Istologia e citologia.

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1 Rend. Fis. Acc. Lincei s. 9, v. 15: (2004) Istologia e citologia. Studio quantitativo al microscopio elettronico delle giunzioni gap degli involucri gliali perineuronali dei gangli spinali nel corso dell invecchiamento. Nota di CARLA MARTINELLI, SIMONA DE PALO, MARIA LEDDA e ENNIO PANNE- SE, presentata (*) dal Socio E. Pannese. ABSTRACT. Gap junctions within perineuronal satellite cell sheaths. Quantitative changes during ageing. The gap junctions between perineuronal satellite cells were studied in the spinal ganglia of 12, 42, and 79 month-old rabbits. The mean number of gap junctions per 100 mm 2 of surface of the section occupied by satellite cells was significantly greater in old rabbits than young adults. Since the mean length of individual gap junctions did not change with age, the increase in number of gap junctions cannot be due to fragmentation of pre-existing gap junctions but is very likely due to the formation of new gap junctions. The increase in number of gap junctions cannot be related to an increase in number of perineuronal satellite cells since the mean number of these cells is significantly smaller in aged rabbits than in young adults. It is suggested that the increase in number of gap junctions with age may enhance the suggested neuroprotective role of satellite cells towards ganglionic neurons. The present findings, together with previous observations, suggest that the gap junctions between perineuronal satellite cells are dynamic structures, able to adapt to varying neuronal demands and varying environmental conditions. KEY WORDS: Dorsal root ganglia; Peripheral neuroglia; Intercellular junctions; Ageing; Oryctolagus cuniculus. RIASSUNTO. Le modificazioni quantitative delle giunzioni gap che collegano le cellule satelliti perineuronali dei gangli spinali sono state studiate al microscopio elettronico in conigli di 12, 42 e 79 mesi. Il numero medio di tali giunzioni per 100 mm 2 di area di sezione occupata dalle cellule satelliti è risultato significativamente maggiore nei conigli vecchi rispetto a quelli giovani adulti, mentre la lunghezza media di tali giunzioni non è risultata significativamente diversa nelle varie età prese in considerazione. L aumento del numero delle giunzioni gap non può quindi essere dovuto alla frammentazione di giunzioni preesistenti, ma dipende verosimilmente dalla formazione di nuove giunzioni. L aumento del numero delle giunzioni non è legato nemmeno all aumento del numero delle cellule satelliti perineuronali, poiché il numero medio di tali cellule è significativamente minore nei conigli vecchi rispetto a quelli giovani adulti. Viene avanzata l ipotesi che l aumento del numero delle giunzioni gap con l età possa accrescere l efficacia del ruolo neuroprotettivo che può essere attribuito alle cellule gliali satelliti per analogia con il ruolo svolto dalle cellule della nevroglia nel sistema nervoso centrale. I risultati della presente ricerca, se considerati assieme ad altri ottenuti in precedenza, fanno ritenere che le giunzioni gap fra le cellule satelliti siano strutture dinamiche, che si adattano al variare delle richieste dei neuroni e al variare delle condizioni ambientali. INTRODUZIONE Recentemente alcuni studi hanno preso in esame le modificazioni che si verificano nelle cellule gliali perineuronali dei gangli spinali (abitualmente denominate cellule satelliti) nel corso dell invecchiamento (Ledda et al., 1999, 2003; Martinelli et al., 2003). Tuttavia, per quanto ci risulta, non sono state ancora studiate le eventuali modificazioni delle giunzioni gap che collegano le suddette cellule (Pannese, 1974; Lieberman, 1976; Pannese et al., 1978; Pannese, 1981). (*) Nella seduta del 23 aprile 2004.

2 226 C. MARTINELLI ET AL. In considerazione del ruolo di sostegno al metabolismo del neurone svolto dalle cellule satelliti (per maggiori dettagli, si veda Pannese, 1981, 1994) e del ruolo che le giunzioni gap svolgono nella diffusione di sostanze e nella propagazione di segnali fra cellule adiacenti (per es., si vedano Sheridan e Atkinson, 1985; Dermietzel et al., 1990; Wolburg e Rohlmann, 1995; Bruzzone et al., 1996; Bruzzone e Ressot, 1997), ci siamo proposti di colmare la suddetta lacuna. MATERIALE E METODI Furono utilizzati 3 conigli (Oryctolagus cuniculus) di 12 mesi (peso 3,4-3,5 kg), 3 conigli di 42 mesi (peso 3,6-3,8 kg) e 3 conigli di 79 mesi (peso 4,0-4,2 kg). Poiché la durata della vita di un coniglio sano è di mesi (Harkness e Wagner, 1983) o di mesi (Weisbroth et al., 1974), i conigli di 12 mesi sono da considerare giovani adulti, quelli di 42 mesi sono da considerare di età intermedia e quelli di 79 mesi sono da considerare vecchi. Inoltre, si ritiene generalmente che l inizio della senescenza corrisponda al termine del periodo fertile. Poiché normalmente i conigli femmina non sono più fecondi dopo il 607 mese di vita, anche da questo punto di vista i conigli di 79 mesi utilizzati per la presente ricerca sono da considerare vecchi. Dopo essere stati anestetizzati con Nembutal (80 mg/kg), gli animali furono perfusi con una soluzione di formaldeide (2%) e glutaraldeide (2%) in tampone sodio cacodilato (0,1 M, ph 7,3). Dopo 3 h di fissazione, i gangli spinali toracici furono prelevati, postfissati in OsO 4 (2%), disidratati e quindi inclusi in una miscela di Epon-Araldite. La qualità della fissazione di ciascun ganglio fu controllata sia al microscopio ottico, sia al microscopio elettronico. Per la presente ricerca furono utilizzati solamente i gangli la cui struttura risultava preservata in modo ottimale e nei quali sia i neuroni, sia gli involucri di cellule satelliti non mostravano segni di rigonfiamento o di coartazione. In totale furono utilizzati 72 gangli (8 per ciascun animale). La ricerca fu eseguita su sezioni a orientamento casuale (isotropic uniform random, IUR), ottenute con il procedimento denominato orientator (Mattfeldt et al., 1990). Per ciascun ganglio, una sola sezione sottile IUR (di circa 0,15 3 0,10 mm) fu fotografata in tutta la sua estensione al microscopio elettronico; i negativi (80003) furono stampati ad un ingrandimento finale di Per ciascuna sezione furono utilizzate stampe, che furono giustapposte in modo da riprodurre interamente la sezione. L area di sezione dell involucro di cellule satelliti corrispondente a ciascun corpo neuronale fu misurata per mezzo di una tavoletta grafica collegata a un calcolatore. Per ciascun ganglio furono poi determinati: 1) il numero medio di giunzioni gap presenti in 100 mm 2 di area di sezione occupata dalle cellule satelliti; 2) la lunghezza media di tali giunzioni. Per stabilire se fra i valori ottenuti nei tre conigli appartenenti a ciascuna classe di età esistessero o non differenze significative fu utilizzato un test di omogeneità della varianza. Successivamente furono confrontati i valori ottenuti per ciascuna classe di età; questi confronti furono effettuati con il test t di Student (limiti di confidenza al 99%), utilizzando un programma di statistica (Statgraphics software STSC) inserito in un calcolatore.

3 STUDIO QUANTITATIVO AL MICROSCOPIO ELETTRONICO RISULTATI E DISCUSSIONE Giunzioni gap sono state osservate fra le cellule satelliti appartenenti al medesimo involucro perineuronale, mentre non sono mai state trovate fra il corpo del neurone e le cellule satelliti che lo avvolgono. La struttura di tali giunzioni corrispondeva a quella descritta in letteratura. Il numero medio di giunzioni gap per 100 mm 2 di area di sezione occupata dalle cellule satelliti aumentava con l avanzare dell età (fig. 1). Il numero medio delle giunzioni gap presenti nei conigli vecchi era significativamente maggiore (p < 0,01) di quello determinato negli animali giovani adulti. La lunghezza media delle giunzioni, invece, non era diversa nelle tre classi di età (fig. 2). Dal momento che la lunghezza media delle giunzioni gap non variava con l età, l aumento del numero di tali giunzioni che si verifica con l avanzare dell età non può essere dovuto alla frammentazione di giunzioni preesistenti, ma dipende verosimilmente dalla formazione di nuove giunzioni. La formazione di nuove giunzioni non è legata a un aumento del numero delle cellule satelliti perineuronali, poiché il numero medio di tali cellule è significativamente minore nei conigli vecchi rispetto a quelli giovani adulti (Pannese et al., 1997). Si può quindi concludere Fig. 1. Istogramma che mostra il numero medio (No) di giunzioni gap per 100 mm 2 di area di sezione occupata dalle cellule satelliti perineuronali nei conigli giovani adulti (G), di età intermedia (I) e vecchi (V). Le differenze fra G e I e fra I e V non sono significative, mentre la differenza fra G e V è significativa (p < 0,01). Il segmento verticale situato alla sommità di ciascuna colonna indica l errore standard.

4 228 C. MARTINELLI ET AL. Fig. 2. Istogramma che mostra la lunghezza media (L) delle giunzioni gap fra le cellule satelliti perineuronali nei conigli giovani adulti (G), di età intermedia (I) e vecchi (V). Le differenze fra G e I, fra I e V e fra G e V non sono significative (p < 0,01). Il segmento verticale situato alla sommità di ciascuna colonna indica l errore standard. che, con l avanzare dell età, negli involucri di cellule satelliti perineuronali dei gangli spinali di coniglio si formano nuove giunzioni gap. Non ci risulta che le relazioni fra età e numero di giunzioni gap identificate con sicurezza al microscopio elettronico siano state studiate in altre regioni del sistema nervoso, per cui non è possibile confrontare i risultati da noi ottenuti nei gangli spinali con quanto si verifica in altri distretti del sistema nervoso. Agli involucri perineuronali di cellule satelliti dei gangli spinali sono state attribuite le seguenti funzioni (per ulteriori notizie si veda Pannese, 1981, 1994): 1) controllo del traffico di sostanze dirette al e provenienti dal neurone; 2) controllo della concentrazione ionica e dei livelli di aminoacidi neuroattivi nel microambiente di ciascun neurone; 3) sostegno al metabolismo del neurone. L aumento del numero delle giunzioni gap da noi osservato con l avanzare dell età potrebbe essere correlato all intensificazione di una o più di una delle suddette funzioni. È tuttavia possibile avanzare anche un altra ipotesi. Gli astrociti svolgono una funzione neuroprotettiva, come risulta dall osservazione che in vitro i neuroni sono meno danneggiati dai trattamenti neurotossici se vengono coltivati assieme ad astrociti (Mattson e

5 STUDIO QUANTITATIVO AL MICROSCOPIO ELETTRONICO Rychlik, 1990). Le giunzioni gap fra astrociti svolgono verosimilmente un ruolo in questa funzione neuroprotettiva: dopo esposizione a fattori che causano danni ossidativi, il blocco funzionale delle giunzioni gap fra astrociti è seguito infatti da un forte aumento di perossidi nei neuroni e da un aumento del numero di neuroni che degenerano (Blanc et al., 1998). È pertanto possibile che anche le cellule satelliti, che, come ricordato nell Introduzione, sono cellule gliali, svolgano una funzione di neuroprotezione. In tal caso, l aumento del numero delle giunzioni gap fra le cellule satelliti, che si verifica con l avanzare dell età, potrebbe essere interpretato come un meccanismo atto a proteggere più efficacemente i neuroni vecchi da lesioni ossidative o da altri tipi di lesioni. Il significativo aumento del numero delle giunzioni gap fra le cellule satelliti osservato dopo lesione degli assoni dei neuroni dei gangli spinali (Hanani et al., 2002; Pannese et al., 2003) e l altrettanto significativo aumento del numero di tali giunzioni osservato nella senescenza e descritto in questa Nota indicano che le giunzioni gap fra le cellule satelliti perineuronali sono strutture dinamiche, capaci di adattarsi al variare delle richieste dei neuroni e al variare delle condizioni ambientali. Come è noto, le giunzioni gap sono costituite da una famiglia di proteine denominate connessine. Mentre numerosi studi hanno permesso di identificare le connessine espresse dai diversi tipi di cellule del sistema nervoso centrale (per maggiori dettagli si vedano Dermietzel e Spray, 1993; Wolburg e Rohlmann, 1995; Bruzzone et al., 1996; Giaume e McCarthy, 1996; Spray et al., 1999; Nagy e Rash, 2000), non si sa quasi nulla sulle connessine espresse dalle cellule satelliti dei gangli spinali. L unico studio che è a nostra conoscenza ha indicato che le cellule satelliti che circondano i grandi neuroni del ganglio petroso sono immunopositive per la connessina43, mentre non lo sono le cellule satelliti che circondano gli altri neuroni del ganglio (Chen et al., 2002). Ulteriori studi saranno necessari per stabilire quali tipi di connessine sono presenti nelle cellule satelliti dei gangli spinali e se la quantità di tali proteine si modifica parallelamente all aumento del numero delle giunzioni gap dimostrato nella presente ricerca. BIBLIOGRAFIA BLANC E.M., BRUCE-KELLER A.J., MATTSON M.P., Astrocytic gap junctional communication decreases neuronal vulnerability to oxidative stress-induced disruption of Ca 21 homeostasis and cell death. J. Neurochem., 70: BRUZZONE R., RESSOT C., Connexins, gap junctions and cell-cell signalling in the nervous system. Eur. J. Neurosci., 9: 1-6. BRUZZONE R., WHITE T.W., PAUL D.L., Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling. Eur. J. Biochem., 238: CHEN J., HE L., DINGER B., STENSAAS L., FIDONE S., Chronic hypoxia upregulates connexin43 expression in rat carotid body and petrosal ganglion. J. Appl. Physiol., 92: DERMIETZEL R., SPRAY D.C., Gap junctions in the brain: where, what type, how many and why? Trends Neurosci., 16: DERMIETZEL R., HWANG T.K., SPRAY D.S., The gap junction family: structure, function and chemistry. Anat. Embryol., 182: GIAUME C., MCCARTHY K.D., Control of gap-junctional communication in astrocytic networks. Trends Neurosci., 19:

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