordetella pertussis (che causa la pertosse) e dal Bacillus anthracis (che causa il carbonchio). La Bordetella pertussis produce una miscela di tossine, tra cui la Pertussis Toxin propriamente detta (che è un enzima che ADP-ribosila le subunità α delle G i ). Contiene inoltre un insolita Adenilato ciclasi, che è CaM stimolata (decine di volte). Il batterio non possiede Calmodulina. Viceversa questa Adenilato Ciclasi (A.C.) penetra facilmente nelle cellule ospiti e in esse trova la CaM, che la stimola. La sovrapproduzione di AMP C blocca la chemiotassi, la fagocitosi dei macrofagi. La malattia è caratterizzata da assenza di febbre (perché i neutrofili non rispondono) e da elevata incidenza di batteri della polmonite, grazie alla scarsa risposta immunitaria. Esiste una prova di questo comportamento. Un mutante di Bordetella pertussis, mancante di A.C. è non patologico. Questa A.C. produce molto AMP C, avendo un elevato numero di turnover. Qui a lato è riportato lo schema della struttura primaria dell A.C. di Bordetella pertussis. Nei primi 450 AA c è l attività A.C., più, molto importante, un dominio legante CaM. Proseguendo, dall AA 450 al 1600, abbiamo una catena polipeptidica che ha omologia di sequenza con l α-emolisina di E.coli (è una esotossina che lisa i globuli rossi). L omologia è particolarmente pronunciata tra i residui 640 e 910 (zona a tratteggio orizzontale). Inoltre, tra l AA 1000 e 1600, esiste una sequenza Gly Gly Asp Gly Asp Asp Thr Leu X (9 AA) ripetuta un numero rilevante di volte (sempre omologa con l α-emolisina). Essendo nota la sequenza putativa è possibile costruire un grafico di idrofobicità e sono individuabili 4 tratti idrofobici. Se ne ipotizza la partecipazione al processo di penetrazione della proteina nella cellula ospite. Se si opera la delezione indicata in figura, non si ha più penetrazione all interno della cellula ospite. È cruciale la capacità di essere attivata da CaM. Infatti la CaM è una proteina presente in tutte le cellule eucariote con una struttura molto ben conservata. Quindi CaM è un ottimo marker endocellulare di qualsiasi cellula eucariotica. Pertanto l A.C., una volta penetrata all interno di una cellula, viene gradualmente attivata. Tale A.C. ha un numero di turnover molto più alto dell A.C. endogena, e si ha sovrapproduzione di AMP C, con sbilanciamento di delicati cicli regolatori. Anche Bacillus anthracis genera una tossina del tutto analoga a quella di Bordetella pertussis. Anch essa contiene all N-terminale l attività A.C. stimolata da CaM. Entra nelle cellule per endocitosi. 176

20 From E.Hanski TIBS (1989) Qui a lato è riprodotto lo schema d azione di questa tossina. Le parti (a) e (b) non richiedono commenti. (c): per l inattivazione si è visto che è strettamente ATP dipendente. È ipotizzabile anche l intervento delle calpaine endocellulari (come meccanismo d azione comune a tutte le proteine che legano CaM; vedi pag.44). Essendo ATP-dipendente, la proteolisi potrebbe essere dipendente da ubiquitina (vedi pag.36). Si può constatare che questo meccanismo d azione di una tossina batterica ha analogie di funzionamento con il batterio patogeno Yersinia pestis (vedi pag.164), che introduceva nell organismo infettato una potente attività proteina tirosin fosfatasica (PTP). 177

21 Il GMPciclico (GMP C ) Qui sotto è riportata la struttura dell AMP ciclico e del GMP ciclico. Trattasi di esteri fosforici ciclici, che per semplice idrolisi possono convertirsi nei comuni acidi adenilici (AMP) o guanilici (GMP). AMPc GMPc Del ruolo dell AMP C quale secondo messaggero abbiamo già parlato. Dell esistenza di un GMP C si è cominciato a parlare solo in tempi più recenti, anche perché la sua concentrazione, in generale, nelle cellule eucariote è di gran lunga inferiore all AMP C. L AMP C, in genere, è presente a concentrazioni intorno all 1 micromolare, mentre il GMP C oscilla intorno allo micromolare. Il GMP C fu scoperto come importante componente del processo di fototrasduzione intorno alla metà degli anni 80 (vedi inserto pag.292). Intorno alla metà degli anni 80, furono scoperti gli importanti fattori natriuretici (ormoni), che inducono la produzione di GMP C intracellulari. Tutto lascia intendere che il GMP C sia implicato in una varietà di altri importanti processi cellulari. Vediamo ora le proprietà degli enzimi che lo producono (guanilato ciclasi) che, a differenza delle adenilato ciclasi, sono note in più di due forme (ne descriveremo 4). Guanilato ciclasi dipendente da calcio recoverina Cominciamo da questa forma perché connessa al processo di foto-trasduzione nei vertebrati, dove il ruolo del GMP C è stato completamente definito. Vedremo in dettaglio più avanti tutto il processo. Ora ricordiamo solo che il GMP C tiene aperti i canali per il sodio della membrana del segmento esterno dei bastoncelli. Uno stimolo luminoso porta ad un calo massiccio del GMP C con conseguente chiusura dei canali stessi. Nella fase di riposo, il GMP C deve essere risintetizzato dalla guanilato ciclasi (G.C.), che è calcio dipendente. Si pensava (in analogia con quanto succede con l Adenilato Ciclasi) che anche la G.C. dipendesse dalla calmodulina. Invece è stato scoperto da Stryer che è coinvolta una proteina della famiglia della CaM, nota con il nome di recoverina. Tale proteina assicura una stimolazione dell attività G.C. quando il calcio intracellulari (che pure è molto basso, circa µm) scende ulteriormente. È stato accettato uno schema di funzionamento del tipo: 178

22 La Recoverina (con P.M : possiede 4 EF hand come la CaM) a calcio elevato lo lega, secondo un equilibrio di associazione-dissociazione e, in tale forma, si lega alla G.C., disattivandola. Se il calcio scende, la recoverina perderà lo ione calcio e, nella forma che non lega calcio, si dissocerà da G.C., lasciandola libera di esprimere attività catalitica. Premettiamo che questo è soltanto un modello. È accertato che sono coinvolti anche altri elementi ancora da identificare, ma, nelle linee generali, è accettato. Interessante che la recoverina è un po la controparte della calmodulina. In genere, la calmodulina attiva gli enzimi ai quali si lega (vedi calcio ATPasi e Adenilato Ciclasi). Qui la recoverina disattiva l enzima al quale si lega. La recoverina è stata scoperta e clonata nel 1991 da Lubert Stryer ed è presente nei bastoncelli. Nei coni è contenuta una proteina omologa (la visinina), con struttura leggermente diversa, codificata da un gene distinto da quello che codifica per la recoverina, ma con funzioni sostanzialmente analoghe alla recoverina. Nei bastoncelli potrebbe essere implicata anche un altra Guanilato Ciclasi, del tipo solubile e stimolata da ossido d azoto (vedi più avanti). La G.C. dei bastoncelli è legata all assonema che sta alla base del segmento esterno. Guanilato ciclasi attivata da fattori natriuretici L Atrial Natriuretic Peptide (ANP) è una proteina ormonale secreta da diversi tipi cellulari. È prodotta dai miociti atriali in situazione di sovraccarico per il muscolo cardiaco. L ANP viene immesso in circolo e, come tutti gli ormoni, interagisce con tutte le cellule di un organismo superiore. In particolare, nel rene, determina un aumentata estrusione di ione sodio, con conseguente calo di pressione. L ANP possiede anche proprietà rilassanti sul muscolo liscio (come l ossido di azoto; vedi più avanti). In realtà, non esiste un unico ANP (ne sono stati descritti tre: ANP A, B, C). Gli ANP si legano a specifici recettori delle cellule sulle quali agiscono inducendo, in generale, la sintesi di GMP C all interno della cellula. Quindi tali recettori sono, ad un tempo, recettori propriamente detti ed enzimi produttori del secondo messaggero. Per la sintesi di AMP C, invece, esiste il recettore che si lega all ormone (una proteina con la sua identità), il trasduttore del segnale (la proteina-g), e l enzima (Adenilato Ciclasi), che produce il secondo messaggero. Per i fattori natriuretici, invece, in una sola proteina transmembrana sono comprese tutte e tre le funzioni. Infatti non avviene una traduzione del segnale come per le proteine-g, ma i recettori per i fattori natriuretici legano anche il nucleotidi ATP e risultano essere da questo attivate. Ora parliamo dei fattori natriuretici, e poi dei rispettivi recettori. = amminoacidi identici in A, B, C ANP = Atrial Natriuretic Peptide BNP = Brain Natriuretic Peptide CNP = Natriuretic Peptide C 179