L analisi di SNP mediante AB7900
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- Cosimo Serafini
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1 QUALITA DELL ASSISTENZA: LE TECNICHE ISTOLOGICHE: DALLA FORMAZIONE DI BASE ALLA SPECIALIZZAZIONE NEL LABORATORIO DI ANATOMIA PATOLOGICA L analisi di SNP mediante AB7900 Emanuele Porcu Laboratorio di Genetica Molecolare, Patologia Cardiovascolare e dei Trapianti Fondazione I.R.C.C.S. Policlinico S. Matteo - Pavia
2 Polymerase Chain Reaction Primers and DNA Strand denaturation and primer annealing PCR Primer extension Dreischrittreaktion Denaturation 95 C Cycling: Exponential amplification of PCR products Annealing C Extension 72 C
3 Polymerase Chain Reaction Plateau phase PCR Product Linear phase Exponential phase End point analysis on agarose gels Cycles
4 Time Point of PCR Analysis 96 Replicas Variable plateau phase PCR Product High precision during exponential phase Cycles
5 La Tecnologia TaqMan TM UTILIZZA DUE OLIGONUCLEOTIDI E UNA SONDA INTERNA LA SONDA E LEGATA AD UNA MOLECOLA FLUORESCENTE ALL ESTREMITA 5 E AD UN QUENCHER ALL ESTREMITA 3. LA SONDA E BLOCCATA AL 3 IN MODO CHE NON POSSA FUNZIONARE COME PRIMER PER LA PCR LA SEQUENZA DELLA SONDA E COMPLEMENTARE AD UNA REGIONE DEL TRATTO DA AMPLIFICARE DURANTE LA PCR LA SONDA SI APPAIA AL DNA E VIENE DEGRADATA DALL ATTIVITA 5 ESONUCLEASICA DELLA Taq POLIMERASI PROVOCANDO IL RILASCIO DELLA MOLECOLA FLUORESCENTE.
6 Signal Generation TaqMan Probe The 5 -Nuclease Assay This method uses 2 principles: FRET Technology 5 - Nuclease Activity of the Taq Polymerase
7 5 Nuclease Assay using TaqMan probes FAM, VIC TAMRA 5 3 Forward Primer R TaqMan Probe p Q 5 5 PCR specificity (primer) Hybridization specificity (probe) Reverse Primer 3 5
8 5 Nuclease Assay using TaqMan probes 5 3 R p Q
9 5 Nuclease Assay using TaqMan probes 5 3 R R p Q Displacement
10 5 Nuclease Assay using TaqMan probes R 5 3 p Q 5 5 Displacement and Cleavage FRET disabled 3 5
11 5 Nuclease Assay using TaqMan probes R p Q Polymerization completed Signal generation
12 Quenching process Excitation FAM Reporter emission spectra and quencher excitation spectra overlap TAMRA FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer Emission
13 TaqMan MGB probes R MGB NFQ MGB MGB: Minor Groove Binder NFQ: Non-Fluorescent Quencher Stabilization of last 5-6 bp on 3 end Shorter and more specific probes for a given Tm
14 SNP: Single Nucleotide Polymorphism Gli SNP sono variazioni polimorfiche a livello del singolo nucleotide con una frequenza > 1% Rappresentano la classe più comune di varianti del DNA Possono essere associati a malattie monogeniche o a polimorfismi molecolari
15 Allelic Discrimination What is a SNP? AD Allele 1 Allele 2 5 -GTCGTACGTCAGTCCG-3 3 -CAGCATGCAGTCAGGC-5 5 -GTCGTACTTCAGTCCG-3 3 -CAGCATGAAGTCAGGC-5 Single Nucleotide Polymorphism Allelic frequency of minor allele > 1% Usually two alleles present ( bi-allelic markers )
16 Why investigating SNPs? AD SNPs with biological effect Drug metabolism ( Pharmacokinetics ) e.g. Cytochrome p450 Direct cause of disease e.g. Factor V Leiden, sickle-cell anaemia SNPs used as genetic markers Association studies Linkage mapping
17 R R Q P Q P MGB MGB Presence of Allele 1 R Q P MGB R Q P MGB Presence of Allele 2
18 Presence of Allele 1 Q Presence of Allele 2 P MGB MGB MGB Q Q MGB R Q P R
19 Allele Calling End Point Analysis AD Genotype Allele Signal FAM VIC Homozygous 1/1 Homozygous 2/2 Heterozygous 1/2
20 ABI PRISM 7900HT SDS
21 Inside the instrument
22 Data Acquisition one data point per well each all 7 to 10 seconds important: data acquisition only in defined wells Size of run files: approx. 20 MB for 384 well block approx. 4 MB for 96 well block Side view Front view
23 Dyes: SYBR Green 1 Dye FAM TET VIC JOE NED TAMRA ROX 528 nm 530 nm 540 nm 554 nm 554 nm 576 nm 582 nm 610 nm
24 Spectral Overlap 500 nm 660 nm
25 Amplification Plot View Reporter Signal Semilog and linear
26 Quantificazione assoluta: campione omozigote
27 Quantificazione assoluta: campione eterozigote
28 Discriminazione allelica: i risultati Mutati Eterozigoti Wt
29 Applicazioni della Tecnologia TaqMan PCR quantitativa Assoluta (es. viremie) Relativa (es. espressione genica) End point (es. genotipizzazione)
30 I supporti dell ABI7900 Blocco da 96 pozzetti Blocco da 384 pozzetti MFC: Micro Fluidic Card
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36 384 spots
37 TaqMan Assays pre-loaded 384 spots 1 to 8 Samples 12 to 380 Genes (per one array) No. of Replicates
38 I geni modificatori Utilizzo del sistema ABI7900 per lo studio di polimorfismi nei geni ADRB1 e ADRB2 in pazienti affetti da Sindrome di Marfan
39 Marfan Syndrome Malattia genetica del tessuto connettivo, a trasmissione autosomica dominante Incidenza: circa 1 di %dei casi: mutazioni de novo Outcome e l attesa di vita: legati al coinvolgimento cardiovascolare Malattia monogenica causata da difetti del gene della fibrillina 1
40 Il gene della Fibrillina 1: uno dei nostri geni più grandi Deduced pre-fibrillin: AA Ex 11-63: 49 cys-rich repeats 1 aminoter. Title 64,65 carboxyter. EGF EGFcb TGFbeta1 binding protein hybrid motif proline-rich
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42 La diagnosi si ottiene combinando insieme i segni clinici, criteri maggiori e minori La diagnosi molecolare è un criterio maggiore: Diagnosi molecolare significa identificare il difetto del gene che causa la malattia Spesso i difetti sono privati : questo dipende dalla limitata diffusione della diagnostica molecolare
43 Beta-1-Adrenergic Receptor Gene Map Locus 10q24-q26 Ser49Gly (A G) Arg389Gly (G C)
44 Beta-2-Adrenergic Receptor Gene Map Locus 5q32-q34 T -19C Arg16Gly (A G) Gln27Glu (C G) Thr164Ile (C T) Ser220Cys (C G)
45 Ser49Gly Arg389Gly Exon 1-19 C/T Arg16Gly Gln27Glu Thr154Ile Ser220Cys Exon 1
46 EMOCROMATOSI EREDITARIA (HH): basi genetico-molecolari
47 EMOCROMATOSI EREDITARIA (HH) Malattia genetica caratterizzata da sovraccarico di ferro da iperassorbimento intestinale OMIM # (Online Mendelian Inheritance in Man, E una delle malattie autosomiche recessive più comuni nella popolazione caucasica (prevalenza: 2-5/10000).
48 Cause genetiche dell Emocromatosi Ereditaria Gene responsabile della forma più comune: HFE localizzato sul braccio corto del cromosoma 6, si trova molto vicino ai geni HLA, cioè ai geni che determinano l'istocompatibilità. Contiene l'informazione per la produzione di una proteina importante nella regolazione dell'assorbimento del ferro, anche se la sua funzione esatta è ancora oggetto di studio. Nelle persone affette da EC, questo gene presenta delle alterazioni (mutazioni) che ne alterano la funzione.
49 Gene HFE (Totaro et al, Genomics 1996) Mappato nel 1996 ha fornito notevoli progressi nella comprensione della patofisiologia dell HH. Localizzato sul braccio corto del chr 6 (6p21.3), in prossimità dei geni HLA
50 Mutazioni del gene HFE Le due mutazioni più frequenti del gene HFE sono: C282Y H63D
51 L identificazione del gene HFE: Ha permesso lo sviluppo di un valido test genetico su prelievo di sangue periferico, che consente in molti casi, di diagnosticare la malattia senza indagini invasive (biopsia epatica).
52 Malattie cardiovascolari e genetica M. monogeniche Con coinvolgimento di un singolo organo Sindromi Fenotipi criptici Eterogeneità fenotipica e genotipica I geni modificatori Malattie multifattoriali o tratti complessi
53 Le tecniche di diagnostica molecolare hanno trovato applicazione in quasi tutti i campi della patologia: Ricerca di mutazione ereditarie alla base dello sviluppo di malattie genetiche pre o post-natali Ricerca di mutazioni acquisite che provocano lo sviluppo dei tumori Diagnosi e classificazione delle neoplasie, specialmente quelle che originano dal sistema emopoietico Farmacogenetica Determinazione di relazione ed identita nei trapianti, prove di paternita e medicina forense
54 Genetica del cancro Eziologia multifattoriale, causate quindi dall interazione tra fattori genetici ed ambientali Il cancro è una malattia genetica della cellula somatica perché riguarda alterazioni del genoma, dovute all accumulo di mutazioni di specifici geni che promuovono la selezione clonale delle cellule ad elevato ritmo di crescita.
55 Conclusioni Vantaggi Possibilità di effettuare su di un unico sistema studi di profili di espressione genica e di genotipizzazione Possibilità di effettuare 96 o 384 test per esperimento Velocità di esecuzione del test Sensibilità > 95% Traslazione efficace delle metodiche dalla ricerca alla pratica diagnostica
56 Conclusioni Svantaggi Costo del sistema e dei reagenti Necessità di avere dei sistemi per la validazione dei casi dubbi (sequenziamento automatico diretto) Necessità di un contesto con una adeguata strumentazione di supporto genetico-molecolare
57 Laboratorio di Genetica Molecolare, Patologia Cardiovascolare e dei Trapianti Eloisa Arbustini Maurizia Grasso Marta Diegoli Eliana Disabella Marilena Tagliani Nicola Marziliano Silvia Ansaldi Claudia Lucchelli Andrea Pilotto
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