La sorveglianza delle infezioni trasmesse da alimenti in Europa e in Italia. Ida Luzzi

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1 Milano 11 novembre 2010 La sorveglianza delle infezioni trasmesse da alimenti in Europa e in Italia Ida Luzzi Dipartimento di Malattie Infettive, Parassitarie e Immunomediate Istituto Superiore di Sanità, Roma

2 MTA nei paesi industrializzati Alta morbilità (L OMS stima che il 30% della popolazione ogni anno soffra di un episodio di infezione trasmessa da alimenti) In alcuni casi costi umani gravi: E.coli O157 Salmonella e Listeria per soggetti a richio (anziani, gestanti, neonati ) Sempre alti costi socio-sanitari inferiori solo a tumori e malattie cardiovascolari (stime WHO)

3 MTA nei paesi industrializzati Sempre alti costi socio-economici Forte impatto sull opinione pubblica Danni economici e di immagine Settore alimentare Turismo Sviluppare programmi di sorveglianza per indirizzare e verificare le misure di prevenzione e controllo

4 Sorveglianza e controllo delle MTA nella UE Settore Medico DG - SANCO Settore Veterinario - Alimenti Stati Membri Direttiva Zoonosi (99/2003) Monitoraggio Zoonosi Programme on Food - Warterborne Diseases and Zoonoses Task Force Zoonosi

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7 Six priority diseases Salmonellosis Campylobacteriosis STEC/VTEC infection Listeriosis Shigellosis Yersiniosis FWD surveillance network Disease specific epidemiologists and microbiology experts designated by Member States

8 International surveillance network for human infections with Salmonella, VTEC, and Campylobacter. Since 2007 Foodborne and Waterborne Diseases Network

9 Enhance General FWD surveillance objectives detection of international food-borne clusters and outbreaks exchange of information on causative agents/strains Strengthen integrated surveillance in humans, food and animals laboratory capacity in MSs

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11 FWD surveillance network Standard EU case definitions Notification of cases in the TESSy database External laboratory quality assurance Urgent inquiries Annual meetings

12 FWD-2008 Infezioni da: (casi x ab) Salmonella 26,4 Campylobacter 40,7 E.coli VTEC 0,7 Yersinia 1,8 Listeria 0,3 Soggetta a notifica obbligatoria

13 Foodborne and Waterborne Diseases Network

14 Foodborne and Waterborne Diseases Network O % O % O % O % O % O % O % VTEC infections by serogroup N = 9,421

15 The Zoonoses Directive 2003/99/CE Directive 2003/99/CE of 17 november 2003 on measures for monitoring and surveillance of zoonoses and zoonotic agents Art 4.1: MS shall collect relevant and comparable data in order to identify and characterise hazards Art 4.2: Monitoring shall take place at the stages of the food chain most appropriate to the zoonosis concerned

16 The Zoonoses Directive 2003/99/CE Monitoring an surveillance of zoonotic agents in animals and food Salmonella Escherichia coli VTEC Campylobacter Brucella Listeria monocytogenes Mycobacterium bovis Echinococco Trichinella Annex I A, First rank priority

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18 Laboratori diagnostici Laboratori regionali di riferimento ISS Ministero del Lavoro, Della Salute e delle Politiche Sociali

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21 I Centri Lombardia CEPIS Università Milano Ospedali Riuniti Bergamo Lab Sanità Pubblica Brescia AO S.Anna Como Lab Sanità Pubblica Cremona Laboratorio Milano (MI-Lodi) Laboratorio Prevenzione Milano Smatteo Pavia Lab Sanità Pubblica Sondrio Laboratorio Medico Varese IZS Me zzogiorno Portici ARPA Isernia

22 Tecniche di subtipizzazione Profilo di antibioticoresistenza Fagotipizzazione Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) Pulsenet Europe

23 Isolamenti di Salmonella per Regione per anno

24 Agenti patogeni notificati alla rete Enter net Italia *

25 Numero casi di Salmonella e Campylobacter x ab.

26 Distribuzione sierotipi di Salmonella di isolamento umano S. 4,5,12:i:- variante monofasica di S. Typhimurium (4,5,12:i:1,2) mancante della 2a fase flagellare (gene fljb).

27 Determinazione Antibiotico Resistenza Pannello Enter Net, 12 antibiotici % ceppi di Salmonella

28 Percentuale di ceppi di Salmonella spp., Typhimurium, 4,5,12:i:- ed altri sierotipi, multiresistenti

29 Tipizzazione fagica in ceppi di Salmonella Enteritidis e Typhimurium di isolamento umano nel e di S. 4,5,12:i:- nel 2009

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31 73% Profili di PFGE in ceppi ASSuT e ACSSuT ( ) 2006) Genetic similarity (%) PFGE-XbaI * Profili di PFGE di ceppi ASSuT ma appartenenti al cluster B. ** Profili di PFGE presenti in entrambi gli R-types. Dionisi AM et al., Foodborne Pathog Dis 2009;6: Kb 20 STYMXB.0080** STYMXB.0339 STYMXB.0079** STYMXB.0132 STYMXB.0010** STYMXB.0083 STYMXB.0022 STYMXB.0020 STYMXB.0260 STYMXB.0015 STYMXB.0114 STYMXB.0058 * STYMXB.0233 STYMXB.0179 STYMXB.0013 STYMXB.0061 STYMXB.0067 STYMXB.0086 * STYMXB.0051 * STYMXB.0115 Cluster A ASSuT Cluster B ACSSuT

32 EPIS

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35 Grazie!

36 Indagini su episodi epidemici 1. Indagine epidemiologica 2. Indagini microbiologiche 3. Indagini ambientali

37 Il ruolo del laboratorio nelle indagini su episodi epidemici Conoscere il sistema di sorveglianza Chi contattare? Laboratori locali Laboratori regionali Laboratori ospedalieri Laboratori di riferimento Laboratori della rete internazionale

38 Allerte comunitarie ECDC/2009 S. Goldcoast Aumento casi di infezione in Ungheria Ceppi con identico profilo PFGE ECDC/ Urgent inquiry

39 Epidemic curve of S. Goldcoast outbreak (update 10/06/2010) S. Goldcoast outbreaks N. cases ECDC alert other region lombardia 01/01/2009 week Study period Investigation refers to 66 cases, reported in Italy between 01/06/2009 and 28/02/ cases were linked to point-source foodborne outbreaks 53 cases were classified as sporadic

40 Typing PFGE-XbaI of S.Goldcoast PFGE-XbaI strains from human, food and animals BG Goldcoast bg /4 Goldcoast rm Goldcoast rm /3 suino Goldcoast pd BG Goldcoast bg BG Goldcoast bg BG Goldcoast bg BG Goldcoast bg BG Goldcoast bg BG Goldcoast bg /2 suino Goldcoast pd Goldcoast rm /12 Goldcoast rm /14 suino Goldcoast pd /3 Goldcoast rm 2008 S.Goldcoast Hun suino Goldcoast pg /3 suino Goldcoast pg suino Goldcoast pd 2008 Strains from pig production chain Strains from Italian outbreak Strains from Hungary outbreak

41 9 7.8 PFGE-Xba I PFGE-XbaI Key Source and notes R-type Isolati on date Country 11156P human suscept 24/04/08 IT 14179/12P human suscept 15/05/08 IT 1444/09_SP pig 27/04/09 ES 1055/2P 2742/14P pork pork Suscept S IT IT HU-03_Hun 2353/09_SP human human 44 human st rains with the same profi le human Suscept suscept SuSxt 11/11/08 06/03/09 10/02/09 22/06/09 IT IT HUN ES human I:T* 22/01/10 IT 38431P pork suscept 2009 IT H _UK travel to spai n suscept 02/10/09 UK 41437/3P pork suscept 2009 IT human Suscept 20/06/09 IT human Suscept 16/06/09 IT human Suscept 01/07/09 IT human human human human Suscept Suscept Suscept Suscept 16/07/09 02/10/09 23/06/09 06/10/09 IT IT IT IT human Suscept 03/07/09 IT 108/10/FCP human suscept* 15/02/09 IT H _UK suscept 30/03/09 UK Cluster A >87% /09_SP 5485/09_SP 3866/09_SP H _UK H _UK HU-35_Hun 0920/09_SP 2010P /3P 5 human strains with the same profile row beef human human human pork human pork suscept suscept ACS SuT ASSuTK I.: T ASSuT 14/07/09 20/08/08 11/09/09 30/09/09 06/11/09 13/10/09 17/03/ /02/ ES ES ES UK UK HUN ES IT IT IT M59959_DK H _UK travel to spai n suscept 15/09/09 DK UK HU-NK1_Hun human Suscept 15/10/09 HUN H _UK travel to spai n suscept 04/11/09 UK H _UK travel to spai n suscept 10/09/09 UK H _UK travel to spai n suscept 04/11/09 UK H37977_DK travel to spai n DK M60797_DK 0910F46870_DK 0910T40030_DK 0910T41551_DK travel to spai n travel to spai n travel to spai n travel to spai n DK DK DK DK HU-19_Hun HU-31_Hun human human SuSxt 27/08/09 14/09/09 HUN HUN H _UK travel to spai n suscept 08/09/09 UK 0244/09_SP human 04/02/09 ES Cluster B 82.2 >90% H _UK H _UK H _UK H _UK H _UK H _UK H _UK H _UK travel to spai n travel to spai n travel to spai n travel to spai n travel to spai n travel to spai n travel to spai n suscept suscept suscept suscept suscept suscept suscept suscept 16/09/09 07/09/09 14/10/09 03/11/09 02/08/09 06/10/09 07/09/09 22/10/09 UK UK UK UK UK UK UK UK H _UK travel to spai n ACS SuTSpFu 11/09/09 UK H _UK suscept 29/09/09 UK HU21_Hun human SuSxt* 10/02/09 HUN 4895/09_SP human 13/11/08 ES HU-20_Hun human 25/08/09 HUN 1313/09_SP human limph node bi opsy 06/01/09 ES

42 Convegno biomèrieux Sicurezza microbiologica degli alimenti: l evoluzione tecnologica al servizio del Laboratorio. Il sistema TEMPO nei Lab. di controllo ufficiale. Importanza della validazione delle prove, con esempi per i prodotti ittici freschi e conservati. Milano 11/11/2010 Claudio Pellegrino, Patrizia Guerci-Lena IZS di Genova

43 Laboratori ufficiali di controllo I Laboratori ufficiali per i controlli alimentari, individuati nell art 12 del Reg.CE 882/2004, devono operare conformemente alla norma EN ISO/IEC e come tali devono esser valutati da Ente terzo e le loro prove accreditate.

44 Sistema rapido di allerta RASFF Inoltre i Laboratori che operano a tutela degli scambi internazionali di alimenti devono esser inseriti nel sistema di allerta rapida europea RASFF, istituito dal Reg. CE 178/2002

45 Esigenze dei Lab. internazionali di controllo 1) N elevato di campioni (n aliquote x container da ton.) 2) Riduzione dei tempi di risposta (spese di stoccaggio containers ) 3) Riduzione delle manualità e (automatizzazione prove) contenimento n operatori necessità di utilizzo di metodi rapidi alternativi a condizione che si mantenga la stessa affidabilità per le prove.

46 Metodi alternativi Nel campo della ricerca di batteri indicatori d igiene i metodi alternativi semi e/o automatici si sono evoluti con le seguenti tecnologie: Semina in microgoccia, Petrifilm, Spiralsystem, Bioluminescenza, TEMPO.

47 Sistema TEMPO Il sistema TEMPO si basa su un metodo MPN esteso e semiautomatico che utilizza : 16 pozzetti x 3 diluizioni scalari logaritmiche x totale 48 pozzetti e lettura automatica con lampada a fluorescenza. In un sistema che usa un numero quadruplo di pozzetti, rispetto al metodo tradizionale MPN, la incertezza di misura della prova si dimezza (cresce in funz. n pozzetti) Il sistema TEMPO è quindi potenzialmente più preciso.

48 Il Reg ed i metodi alternativi Il Reg. CE 2073/2005, che ha individuato i criteri microbiologici di salubrità ed igienicità, degli alimenti prevede all art. 5 che i metodi alternativi a quelli standard possano esser utilizzati dai Lab. a condizione che siano validati vs. i metodi ISO, secondo le norme internazionali e siano accreditati.

49 Prodotti ittici e importazioni. I prodotti ittici (pesci, crostacei e molluschi) costituiscono la categoria di derrata alimentare maggiormente importata nella U.E. specie dai Paesi terzi emergenti, che non garantiscono con costanza la loro salubrità ed igienicità. (Cina, Bangladesh, Vietnam ecc.)

50 Evoluzione delle importazioni in Italia per tipo prodotti e n container Prodotti della pesca Pelli Lana, Peli Altri prod. non commest

51 N segnalazioni RASFF per tipo di prodotto 2009 e 2008

52 N segnalazioni RASFF per tipo di prodotto. trimestri 2010

53 Validazione prove con TEMPO. Al nostro Lab., che opera a supporto del PIF del porto di Genova, i metodi rapidi TEMPO erano potenzialmente interessanti per vari prodotti. Tuttavia i lavori pubblicati con questo sistema sono ancora pochi e non comprendono varie tipologie di matrici ittiche importate nel nostro Paese. Abbiamo deciso di validare alcune prove per indicatori di igiene con prodotti ittici variamente conservati.

54 Campioni di validazione Le nostre prove hanno riguardato un totale di 229 campioni naturalmente contaminati di cui 41 pesci, 16 crostacei e 32 molluschi. Le tipologie dei prodotti sono risultate : 80 % congelati, 15 % freschi, 1% disidratati, 4% salinati/affumicati.

55 Metodi Tutti i campioni sono stati esaminati in doppio con metodo standard e metodotempo. Metodi standard Total viable count Total Coliform E. coli: EN ISO NF V08-050/99 EN ISO /01 PCA Medium VRBL Medium TBX agar Medium Time 72h ± 3h Time 24h ± 2h Time 18-24h Temp. 30 C ± 1 C Temp. 30 C ± 1 C Temp. 42 C ± 1 C

56 Metodi TEMPO Total viable count Total Coliform E. coli TVC Medium TC Medium EC Medium Time h Time h Time h Temp. 30 C ± 1 C Temp. 30 C ± 1 C Temp. 37 C ± 1 C

57 Criteri di valutazione dei risultati Tutti i risultati dei conteggi per entrambi i metodi sono stati normalizzati in log. 10. Campioni in range. La funzione di trasformazione log. 10 non è applicabile a risultati < 10, in quanto non può esser attribuito un preciso valore al dato MPN. Campioni out of range.

58 Concordanza e discordanza Se la trasformazione log. dei dati ottenuti con i due metodi risulta compresa tra log e -1, è possibile misurare una significatività vera e i risultati sono considerati concordanti e utili. Dati normalizzati log. 10 < -1 e > 1 danno origine a risultati discordanti e non utili.

59 Controlli di qualità : strumentazione e terreni. 1) Controllo performance lettura in fluorescenza QC Card, Reader Check : 1 volta al mese 2) Controllo di efficienza dei terreni colturali Ceppi titolati certificati HPA e Bioball : 3-4 mesi

60 QC Card Control per fluorescenza

61 Controllo di Efficienza terreni colturali E Ceppi titolati e certificati : HPA e Bioball Seminare 0,1 ml. della sospensione a10 3 ufc del ceppo titolato e certificato in 3,9 ml. terreno TEMPO TVC e su piastra di PCA Esempi risult. prove Risultato TEMPO TVC 635 ufc/gr. E = = N colonie su terreno PCA X ufc/gr. E deve esser compreso tra 0,1 e 10 X TVC = 0,12 ****************************************************** in TEMPO EC e su piastra di TBX E deve esser compreso tra 0,01 e 10 X EC = 0,16

62 Controlli di qualità : Personale di Lab. 3) Controllo di ripetibilità stretta di Operatori Lab. Trend pluriennale di r 4) Controllo di ripetibilità intermedia o riproducibilità intralaboratorio. Trend pluriennale di R.

63 Controllo di ripetibilità stretta degli Operatori Lab. (valore ripetibilità metodo TVC r = 0,53.) Trend di ripetibilità "r" TVC TEMPO Oper. n 1 0,2 0,18 0,18 Valori di "r" ra 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,15 0,1 0,1 0,04 0,02 0,04 0,03 0 Prove dal 2007 al 2010

64 Controllo di riproducibilità intralaboratorio (valore riproducibilità metodo TVC r = 0,51) Trend di riproducibilità "R" TVC Tempo 0,16 0,14 0,15 Valori di "R "R" 0,12 0,1 0,08 0,06 0,12 0,11 0,1 0,04 0,02 0,02 0,03 0 Prove negli anni

65 Controlli di qualità inter-laboratorio 5) Prove di confronto esterne (Proficiency test ) Z-score Campioni dei circuiti QMS e QMAS : 2 volte all anno 6) Controllo di riproducibilità interlaboratorio. Non effettuato per mancanza di Lab. disponibili

66 Performances : valori e significato dello Z-score Lo Z-score esprime la performance del Lab., in relazione alla variazione del proprio risultato rispetto al valore medio calcolato sui risultati di tutti i partecipanti al circuito. Lo Z quantifica il numero di deviazioni standard dalla media totale calcolata. dato Lab. media Z = dev. standard /Z/ < 2 soddisfac. 2</Z/ <3 discutibile /Z/ > 3 insoddisfac.

67 Z-score (TVC TEMPO ) vs. ( PCA + ) Rounds trend Oper. Lab. rosso, 2 nero

68 Z-score (EC TEMPO ) vs. ( TBX + ) Rounds trend Oper. Lab. rosso, 2 nero

69 Conclusioni : significatività e ripetibilità delle prove di validazione Nei prodotti ittici freschi e conservati, i risultati delle prove per TVC, TC, EC hanno evidenziato un livello di significatività eccellente in raffronto ai metodi tradizionali, presentando inoltre dati ripetibili e riproducibili.

70 . Conclusioni :performances e tempi di esecuzione L utilizzo del sistema TEMPO ha fornito performances elevate nelle prove di confronto ed ha evidenziato una sensibile riduzione di tempi di preparazione (diluizioni e semine) e di lettura dei campioni.

71 Incremento N analisi a garanzia di sicurezza Questo aspetto permette di aumentare i campioni esaminabili nei lotti, con il medesimo personale, fornendo un numero più ampio di risultati e di conseguenza una maggior garanzia di sicurezza degli alimenti esaminati.

72 Grazie per l attenzione

73 Valutazione della crescita di Cronobacter spp in alimenti in polvere per l'infanzia ALFONSINA FIORE ALESSANDRA VILMERCATI Dipartimento Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Rep. Pericoli Microbiologi ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA - Roma SICUREZZA MICROBIOLOGICA DEGLI ALIMENTI: L EVOLUZIONE TECNOLOGICA AL SERVIZIO DEL LABORATORIO Milano, 11 novembre 2010

74 CRONOBACTER spp (già Enterobacter sakazakii) 2008 Creazione del nuovo genere Cronobacter spp C. sakazakii C. malonaticus C. turicensis C. muytjensii C. dublinensis include 5 specie COMMISSION REGULATION (EU) No 365/2010 of 28 April 2010 Cronobacter spp (Enterobacter sakazakii)

75 Criteri microbiologici applicabili agli alimenti Entrati in vigore in Italia e nel resto d Europa il 5 Dicembre 2007, in accordo con il Regolamento CEE n. 1441/2007 prevedono per il Cronobacter spp l assenza in 10 grammi di prodotto su di un totale di 30 campioni analizzati (alimenti in polvere per l infanzia ed alimenti in polvere dietetici per neonati al di sotto dei 6 mesi aventi particolari necessità mediche).

76 VEICOLO ALIMENTARE

77 SOGGETTI A RISCHIO Adulti Nati a termine Soggetti compresi tra 0 e 12 mesi di vita Nati pre-termine (a meno di 36 sett. di gestazione) Nati con basso peso (< 2,5 kg ) Immunocompromessi Nati da madri HIV positive

78 MANIFESTAZIONI CLINICHE Cronobacter spp Sepsi Infezioni nosocomiali Enterocolite necrotizzante Meningite

79 Fattori che contribuiscono al rischio di infezione Suscettibilità del paziente Livello di contaminazione dell alimento Fattori di rischio Termotolleranza del microrganismo Velocità di crescita del microrganismo

80 PROVE SPERIMENTALI 1. VALUTAZIONE DELLA CRESCITA DI CRONOBACTER SPP IN ALIMENTI IN POLVERE PER L INFANZIA 2. VALUTAZIONE DELLA PERFORMANCE DEL CRONOBACTER ENRICHMENT BROTH 3. VALUTAZIONE DELLA SPECIFICITA : CEB Vs BPW

81 1- VALUTAZIONE DELLA CRESCITA DI CRONOBACTER SPP IN ALIMENTI IN POLVERE PER L INFANZIA IN FUNZIONE DI COMPOSIZIONE TEMPO E TEMPERATURA DI STOCCAGGIO UTIL IZZANDO 4 TERRENI CROMOGENI MATRICI: -latte in polvere per lattanti fino a 6 mesi -semolino per lattanti e bambini oltre i 4 mesi - idrolisato, alimento a base di soia per lattanti fino a 6 mesi CEPPI BATTERICI: pool di 4 ceppi of Cronobacter spp (ATCC 12868, ATCC 29004, ATCC BAA 894 and ATCC 29544)

82 ALLESTIMENTO PROVE SPERIMENTALI Matrice ricostituita 3,6 ufc/ml 4 C 0,036 ufc/ml 4 C 0,0036ufc/ml 4 C 3,6 ufc/ml 10 C 0,036ufc/ml 10 C 0,0036ufc/ml 10 C 3,6 ufc/ml TA 0,036ufc/ml TA 0,0036ufc/ml TA

83 Monitoraggio della crescita di Cronobacter spp al momento dell inoculo (D0) dopo 2h, 24h, 48h, 72h semina per spatolamento su 4 terreni cromogeni disponibili in commercio: 1. ESIA (Biolife) 2. Compass agar (Biokar Diagnostic) 3. RAPID sakazakii (BIO-RAD) 4. Agar chromoid Sakazakii-ESPM (Biomerieux)

84 Tab. 1 Variazione della popolazione 1 di Cronobacter spp in un campione di IDROLISATO contaminato sperimentalmente (3 diverse concentrazioni) e convervato a TEMPERATURA AMBI ENTE Livello iniziale di contaminazione ufc/ml a DO^ ufc/ml dopo 2h ufc/ml dopo 24h ufc/ml dopo 48h ufc/ml dopo 72h 3,6 ufc/ml 2 2 2,1x10 8 1,7x x10 9 0,036 ufc/ml neg neg 9,0x10 5 6,4x10 8 6,5x10 9 0,0036 ufc/ml neg neg neg neg neg ^D0: valutazione al momento dell inoculo; 1 Ogni risultato è la meddia di tre esperimenti usando 4 terreni cromogeni

85 Tab. 2 Variazione della popolazione 1 di Cronobacter spp in un campione di IDROLISATO contaminato sperimentalmente (3 diverse concentrazioni) e convervato a 10 C Livello iniziale di contaminazione ufc/ml a DO^ ufc/ml dopo 2h ufc/ml dopo 24h ufc/ml dopo 48h ufc/ml dopo 72h 3,6 cfu/ml ,036 cfu/ml neg neg neg neg 32 0,0036 cfu/ml neg neg neg neg neg ^D0: valutazione al momento dell inoculo; 1 Ogni risultato è la meddia di tre esperimenti usando 4 terreni cromogeni

86 Tab. 3 Variazione della popolazione 1 di Cronobacter spp in un campione di IDROLISATO contaminato sperimentalmente (3 diverse concentrazioni) e convervato a 4 C Livello iniziale di contaminazione ufc/ml a DO^ ufc/ml dopo 2h ufc/ml dopo 24h ufc/ml dopo 48h ufc/ml dopo 72h 3,6 cfu/ml ,036 cfu/ml neg neg neg neg neg 0,0036 cfu/ml neg neg neg neg neg D0: valutazione al momento dell inoculo; 1 Ogni risultato è la meddia di tre esperimenti usando 4 terreni cromogeni

87 2 - Valutazione della performance del Cronobacter Enrichment Broth (CEB) vs Buffered Peptone Water (BPW) Matrice latte in polvere 10g Ceppi batterici: 1. Ceppo E 632 concentrazione iniziale: 4,1 ufc/ml 2. pool di 4 ceppi Cronobacter spp ATCC concentrazione iniziale: 4,1 ufc/ml Diluenti BPW 90ml CEB 90 ml Condizioni di incubazione: 37 C x 18 +/- 2h Conta batterica su terreno cromogeno dopo allestimento delle opportune diluizioni scalari

88 RISULTATI 1 CAMPIONE DILUENTI Latte in polve re + E632 (conc. iniziale 4,1ufc/ml) BPW 6,0 x10 4 ufc/ml CEB 6,7x10 8 ufc/ml

89 RISULTATI 2 CAMPIONE Latte in polve re + Pool (conc. iniziale 4,1ufc/ml) BPW 4,1 x10 5 ufc/ml DILUENTI CEB 5,6 x10 8 ufc/ml

90 3 - VALUTAZIONE DELLA SPECIFICITA : CEB Vs BPW Matrice latte in polvere 10g Ceppi batterici: pool di 4 ceppi Cronobacter spp (ATCC 12868, ATCC 29004, ATCC BAA 894, ATCC 29544) S. aureus ATCC E. coli ATCC Per ogni ceppo sono state considerate 3 concentrazioni finali: pool di 4 ceppi Cronobacter spp: 3,2 ufc/ml 0,32 ufc/ml 0,032 ufc/ml S. aureus 1,0 ufc/ml 0,1 ufc/ml 0,01 ufc/ml E. coli 2,6 ufc/ml 0,26 ufc/ml 0,026 ufc/ml Diluenti BPW 90ml CEB 90 ml Condizioni di incubazione: 37 C x 18 +/- 2h Valutazione della crescita su terreno cromogeno

91 TAB. 4 Risultati relativi alle prove sperimentali condotte utilizzando BPW come diluente (metodo ISO) Livello di contaminazione iniziale Risultati semina diretta su terreno cromogeno Risultati semina dopo arricchimento in mlst 1 Pool 0,032 ufc/ml Crescita buona Crescita buona 2 Pool 0,032ufc/ml Crescita assente Crescita assente E coli 0,026ufc/ml Crescita assente Crescita assente S. aureus 0,01ufc/ml Crescita assente Crescita assente 3 Pool 0,32ufc/ml Crescita buona Crescita buona 4 Pool 0,32ufc/ml Crescita debole Crescita debole E coli 2,6ufc/ml Crescita buona Crescita buona S. aureus 1,0ufc/ml Crescita assente Crescita assente 5 Pool 3,2ufc/ml Crescita buona Crescita buona 6 Pool 3,2ufc/ml Crescita buona Crescita buona E coli 0,26ufc/ml Crescita buona Crescita buona S. aureus 0,1ufc/ml Crescita assente Crescita assente

92 TAB. 5 Risultati relativi alle prove sperimentali condotte utilizzando CEB come diluente Livello di contaminazione iniziale Risultati semina diretta su terreno cromogeno Risultati semina dopo arricchimento in mlst 10 Pool 0,032 ufc/ml Crescita buona Crescita buona 7 Pool 0,032ufc/ml Crescita assente Crescita assente E coli 0,026ufc/ml Crescita buona Crescita buona S. aureus 0,01ufc/ml Crescita assente Crescita assente 8 Pool 0,32ufc/ml Crescita buona Crescita buona 11 Pool 0,32ufc/ml Crescita buona Crescita buona E coli 2,6ufc/ml Crescita debole Crescita debole S. aureus 1,0ufc/ml Crescita assente Crescita assente 9 Pool 3,2ufc/ml Crescita buona Crescita buona 12 Pool 3,2ufc/ml Crescita buona Crescita buona E coli 0,26ufc/ml Crescita debole Crescita debole S. aureus 0,1ufc/ml Crescita assente Crescita assente

93 SVILUPPI FUTURI Confronto tra metodi rapidi per la ricerca di Cronobacter spp Valutazione della crescita di Cronobacter spp in presenza di batteri lattici produttori di batteriocine

94 CONVEGNO Sicurezza Microbiologica degli Alimenti: l evoluzione microbiologica al servizio del laboratorio Milano 11 novembre 2010 Virus enterici in diverse matrici alimentari: l'esperienza del progetto Europeo BIOTRACER per la determinazione del virus dell epatite A e dei norovirus in acque (minerali) imbottigliate. Simona Di Pasquale simona.dipasquale@iss.it Dip. Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare

95 Virus Enterici 120 differenti specie I virus si presentano come particelle inerti sferiche con diametro che variano: da nm (Picornavirus-Epatite A, e Calicivirus-Norovirus) a 75 nm (Rotavirus) I virus presentano una superficie esterna costituita da un rivestimento che protegge il filamento di RNA. Classificazione dei Virus Enterici trasmessi con gli alimenti e le acque Virus che provocano gastroenteriti: Calicivirus enterici umani: Norovirus e i Saporovirus Virus dell'epatite a trasmissione oro-fecale: Virus dell epatite A (HAV) Virus dell epatite E (HEV); Virus che replicano nell'intestino umano ma provocano patologie in altri organi, quali il sistema nervoso centrale o il fegato Enterovirus

96 Alimenti che veicolano i virus enterici Acqua (minerale) imbottigliata

97 Acqua (minerale) imbottigliata La crescente domanda mondiale di acqua in bottiglia ha comportato il consumo totale di 154 miliardi di litri nel 2004 (Gleick, 2008). Anche se epidemie virali legate all acqua in bottiglia non sono state mai documentate, è stato però segnalato che i livelli di carica batterica spesso risultano più elevati di quelli relativi all acqua di rubinetto La presenza di microrganismi patogeni nelle aree di captazione idrica rappresenta un serio problema per la salute del consumatore, per questa ragione monitoraggi microbiologici delle acque vengono effettuati sia alla fonte che dopo l imbottigliamento. Nelle analisi di routine, però, la determinazione di virus enterici non viene ancora effettuata perché non prevista nella normativa vigente.

98 Acque Minerali Circ. Min. n. 17 del 13/09/1991 Acque Destinate al consumo Umano Dec. Leg 2 febb n.31 Per i virus enterici non sono previsti a causa della mancata disponibilità di metodi analitici di riferimento Ma. Gruppo di lavoro: CEN/TC275 WG6/TAG 4 Detection of Viruses in food" Microbiology of food and animal feeding stuffs- Horizontal method for detection of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. Version 8 February 2010

99 Microbiology of food and animal feeding stuffs- Horizontal method for detection of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. Version 8 February 2010 Acque (minerali) imbottigliate Prodotti Vegetali Molluschi Concentrazione delle particelle virali con Filtrazione/Ultrafiltrazione Estrazione e Concentrazione delle particelle virali con TGBE/PEG Estrazione delle particelle virali con Proteinasi k Estrazione dell RNA virale mediante silica magnetica (Biomerieux) Determinazione del genoma virale mediante Real-Time rt-pcr

100 Progetto Europeo BIOTRACER Obiettivo principale era quello di implementare sia le conoscenze sul comportamento microbico che lo sviluppo di metodi rapidi per fronteggiare eventi di contaminazione Nell ambito del BIOTRACER c era un area di ricerca (RA5) che riguardava principalmente la determinazione di virus enterici in acque imbottigliate, al fine di sviluppare metodologie appropriate da utilizzare in caso di sospette attività bioterroristiche che potrebbero coinvolgere le risorse idriche (compresa l'acqua in bottiglia). Le metodologie sviluppate potranno essere utilizzate dalle autorità di controllo per le analisi di routine, mentre i dati ottenuti sulla presenza e diffusione dei virus nella catena di produzione dell acqua in bottiglia potranno essere utilizzati per definire un eventuale scenario di contaminazione.

101 Progetto Europeo BIOTRACER Step I: Step II: Step III: Sviluppare nuovi metodi per il recupero dei virus enterici (HAV e calicivirus) da acqua (minerale) imbottigliata (1.5 L PET) contaminata sperimentalmente. Valutare l efficienza dei nuovi metodi ciascuno confrontato con il metodo di riferimento, per la concentrazione delle particelle virali da acqua (minerale) imbottigliata (1.5 L PET) contaminata sperimentalmente da HAV, Norovirus GI, Norovirus GII e Calicivirus Felino. effettuare uno studio collaborativo tra cinque laboratori europei al fine di validare il metodo più promettente per il recupero dei virus enterici da acqua in bottiglia. I criteri di validazione sono stati: - limite di rilevazione, - percentuale di recupero, - riproducibilità, - rapidità e semplicità.

102 Step I: Sviluppo di nuovi metodi U. O. 1 Istituto Nazionale per L alimentazione-danimarca Ruolo di coordinamento e pianificazione del progetto U.O. 2 ISS U.O. 3 ANSES Ex AFSSA U.O. 4 Università di Lubiana, Slovenia

103 Step II: Valutazione dell efficienza dei nuovi metodi ciascuno confrontato con il metodo di riferimento (proposta metodo CEN) Metodo A Ultracentrifugation QIAamp RNA kit (Qiagen) Di Pasquale et al., 2010 Metodo di Riferimento Ultrafiltration NucliSens MiniMAG (BioMerieux) Gilgen et al. (1997) modificato Metodo B NucliSens easymag platform (BioMerieux) Perelle et al., 2009 Metodo di Riferimento Ultrafiltration NucliSens MiniMAG (BioMerieux) Metodo C 8-mL Convective Interaction Media (CIM) QA tube monolithic column QIAamp RNA kit (Qiagen) Kovac et al., 2009 Metodo di Riferimento Ultrafiltration NucliSens MiniMAG(BioMerieux)

104 Step II: Per ciascun metodo 5 bottiglie di acqua minerale Monte Cimone (1.5L) venivano contaminate ciascuna con 100 µl di diluizioni scalari di HAV e FCV (range 10 a 10 5 TCID 50 ). Metodo Riferimento Metodo A Metodo B Metodo C Concentrazione mediante filtrazione utilizzando membrane cariche positivamente Concentrazione mediante CIM Eluizione con (Tris) Glicine Beef Extract Buffer Eluizione con PBS Ultrafiltrazione a 4000xg per 15 min Ultracentrifugazione a xg per 4 h Ultracentrifugazione a xg per 1 h Estrazione RNA con NucliSens MiniMAG (BioMerieux) Estrazione RNA con QIAamp RNA kit (Qiagen) Estrazione RNA con NucliSens easymag platform (BioMerieux) Estrazione RNA con QIAamp RNA kit (Qiagen) Real-Time rt-pcr

105 Risultati Step II: LOD 50 Metodo A LOD 50 Metodo C Metodo D LOD 50 Metodo C LOD 50 Metodo B LOD 50 Metodo A LOD 50 Metodo B Metodo A LOD per HAV: 3607 TCID 50 LOD per FCV: 9 TCID 50 Recupero di HAV/FCV: 0.3% / 0.5% Metodo B LOD per HAV: 361 TCID 50 LOD per FCV: 9 TCID 50 Recupero di HAV/FCV: 32% / 25% Metodo C LOD per HAV: 45 TCID 50 LOD per FCV: 9 TCID 50 Recupero di HAV/FCV: 34% / 6% Tutti i metodi esaminati (A, B, C) sono stati, in misura diversa, più efficienti rispetto al metodo di riferimento (Metodo D) per recuperare HAV e FCV. Tutti i metodi esaminati (A, B, C, ) sono stati in grado di determinare la conc. dell FCV pari a 9 TCID 50 /1.5L L ultracentrifugazione (A) rispetto ai metodi CIM (C) e all estrazione diretta dei virus dalla membrana (B), ha dimostrato costantemente valori superiori di Ct per i livelli rilevati sia di FCV che di HAV. Ciò ha determinato una minore percentuale dei recuperi per FCV e HAV e un limite di sensibilità più alto rispetto al metodo C e B

106 Risultati Step II: Il metodo C pur raggiungendo un LOD 50 inferiore di quasi un log 10 rispetto al metodo B, per il rilevamento dell HAV, non è stato scelto per lo studio collaborativo in quanto: -il metodo B ha mostrato valori di Ct più bassi sia per il recupero dell HAV che dell FCV rispetto al metodo di riferimento, e rispetto agli altri metodi (A, C). -inoltre il metodo B è stato in grado di recuperare il 20% in più per l FCV rispetto sia al metodo di riferimento che e agli altri metodi (A, C); Metodo B richiede solo alcune fasi di manipolazione dopo il processo di filtrazione: - l'estrazione diretta RNA virale dalla membrana; - applicazione di sistemi (semi-) automatici per estrazione di RNA virale. Inoltre, durante questa valutazione, abbiamo dimostrato che il metodo B (NucliSENS easymag) può essere sostituito dal NucliSENS MiniMag, procedura meno costoso, senza compromettere l'efficienza dell estrazione di RNA. Per queste ragioni, il metodo B è stato scelto per lo studio collaborativo tra cinque laboratori europei al fine di valutare la sua robustezza e facilità d'uso.

107 Step III: studio collaborativo tra cinque laboratori europei Contaminazione di acqua minerale Monte Cimone in bottiglie di PET da 1.5 L (fornita da COOP, Bologna). 6 bottiglie di acqua minerale venivano contaminate ciascuna con 100 µl di diluizioni scalari di: HAV (ATCC HM175/18f) (range 1 a 10 5 TCID 50 ) Feline Caliciviruses FCV (VR-782, strain F9) (range 1 a 10 5 TCID 50 ) NoV GI.4. (range 10 a 10 6 TCID 50 ) NoV GII.4 (range 10 a 10 6 TCID 50 ) Filtrazione di acqua minerale contaminata Determinazione dei virus enterici con il metodo B La membrana veniva incubata direttamente per 20 min in una piastra petri contenente 3 ml di Lisi Buffer (BioMerieux). Il lisato ottenuto veniva sottoposto dal: Laboratorio n.1 Laboratorio n.2 Laboratorio n.3 Laboratorio n.4 Laboratorio n.5 sistema automatico NucliSens easymag platform (BioMerieux) sistema semi-automatico NucliSens minimag (BioMerieux) sistema semi-automatico NucliSens minimag sistema semi-automatico NucliSens minimag sistema semi-automatico NucliSens minimag Per ciascun virus allestimento di curve standard a partire da soluzioni virali

108 Risultati Step III: I dati ottenuti dallo studio collaborativo mostrano che il metodo B ha: buona efficienza di estrazione; buon recupero dell RNA virale dal 34% al 61% 4 / 5 Lab 1 / 5 Lab 1 / 5 Lab Media LOD: 211 TCID 50 Slope: -3.17± 0.20 R ±0.03 Recupero: 51% Media LOD: 66 TCID 50 valore sottostimato Slope: -3.28± 0.65 R ±0.04 Recupero: 34% Solo 2 Lab Media LOD: 9 URT-PCR valore sottostimato Slope: -3.27± 0.07 R ±0.00 Recupero: 61% Media LOD: 286 URT-PCR Slope: -3.27± 0.07 R ±0.01 Recupero: 35%

109 Conclusioni Il migliore recupero virale da parte del metodo C e B rispetto al metodo A e metodo di riferimento è dovuto all eliminazione della fase di eluizione con il tampone (T)GBE. Questo step è stato messo in evidenza come punto critico dalla U.O.dell ISS nella procedura di concentrazione (Di Pasquale et al. 2010A) perché non in grado di eluire completamente le particelle virali dalla membrana causando una considerevole perdita di virus. Metodo B richiede solo alcune fasi di manipolazione dopo il processo di filtrazione e l'estrazione dell RNA virale avviene direttamente sulla membrana riducendo notevolmente la perdita dell RNA virale. Una variazione del LOD 50 e della percentuale di recuperi per quanto riguarda l HAV, FCV e NoV GII sono stati ottenuti tra i laboratori, nonostante la semplicità del metodo B, l armonizzazione del campione costituito da bottiglie di acqua minerale, stesso virus distribuito alle U.O. e stessi reagenti. Questa osservazione enfatizza la necessità di standardizzare i controlli positivi.

110 Conclusioni Nel presente studio, le soluzioni virali di HAV e FCV utilizzate per l inoculo sono state espresse come unità di virus infettanti mentre le soluzioni virali di NoV GGI e GGII sono state espresse come genomi virali ( RT-PCRU/1.5 L). Vi è una mancanza di correlazione tra la quantità di virus infettivo e genomi virali nelle soluzioni virali di virus di HAV (Hewitt e Greening, 2006) e FCV (Gassillou det al., 2003),dove la presenza di particelle virali non infettanti si tradurrà in maggiore concentrazione in termini di genoma virale rispetto al titolo virale In conclusione i dati ottenuti dallo studio collaborativo dimostrano che il metodo B ha una buona efficienza di estrazione e un buon recupero dell RNA virale, inoltre è riproducibile e robusto. Queste caratteristiche possono essere utile per l analisi di routine nei laboratori di virologia che analizzano acqua (minerale) imbottigliata, in quanto si può ridurre al minimo il rischio di contaminazione crociata tra campioni.

111 Prospettive future Applicazione del metodo su altri tipi di acque minerali in bottiglia al fine di valutare come le diverse composizioni possono influenzare le prestazioni del metodo. Applicazione del metodo a campioni d acqua (minerale) imbottigliati naturalmente contaminati. Applicazione del metodo anche ad acque potabili e di irrigazione.

112 Ringraziamenti Jeffrey Hoorfar Anna Charlotte Schultz Katerina Kovac Peter Raspor Sylvie Perelle Patrick Fach Martino Barbanera Sonia Scaramagli Mara Paniconi Bruna Auricchio Dario De Medici

113 VALUTAZIONE DI METODICHE ALTERNATIVE PER IL RILEVAMENTO DI VTEC O157 IN ALIMENTI Dott.ssa Claudia Picozzi DiSTAM

114 RICERCA E STUDIO DI ESCHERICHIA COLI VEROTOSSICI Progetto PRIN2007 (Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale) MINISTERO DELL UNIVERSITÀ E DELLA RICERCA Milano: latte di capra crudo e filtri di mungitura Parma: latte vaccino crudo Bologna: campioni prelevati da macelli e stalle Padova: latte vaccino crudo, colostro e latte di bufala Sassari: campioni prelevati da macelli e da stalle di ovini

115 ESCHERICHIA COLI Microflora dell intestino dell uomo e degli animali a sangue caldo Mantenimento della fisiologia intestinale Gram negativi, forma di bastoncini, mobili o non mobili Anaerobi facoltativi, sono in grado di utilizzare carbonio e azoto come fonti di energia Optimum temperatura: 37 C; neutrofilo La maggior parte dei ceppi di E. coli non è dannosa La classificazione sierologica in base al tipo di antigene: somatico (O), capsulare (K) e flagellare (H)

116 ESCHERICHIA COLI PATOGENI Kaper et al., Nature Reviews Microbiology

117 ESCHERICHIA COLI VEROTOSSICI (VTEC) Potenti tossine attive sulle cellule Vero (VT1 e VT2 e varianti) Nell uomo i recettori funzionali si trovano nelle cellule del tessuto renale, nei linfociti, negli eritrociti e nelle cellule endoteliali Patologie: HC e HUS Più di casi di infezione all anno dovuti al consumo di alimenti contaminati ATTACHING AND EFFACING Intima aderenza (attaching) tra il batterio e cellule epiteliali L intimina, codificata dal gene eae, determina l accumulo di microfilamenti di actina Distruzione (effacing) dei microvilli intestinali

118 IL LATTE DI CAPRA crescente valorizzazione del settore capacità dell animale di adattarsi a condizioni climatiche e ad ambienti mutevoli oltre l 80% della popolazione caprina in Asia e in Africa in Europa, Oceania, Nord e Sud America la produzione lattiero casearia da capre è soprattutto un operazione commerciale composizione estremamente variabile (lattosio 4,1%) dimensione dei globuli di grasso inferiore rispetto al latte vaccino( 80% <5µm) elevata proporzione di acidi grassi a media catena (C6:0, C8:0, C10:0) bassi livelli di α S1 -caseina Silanikove et al., Small Ruminant Research

119 PIANO SPERIMENTALE Campioni di latte e filtri di mungitura Prearricchimento campioni ore a 41,5 C ± 1 C Estrazione del DNA VIDAS UP E. coli O157 (including H7) Determinazione di E. coli Verotossici con tecnica PCR Isolamento di colonie dai campioni positivi Caratterizzazione isolati attraverso Multiplex PCR

120 VIDAS UP E. COLI O157 (INCLUDING H7) TEST (ECPT) Tamponi di lavaggio Substrato Campione Diluente Coniugato 450 nm (Risciacquo)

121 PIANO DI CAMPIONAMENTO 99 campioni di latte 181 campioni 82 filtri di mungitura acqua peptonata tamponata + vancomicina (8mg/l) + cefixime (0,05mg/l) + cefsulodina (10mg/l) (VCC) pre-riscaldata a 41,5 ± 1 C 16-24ore a 41,5 ± 1 C

122 VIDAS UP 181 arricchimenti 6 positivi (3.3%) 5 filtri 1 latte (nessuna corrispondenza con i filtri)

123 PIANO SPERIMENTALE Campioni di latte e filtri di mungitura Prearricchimento campioni ore a 41,5 C ± 1 C Estrazione del DNA VIDAS UP E. coli O157 (including H7) Determinazione di E. coli Verotossici con tecnica PCR Isolamento di colonie dai campioni positivi Caratterizzazione isolati attraverso Multiplex PCR

124 AMPLIFICAZIONE PCR 181 arricchimenti Primer Sequenza (5-3 ) Dimensione amplificato MK1 MK2 TTT ACC TTA GAC TTC TCG AC CAC ATA TAA ATT ATT TCG CTC bp M 230 bp M Karch H. & Meyer T Journal of Clinical Microbiology

125 RISULTATI APPLICAZIONE METODICHE ALTERNATIVE Totale campioni analizzati 181 Totale campioni positivi 21 Campioni di latte di capra 99 Campioni di latte positivi 3 Campioni di filtro di mungitura 82 Campioni di filtro positivi 18 Incidenza: 11,6% Positivi al VIDAS UP Positivi all analisi PCR 6 20

126 PIANO SPERIMENTALE Campioni di latte e filtri di mungitura Prearricchimento campioni ore a 41,5 C ± 1 C Estrazione del DNA VIDAS UP E. coli O157 (including H7) Determinazione di E. coli Verotossici con tecnica PCR Isolamento di colonie dai campioni positivi Caratterizzazione isolati attraverso Multiplex PCR

127 MULTIPLEX PCR Isolamento colonie Estrazione DNA

128 MULTIPLEX PCR M M 779 bp 614 bp M M 890 bp 779 bp 614 bp

129 CONCLUSIONI La metodica VIDAS UP vista l elevata sensibilità, la sicurezza d uso e la velocità di esecuzione si è dimostrata una valida procedura di screening per l identificazione di E. coli O157 La tecnica PCR si è dimostrata valida per l identificazione dei ceppi VTEC La Multiplex PCR ha permesso di ottenere maggiori informazioni sulla presenza di geni che codificano per l intimina e per le verocitotossine La capra è un importante serbatoio naturale di VTEC Il consumo di latte crudo di capra e i prodotti ottenuti da latte crudo sono una possibile fonte di rischio per la salute del consumatore E importante sottoporre in misura sempre maggiore anche questo prodotto alla determinazione di VTEC e nello specifico di E. coli O157, secondo il Regolamento CE 1441/2007