È necessario. 1. Isolare il segmento di DNA: 2. Moltiplicare il segmento di DNA: 3. Studiare la sequenza nucleotidica

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1 18. BIOTECNOLOGIE contiene materiale protetto da copyright, ad esclusivo uso personale; non è consentita diffusione ed utilizzo di tipo commerciale DNA RICOMBINANTE permette di - ottenere brevi segmenti di DNA - moltiplicarli - studiarne la sequenza nucleotidica - trasferirli nel genoma di altre cellule controllandone l incorporazione e l espressione Si ottengono proteine copiate da quelle già esistenti ma anche nuove proteine, più termostabili, meno tossiche etc mutagenesi mirata 1

2 È necessario 1. Isolare il segmento di DNA: 2. Moltiplicare il segmento di DNA: 3. Studiare la sequenza nucleotidica 4. Trasferire il DNA nel genoma di altre cellule 5. Controllarne incorporazione ed espressione. 1. Come si ottengono brevi segmenti di DNA? Grazie a degli enzimi di restrizione: anche detti endonucleasi di restrizione consentono di tagliare il DNA in frammenti NON casuali, la cui grandezza dipende unicamente dalla sequenza 2

3 3

4 Le sequenze riconosciute dagli enzimi di restrizione sono dette PALINDROMI 5 - GAATTC CTTAAG Sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti - Riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze palindromiche di 4, 6 o 8 nucleotidi). Hae III 5 GGCC 3 3 CCGG 5 Eco RI 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 Not I 5 GCGGCCGC 3 3 CGCCGGCG 5 4

5 Si possono generare diversi tipi di estremità: - COESIVE - PIATTE Eco RI= 5 protruding -GAATTC- -G 3 5 AATTC- -CTTAAG- -CTTAA 5 3 G- Eco RV= blunt -GATATC- -GAT 3 5 ATC- -CTATAG- -CTA 5 3 TAG- Pst I= 3 protruding -CTGCAG- -CTGCA 3 5 G- -GACGTC- -G 5 3 ACGTC- estremità coesive 5

6 DNA ligasi 6

7 2. Come ottenere copie multiple? due tipi di tecniche: Clonazione del DNA Reazione a catena della polimerasi (PCR) 7

8 Clonazione del DNA 1. Isolamento del frammento di DNA di interesse (DNA genomico, di sintesi, cdna) 2. Unione del frammento di DNA ad un ve-ore di clonaggio 3. Trasferimento del ve=ore ricombinante alla cellula ospite 4. Iden5ficazione delle cellule che contengono la molecola ricombinante VETTORI PLASMIDI FINO A bp FAGI bp COSMIDI bp CROMOSOMI ARTIFICIALI DI BATTERI (BAC) CROMOSOMI ARTIFICIALI DI LIEVITO (YAC) bp bp 8

9 Proprietà di un vettore di clonaggio 1. Si replicano autonomamente in E.Coli anche se contengono frammenti di DNA estraneo poiché hanno una loro origine di replicazione 2. Possono essere facilmente separati dal DNA batterico e purificati 3. Contengono regioni di DNA non essenziali per la propagazione nei batteri che possono essere sostituite o interrotte dall inserzione di DNA estraneo Caratteristiche ideali degli ospiti per il clonaggio 1. Crescita rapida 2. Capacità di crescita in terreni di coltura poco costosi 3. Non patogenicità 4. Capacità di essere trasformato con DNA PLASMIDI 9

10 Caratteristiche dei plasmidi l l l sequenza ORI marcatore selettivo (gene amp) sito di taglio per un enzima di restrizione 10

11 TAPPE CARATTERISTICHE DI UN CLONAGGIO 1- DIGESTIONE (Taglio del DNA da clonare e del vettore di clonaggio) 2- LIGAZIONE (Unione del DNA da clonare e del vettore di clonaggio) 3- TRASFORMAZIONE (inserimento clone in cellula ospite) 4- PIASTRAMENTO (replicazione dei cloni in terreno nutritivo) 5- SELEZIONE ( riconoscimento dei ricombinanti). 11

12 La capacità di trasferire geni da un organismo ad un altro è alla base di tutte le tecniche di ingegneria genetica. L introduzione di materiale genetico eterologo, cioè proveniente da un altro organismo, in una cellula viene definita TRASFORMAZIONE. Reazione a catena della polimerasi (PCR) scoperta nel 1984 da Kary Mullis 12

13 Un ciclo di PCR è costituito dalle seguenti tre fasi: 1.Separazione dei filamenti (denaturazione). 2.Ibridazione dei primer (detta anche fase di annealing o ancoraggio). 3. Sintesi del DNA. Trenta cicli incrementano la quantità di DNA di oltre un miliardo di volte!!! 13

14 Differenze tra clonaggio genico e PCR Conoscenza sequenza genica Tempi di realizzazione Lunghezza DNA amplificato Clonaggio genico Non necessaria Lunghi Variabile (anche molto grande) PCR Necessaria Molto brevi Limitata Accuratezza Elevata Bassa Rischi contaminazione Bassi Elevati 3. Come determinare le sequenze nucleotidiche? Elettroforesi sequenziamento 14

15 Separazione di frammenti di DNA per elettroforesi su gel Analisi di frammenti di DNA clonati in plasmide per digestione ed elettroforesi Applicazioni della tecnologia del DNA ricombinante Mappatura del genoma Analisi della funzione dei geni attraverso la clonazione genica Produzione a basso costo di vaccini più innocui Produzione di proteine di interesse umano da parte dei microrganismi Terapia genica Creazione di organismi transgenici 15

16 Mappatura del genoma conoscenza completa della sequenza di un genoma permette di avere informazioni dettagliate su ciascuna regione cromosomica. plasmids viruses bacteria fungi plants algae insects mollusks bony fish Il Genoma umano è costituito da circa 3 miliardi di bp e contiene un numero di geni (ancora imprecisato) pari a circa 25,000. amphibians reptiles birds mammals terapia genica Le principali classi di malattie che possono essere trattate con la terapia genica comprendono: malattie infettive; tumori malattie ereditarie; malattie del sistema immunitario 16

17 EX- VIVO Le cellule sono prelevate per inserirvi in vitro il materiale genetico e poi reintrodotto nel paziente IN VIVO Il materiale è trasferito nelle cellule direttamente nel paziente 17

18 Prodotti biotecnologici Organismi Geneticamente Modificati - OGM 18

19 PRODUZIONE di ANIMALI TRANSGENICI 1. Utilizzo di vettori retrovirali,capaci di infettare le cellule embrionali prima dell'impianto in una femmina ricettiva 2. Microiniezione del DNA nel pronucleo maschile di un uovo fertilizzato 3. Introduzione di cellule staminali geneticamente manipolate in embrioni prima dell' impianto nella femmina ricettiva. vettori retrovirali infezione di embrioni con un retrovirus che trasporta il gene di interesse. svantaggi - non è possibile inserire frammenti di DNA maggiori di 8 Kb - difettivi per la replicazione: necessitano di un virus aiutante per la produzione di grandi quantità di DNA vettore; può succedere che si integri però il DNA del virus aiutante che verrebbe così prodotto dall'organismo transgenico: in tali condizioni non potrebbe essere destinato al commercio o all'uso alimentare. 19

20 Introduzione di cellule staminali Sostituzione genica nei topi Se gene viene inattivato: topi knockout Ex elicasi mutata: Invecchiamento precoce Animali transgenici vantaggi Creazione di beshame resistente alle malaje. Bio- indicatori di agenh inquinanh. Produzione di la=e a basso contenuto di la=osio o contenente proteine topi. di interesse farmacologico. Studiare le conoscenze del genoma e le malaje umane. XenotrapianH e produzione di emoglobina umana. Zootecnia Topi Pecore, bovini, suini, Topi, raj. Suini 20

21 XenotrapianH Animali transgenici rischi Distruzione della fauna locale Degradazione dell'ambiente circostante con disturbi degli equilibri naturali. Degradazione genica in seguito all'introduzione in specie selvahche di un gene che può scomparire o essere selezionato a discapito di altri specie endemica. Piante transgeniche 21

22 IMPORTANTE caratteristica delle cellule vegetali: TOTIPOTENZA possibilità di rigenerare un intera pianta da singole cellule differenziate Piante Transgeniche - Tolleranti agli erbicidi (mais, bietola, soia) - Resistenti agli insetti (mais, patata, pomodoro) - resistenti ai virus (mais, pomodoro, bietola) - resistenti ai funghi (tabacco) - con prodotto modificato nella composizione (olio di colza) nella maturazione (pomodoro) nell arricchimento di amido (patata) 22

23 Piante resistenti ex resistenza ai batteri - Inserimento ed espressione del gene per la protossina del batterio Bacillus thuringiensis capace di uccidere diverse specie di insetti. - Inserimento ed espressione dei geni per inibitori di proteasi o di amilasi che interferiscono con l'idrolisi delle proteine vegetali o dell'amido così che l'insetto non è capace di digerire il cibo. Modificazione dei valori nutrizionale Aggiunta di vitamine : Golden Rice arricchito in beta- carotene Aumento del contenuto in ferro: ferritina della soia in piante di riso transgeniche: contenuto in ferro 3 volte > Modifica della composizione in acidi grassi : nelle piante produttrici olio. Ex. Oli di colza: diversi e modificati in base agli impieghi commerciali. Variazione del sapore di frutti e verdure: ex. Fragola: proteina responsabile del passaggio del saccarosio al frutto mentre questi matura: 23

24 Impiego industriale Amflora: patata transgenica che contiene solo amilopectina perdisattivazione del gene responsabile della sintesi di amilosio. usata per scopi industriali e per alimentazione animale. Pigmentazione dei fiori Ex crisantemi transgenici Con RNA Interference inibizione della calcone sintasi, enzima chiave nella formazione delle antocianine (classe di flavonoidi) pigmenti più comuni dei fiori con colori differenti al variare di catene laterali di diversa struttura chimica. 24

25 Proteine ricombinanti umane con valore terapeutico prodotte in piante Vaccini ricombinanti prodotti nelle piante Pericoli? FDA: se prodotti NON sono molto diversi da quelli in mercato, non bisogna fare alcun test MA OGM può contenere proteine tossiche o essere causa di allergie e trasmettere nuovi geni ad altre piante 25

26 VANTAGGI PIANTE OGM minor uso dei pesticidi maggior produttività e + alimenti per i paesi poveri miglioramento caratteristiche qualitative dei vegetali e dei frutti RISCHI PIANTE OGM ECOLOGICI: trasferimento accidentale del nuovo gene a piante non modificate, crescita invasiva, pericolosità verso altri viventi, resistenza agli antibiotici SANITARI: trasmissione all uomo di resistenza agli antibiotici, eventuale tossicità prodotti, e maggiori allergie applicazioni BIOTECNOLOGIE Medicina umana Veterinaria zootecnia Agricoltura chimica 26

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