Controllo ufficiale degli OGM nel settore agroalimentare

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1 Controllo ufficiale degli OGM nel settore agroalimentare Ugo Marchesi Istituto Zooprofilattico Sperimentale Lazio e Toscana Centro di Referenza Nazionale per la ricerca di OGM

2 ORGANISMI COINVOLTI NEL CONTROLLO UFFICIALE DEGLI OGM MINISTERO DELLA SALUTE REGIONI UFFICI SANITA MARITTIMA Monitoraggio flussi di soia e mais GM nei porti italiani NAS, ASL-SIAN Controllo ottemperanza normativa OGM alimentazione umana ASL -Servizi Veterinari Controllo ottemperanza normativa OGM alimentazione animale Centro di Referenza Nazionale per la ricerca di OGM IZS Lazio e Toscana IIZZSS Controllo analitico ISS Revisione di analisi

3 Alimenti geneticamente modificati autorizzati nell Unione Europea

4 Alimenti geneticamente modificati autorizzati nell Unione Europea

5 Costrutto utilizzato nella soia Roundup Ready Costrutto PV-GMGT04

6 Soia Roundup Ready Nel genoma della pianta risultano inserite almeno 2 copie del gene CP4EPSPS (tolleranza al glifosato)

7 Costrutti utilizzati nel mais Bt176 Costrutto pcib4431 (derivato di puc) Costrutto pcib3064 (derivato di puc)

8 Mais Bt176 geneticamente modificato La pianta produce la proteina tossica per la piralide Nel genoma della pianta sono state Nel genoma della pianta sono state inserite 6 copie del gene CryIAb e del gene bla (resistenza alle penicilline) ed almeno due copie del gene bar (tolleranza al glufosinato)

9 Costrutto utilizzato nei mais Bt11 e Bt10 Costrutto pzo1502 (derivato di puc)

10 Mais Bt11 geneticamente modificato La pianta produce la proteina tossica per la piralide Nel genoma della pianta sono state inserite 1 copia del gene CryIAb e del gene pat (tolletanza al glufosinato) Non risulta integrato il gene bla (resistenza alle penicilline), presente invece in Bt10

11 Costrutto utilizzato nel mais T25 Costrutto p35s/ac (derivato di puc)

12 Mais T25 geneticamente modificato Nel genoma della pianta risulta inserita 1 copia intera del gene pat (tolletanza al glufosinato) ed 1 copia parziale del gene bla (resistenza alle penicilline)

13 Costrutto utilizzato nel mais MON810 Costrutto PV-ZMBK07 (derivato di puc)

14 Mais MON810 geneticamente modificato La pianta produce la proteina tossica per la piralide Nel genoma della pianta è stata inserita 1 copia del gene CryIAb Non risulta integrato il t-nos presente nel costrutto

15 Costrutto utilizzato nel mais NK 603 Costrutto PV-ZMGT32L

16 Mais NK603 geneticamente modificato Nel genoma della pianta risultano inserite 2 copie del gene CP4EPSPS (tolleranza al glifosato)

17 Costrutto utilizzato nel mais GA21 NON AUTORIZZATO (parere favorevole EFSA) Frammento del costrutto pdpg434

18 Mais GA21 geneticamente modificato Nel genoma della pianta risultano inserite 4 copie del gene mepsps (tolleranza al glifosato)

19 Metodi analitici per la ricerca di OGM Analisi delle proteine modificate mediante tecniche Elisa Analisi del DNA modificato mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) per il rilevamento qualitativo e quantitativo

20 Metodologie analitiche per il rilevamento di OGM negli alimenti Analisi delle proteine tipo ELISA facile esecuzione rapidi poco costosi quantitativi sensibilità non elevata raramente applicabili su prodotti finiti Analisi del DNA PCR elevate sensibilità e specificità applicabili ad alimenti finiti quantitativi costosi richiedono strutture di laboratorio adeguate

21 Metodologie analitiche per il rilevamento di OGM negli alimenti (2) Fasi di una metodica PCR: estrazione del DNA massa del campione da omogeneizzare ( 30 g - 30 kg) massa del campione da analizzare ( 100 mg - 10 g) selezione del metodo di estrazione in funzione dell alimento: buona resa elevata purezza ridotta degradazione verifica della qualità e della quantità del DNA estratto: determinazione spettrofotometrica Elettroforesi PCR real time

22 Metodologie analitiche per il rilevamento di OGM negli alimenti (3) amplificazione del DNA bersaglio PCR controllo efficienza estrazione DNA vegetale: bersaglio: sequenze specifiche della specie oggetto di analisi PCR screening (es. PCR p35s e terminatore NOS) PCR specifica PCR quantitativa

23 Polymerase Chain Reaction (PCR)) Animazione PCR

24 Polymerase Chain Reaction (PCR))

25

26 Tipologie di PCR PCR end point PCR real-time

27 Allestimento PCR

28 Amplificazione DNA

29 Elettroforesi dell amplificato

30 Rivelazione dell amplificato

31 PCR : l analisi dei risultati PCR end point : analizza gli amplificati nella fase di plateau: Fornisce poche informazioni su quantità e qualità del DNA

32 Nested PCR Maggiore specificità Maggiore sensibilità PCR I PCR II Ladder

33 I punti critici Organizzazione dei laboratori Area pre-pcr AREE DI PROVA 205 e 239 Preparazione reagenti, primer, master mix AREA DI PROVA 220 Estrazione DNA Allestimento PCR1 Aree PCR AREA DI PROVA 221/A Allestimento PCR2 AREA DI PROVA 221 Reazione di PCR1 Reazione di PCR2 Area post-pcr AREA DI PROVA 210 Elettrofores i acidi nucleici

34 Tipologie di PCR PCR end point PCR real-time

35 Rivelazione aspecifica

36 Rivelazione specifica in fluorescenza Reporter Quencher

37 Analisi multicomponente

38 Real Time: TaqMan Sviluppato dalla Applied Biosystems principio della 5 esonucleasi. Prevede un probe che ha due fluorocromi: un reporter ed un quencher. Sfrutta la capacità esonucleasica in posizione 5 della polimerasi per liberare il fluorocromo reporter. Il fluorocromo reporter liberato emette fluorescenza Saggio 5-3 esonucleasico Forward Primer R Probe NFQ MGB Reverse Primer 5 3 5

39 Real Time: TaqMan Sviluppato dalla Applied Biosystems principio della 5 esonucleasi. Prevede un probe che ha due fluorocromi: un reporter ed un quencher. Sfrutta la capacità esonucleasica in posizione 5 della polimerasi per liberare il fluorocromo reporter. Il fluorocromo reporter liberato emette fluorescenza Saggio 5-3 esonucleasico Forward Primer R Probe NFQ MGB Reverse Primer 5 3 5

40 Real Time: TaqMan Sviluppato dalla Applied Biosystems principio della 5 esonucleasi. Prevede un probe che ha due fluorocromi: un reporter ed un quencher. Sfrutta la capacità esonucleasica in posizione 5 della polimerasi per liberare il fluorocromo reporter. Il fluorocromo reporter liberato emette fluorescenza Saggio 5-3 esonucleasico Forward Primer R Probe NFQ MGB Reverse Primer 5 3 5

41 Real Time: TaqMan Sviluppato dalla Applied Biosystems principio della 5 esonucleasi. Prevede un probe che ha due fluorocromi: un reporter ed un quencher. Sfrutta la capacità esonucleasica in posizione 5 della polimerasi per liberare il fluorocromo reporter. Il fluorocromo reporter liberato emette fluorescenza Saggio 5-3 esonucleasico Forward Primer R Probe NFQ MGB Attività esonucleasica 5-3 Spostamento e Taglio Reverse Primer 5 3 5

42 Real Time: TaqMan Sviluppato dalla Applied Biosystems principio della 5 esonucleasi. Prevede un probe che ha due fluorocromi: un reporter ed un quencher. Sfrutta la capacità esonucleasica in posizione 5 della polimerasi per liberare il fluorocromo reporter. Il fluorocromo reporter liberato emette fluorescenza Saggio 5-3 esonucleasico Forward Primer R Probe NFQ MGB Attività esonucleasica 5-3 Reverse Primer 5 3 5

43 Real Time: TaqMan Sviluppato dalla Applied Biosystems principio della 5 esonucleasi. Prevede un probe che ha due fluorocromi: un reporter ed un quencher. Sfrutta la capacità esonucleasica in posizione 5 della polimerasi per liberare il fluorocromo reporter. Il fluorocromo reporter liberato emette fluorescenza Saggio 5-3 esonucleasico Forward Primer R Probe NFQ MGB Attività esonucleasica 5-3 Reverse Primer 5 3 5

44 Real Time: TaqMan Sviluppato dalla Applied Biosystems principio della 5 esonucleasi. Prevede un probe che ha due fluorocromi: un reporter ed un quencher. Sfrutta la capacità esonucleasica in posizione 5 della polimerasi per liberare il fluorocromo reporter. Il fluorocromo reporter liberato emette fluorescenza Saggio 5-3 esonucleasico Forward Primer R Probe NFQ MGB Attività esonucleasica 5-3 Reverse Primer 5 3 5

45 Real Time: TaqMan Sviluppato dalla Applied Biosystems principio della 5 esonucleasi. Prevede un probe che ha due fluorocromi: un reporter ed un quencher. Sfrutta la capacità esonucleasica in posizione 5 della polimerasi per liberare il fluorocromo reporter. Il fluorocromo reporter liberato emette fluorescenza Saggio 5-3 esonucleasico Forward Primer R Probe NFQ MGB Reverse Primer Polimerizzazione completa 5 3 5

46 PCR Real Time

47

48 Curva di amplificazione Rn Exp Plateau Base line Ct Threshold N cicli

49 PCR real time: analisi quantitativa Relazione tra ciclo soglia e quantità di DNA bersaglio Ct = a log (n copie DNA bersaglio) + b con a < 0 Fluores cenza Copie di DNA Cicli di amplificazione

50 PCR Real Time

51 PCR Real Time 40 TC1507 System y = -3,196x + 37,625 R 2 = 0, CALIBRATORI 30 Ct CAMPIONE INCOGNITO 15 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 Log N copie

52 Fasi della ricerca di OGM 1. Ricerca ingrediente (specie vegetale) 2. Screening GM 3. Identificazione OGM 4. Quantificazione OGM

53 1) Ricerca ingrediente (specie vegetale) Mais Nested PCR Zeina PCR adh, hmg, ssiib, invertasi Soia Nested PCR Lectina

54 Metodologie analitiche per il rilevamento di OGM negli alimenti 1) Ricerca ingrediente (specie vegetale) Per la soia: PCR lectina Neg DNAdi soia assente o non amplificabile POS 2) SCREENING GM

55 Metodologie analitiche per il rilevamento di OGM negli alimenti 1) Ricerca ingrediente (specie vegetale) Per il mais: PCR zeina Neg DNA di mais assente o non amplificabile POS 2) SCREENING GM

56 2) Screening GM Promotore 35S Terminatore NOS Promotori presenti nelle piante GM 23 1 P-35S 6 56 batterici P-nos 9 P-FMV 8 11 P-Ssu 22 P-TA29 altri nd Terminatori presenti nelle piante GM T-35S T-nos batterici T-E T-ocs 22 T-tml altri nd

57 Costrutti genici di alcuni eventi di trasformazione

58 Metodologie analitiche per il rilevamento di OGM negli alimenti 2) Screening GM Per la soia: PCR lectina Campione non GM Neg POS PCR 35S Neg DNAdi soia assente o non amplificabile PCR NOS POS Campione GM? 3) Identificazione evento GM

59 Metodologie analitiche per il rilevamento di OGM negli alimenti 2) Screening GM Per il mais: PCR zeina Neg Campione non GM Neg POS Neg DNA di mais assente o non amplificabile PCR NOS PCR 35S POS Campione GM? POS 3) Identificazione evento GM

60 3) Identificazione evento GM PCR Evento specifica OGM I PCR Evento specifica DNA Pianta P sequenza codificante T DNA Pianta PCR Costrutto specifica DNA Pianta P sequenza codificante T DNA Pianta PCR Evento specifica OGM II PCR Evento specifica

61 4) Quantificazione evento GM

62 4) Quantificazione evento GM 40 TC1507 System y = -3,196x + 37,625 R 2 = 0, CALIBRATORI 30 Ct CAMPIONE INCOGNITO 15 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 Log N copie

63 Metodologie analitiche per il rilevamento di OGM negli alimenti 3-4) Identificazione e quantificazione OGM Per la soia: PCR lectina Campione non GM Neg POS PCR 35S Neg DNAdi soia assente o non amplificabile PCR NOS POS Campione GM? qpcr RR Soglia 0,9%

64 Metodologie analitiche per il rilevamento di OGM negli alimenti 3-4) Identificazione e quantificazione OGM Per il mais: DNA di mais assente o non amplificabile Neg PCR zeina POS PCR NOS PCR 35S POS Neg Neg POS Campione non GM PCR Bt176 PCR Bt11 PCR T25 PCR MON810 qpcr POS Campione GM? Soglia 0,9% Mais VIETATO PCR NK603 PCR GA21 PCR StarLink Soglia 0,5%

65 Stato di avanzamento dei dossier di validazione del CRL

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