Dai raggi-x alla progettazione di farmaci: le radici matematiche e fisiche della biologia del XXI secolo
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- Mirella Pinna
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1 Dai raggi-x alla progettazione di farmaci: le radici matematiche e fisiche della biologia del XXI secolo Martino Bolognesi Dipartimento di BioScienze Università di Milano 1
2 -VITA ORDINE, ORGANIZZAZIONE, COMPLESSITA - LA MATERIA BIOLOGICA E UNA MANIFESTAZIONE DEI PRINCIPI FONDAMENTALI DELLA FISICA E DELLA CHIMICA, CHE IN QUESTO CASO RAGGIUNGONO COMPLESSITA MASSIME - OGGI DISPONIAMO DI APPROCCI MULTI- DISCIPLINARI PER STUDIARE LA MATERIA E I PRINCIPI FONDAMENTALI DELLA BIOLOGIA 2
3 PERCHE LE PROTEINE? - Le proteine sono gli attuatori della cellula - Disponibilita di nuovi strumenti (sincrotroni, super-computing, microscopie) - La material biologica a risoluzione atomica - Le sfide della biologia moderna (biochimica, genomicsa, proteomica, ) - Applicazioni (farmaci, biotecnologie, biosensori ) 3
4 La complessita strutturale delle proteine 4
5 Nuovi strumenti per lo studio della materia biologica Microscopie ottiche (200 nm) microscopia a Forza Atomica (1 nm) Diffrazione di elettroni NMR Microscopie elettroniche Diffrazione di raggi-x (0.5 nm) (0.5 nm) (0.1 nm) (0.05 nm) - 1 nm = 10-9 m - 5
6 Raggi-X Microscopia a livello atomico risolve gli atomi La risoluzione della struttura 3D avviene in maniera indiretta, attraverso la misura di diagrammi di diffrazione La risoluzione delle strutture 3D richiede un approccio computazionale intensivo, spesso abbinato a metodi di simulazione computazionale. 6
7 I metodi della bio-cristallografia Ribosoma protein atoms RNA atoms 7
8 Premi Nobel per la Chimica 2009 V. Ramakrishnan T.A. Steitz A.E.Yonath (Courtesy 8
9 Cristalli di diverse proteine di interesse biotecnologico 9
10 Cristalli di proteine: molecola Cella elementare Unita asimmetrica symmetry cristallo Cristallo volume 0.1 mm 3 Cella elem. > 100 Å Contenuto solvente 30% - 80% v/v Bassa stabilita meccanica (E stab. < 10 kcal/mol) 10
11 Crescita di cristalli: Variazione di parametri chimico-fisici che influenzano la solubilita delle proteine forza ionica (conc. sali) ph temperatura concentrazione proteica additivi (molecole organiche) costante dielettrica del solvente gravità 11
12 Approcci robotici alla crescita di cristalli 12
13 L vs. nl 13
14 Crescita di cristalli in micro-gravita (Stazione Spaziale Internazionale) ASI - NASA 14
15 Microgravità: In assenza di moti convettivi: Maggiore ordine intrinseco Minore formazione di nuclei Minore incorporazione di contaminanti 15
16 L esperimento di diffrazione 16
17 Apparato per Diffrazione di raggi-x 17
18 ESRF - Grenoble - F SORGENTI DI RAGGI-X ELETTRA - Trieste 18
19 Radiazione di sincrotrone 19
20 Stazione sperimentale ad ESRF = Å ( kev) 9.6 < E < 14.5 kev Beamsize m d max = 0.97 Å 20
21 Diffrazione di raggi-x da parte di un cristallo: raggi X I hkl 2 h = 2, k = 1, l = 0 h = 1, k = 3, l = 0 cristallo detector 2d hkl sin = n (Bragg s eqn.) 21
22 Perche i sincrotroni? e 4 V x I (hkl) = I o 3 ALP F 2 (hkl) m 2 c 4 V c
23 Il «problema della fase»? I hkl (x,y,z) 23
24 Il «problema della fase» I hkl F hkl 2 N atomi F hkl = f j exp [2 i(hx j + ky j + lz j )] = F hkl exp (i hkl ) j= 1 Fattore di struttura Densità elettronica F hkl = (x,y,z) exp [2 i(hx+ky+lz)] dv Vcell 1 (x,y,z) = F hkl exp [-2 i(hx+ky+lz- hkl )] V hkl i P F f 1 f 2 f 3 r Non misurabile sperimentalmente 24
25 Dal cristallo alla struttura 3D un processo lineare 25
26 Legame di molecole/farmaci a proteine N C 26
27 Strutture 3D presenti nel Protein Data Bank applicazioni discovery
28 UNA VISONE DEL PRESENTE La ricerca di farmaci antivirali
29 La battaglia contro le malattie infettive ha allungato la vita media dell uomo Nell Inghilterra di metà 800 il 60% delle morti era dovuto a malattie infettive 29
30 Il dilagare di malattie infettive Ebola deaths Figures up to 3 February ,019 Deaths - probable, confirmed and suspected (Includes one in the US and six in Mali) 3,746 Liberia 3,301 Sierra Leone 1,957 Guinea 8 Nigeria Source: WHO 30
31 Il Progetto SILVER EU HEALTH-2010 Collaborative Project 31
32 Norovirus una minaccia per la salute nei paesi tropicali e non solo Il Norovirus (NV) e una delle principali cause di malattie trasmesse attraverso il cibo, ed e causa di morbidità e mortalità particolarmente tra i bambini delle regioni tropicali. NV e altamente infettivo e non esiste un vaccino. 32
33 Bersagli di farmaci nel genoma di NV (ca. 7.4 kb) La RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) e uno dei bersagli piu interessanti in quanto: - enzima essenziale per la replicazione del virus - enzima non presente nell uomo. 33
34 Diversi cristalli di RdRp di NV, preparati sotto opportune condizioni sperimentali, sono stati utilizzati per le analisi cristallografiche sulla struttura 3D dell enzima Mastrangelo et al. J.Mol.Biol. (2012) 34
35 Norovirus RdRP umana Norovirus RdRp murina 35
36 Ricerca di ligandi tramite simulazioni computazionali Volume esplorato I composti migliori selezionati presentano (alla simulazione) energie di legame all enzima favorevoli. Quindi potrebbero agire da inibitori bloccando l attivita dell enzima (e la replicazione del virus) 36
37 Due potenziali inibitori della RdRP di NV NF023 Suramin
38 Caratterizzazione in vitro * L analisi biochimica ha confermato che Suramina e NF023 si legano alla RdRp e la inibiscono (Drug Hit) 38
39 Una serie di studi cristallografici ha permesso di studiare il modo di legame degli inibitori alla RdRp e progettare modifiche chimiche delle molecole che le rendano «Drug LEADS» 39
40 40
41 41 Croci, et al. (2014) PloS one 9, e91765
42 Phe 29 Amido group 1 Lys 419 Tyr 418 Arg 436 Arg 392 Gln 414 Gln 439 Arg 393 Cpd6 legato in prossimita del dominio Thumb di mrdrp. 42
43 IC 50 (nm) MNVRdRp hnvrdr Suramin 70±3 27±3 p Cpd3 200± ±70 Cpd4 160±7 1100±20 0 Cpd6 115± ±90 Cpd7 160±6 1100±50 Cpd 8 60±4 28±4 Cpd6 legato alle RdRp murina e umana (strutture 3D sovrapposte) 43
44 Principi dedotti per l inibizione di NV RdRP a partire dalle analisi cristallografiche e biochimiche. Gli inibitori da noi studiati: a) Bloccano l accesso di NTP al sito attivo per effetti sterici ed elettrostatici. b) Limitano il corretto posizionamento dei NTP bloccando la formazione di RNA c) Inteferiscono con il posizionamento del dsrna e limitano la via di uscita della catena nascente di RNA dall enzima. 44
45 45
46 Mario Milani Eloise Mastrangelo Michela Bollati Federica Cossu Delia Tarantino Margherita Pezzullo Romina Croci Louise Gourlay Patricia Lassaux Marco Nardini Lucia Perletti Riccardo Villa Francesca Pedretti Stefano Ricagno Levon Chant Halabelian Matteo DeRosa Dip. BioScienze U. MILANO IBF-CNR MILANO 46
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