STUDIO DELL ATTIVITA ANTIOSSIDANTE IN MOLECOLE BIOATTIVE SOTTOPOSTE A DIFFERENTI TRATTAMENTI CHIMICO-FISICI

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TRIESTE FACOLTÀ DI FARMACIA Corso di Laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche TESI DI LAUREA SPERIMENTALE IN LEGISLAZIONE FARMACEUTICA STUDIO DELL ATTIVITA ANTIOSSIDANTE IN MOLECOLE BIOATTIVE SOTTOPOSTE A DIFFERENTI TRATTAMENTI CHIMICO-FISICI Laureanda : Elena SPESSOT Anno Accademico: Relatrice: Dott.ssa Antonella CALABRETTI Correlatore: Prof. Dario VOINOVICH

2 Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare l attività antiossidante di molecole bioattive, derivanti da matrici alimentari naturali. La scelta di queste matrici vegetali è stata determinata dall ampio consumo di alimenti di questo tipo, nella Dieta Mediterranea. Quest ultima un modello educativo alimentare per eccellenza, in quanto ha come obbiettivo la prevenzione di patologie croniche- degenerative (ictus, malattie cardiovascolari, ipercolestorelemie, obesità, diabete e tumori) attraverso una corretta e bilanciata alimentazione. Tant è vero che l Unesco, nel 2010, ha consacrato patrimonio culturale dell umanità il regime alimentare mediterraneo per i suoi sicuri benefici. Numerosi studi hanno dimostrato effetti protettivi nei confronti del tumore al seno. Infatti se tutte le donne adottassero una dieta più vicina a quella mediterranea, la possibilità di insorgenza del cancro al seno si ridurrebbe del 10%.La dieta mediterranea si basa sul consumo giornaliero di verdure, frutta e cereali, ossia prodotti ad elevata qualità sia dal punto di vista organolettico sia nutrizionale. In Italia, per sviluppare una coscienza alimentare sana, corretta e bilanciata al consumatore, si è deciso di promuovere ma anche facilitare lo schema alimentare mediterraneo grazie al principio dei 5 colori del benessere sostenuto da UNAPROA (Unione Nazionale tra le Organizzazioni di Produttori Ortofrutticoli Agrumari e di Frutta in Guscio). Il progetto consiste nel consumare giornalmente cinque porzioni di frutta e verdura di diverso colore: rosso, giallo-arancio, blu-viola e bianco; ad ogni gruppo di colore è caratterizzato dalla presenza di specifiche molecole bioattive.

3 Rosso Molecole bioattive Funzione Anguria, Arancia rossa, Antiossidante, Barbabietola rossa, Ciliegia, Fragola, Pomodoro, Carotenoidi, antiproliferativa, antitumorale, Ravanello, Rapa rossa antinfiammatoria Giallo- arancio Albicocca, Arancia, Carota, Clementina, Kaki, Limone, Antiossidante, Mandarino, Melone, Carotenoidi, flavonoidi. antiproliferativa, Nespola, Nettarina, Acidi fenolici antitumorale, Peperone, Pesca, antinfiammatoria Pompelmo, Zucca Verde Agretti, Asparagi, Basilico, Bieta, Broccoletti, Broccoli, Carciofo, Cavolo broccolo, Cavolo cappuccio, Cetriolo, Cicoria, Cime di rapa, Indivia, Kiwi, Lattuga, Lignani, querecetina polifenoli, Estrogenica, antinfiammatoria, antiossidante, antitumorale Prezzemolo Rughetta, Spinaci Uva, Zucchina Blu- viola Fichi, Frutti di bosco, Melanzane, Prugne, Radicchio, Uva nera Antocianine Procianidine e Antiossidante, antitumorale, cardioprotettiva Bianco Antiossidante, antiproliferativa, Aglio, Cavolfiore, Cipolla, antipertensiva,antitumorale, Finocchio, Funghi, Mela, Flavonoidi antitrombotica, arresto ciclo Pera, Porri, Sedano cellulare, inibizione ossidazione LDL, miglioramento vascolare. Per mantenere le specifiche proprietà e per non andare incontro ad alterazioni chimiche, fisiche o biologiche gli alimenti devono essere conservati e cotti attraverso tecniche tradizionali.

4 Negli ultimi anni la cottura di alimenti mediante il microonde è ormai diffusa sia livello industriale che domestico, soprattutto per i prodotti ad elevato contenuto di umidità per le proprietà dielettriche dell acqua che assorbe velocemente l energia a microonde. Alcuni vantaggi da considerare in questa tecnica sono:il minor tempo di starting ovvero dell inizio del trattamento, riscaldamento più veloce, ottimizzazione del solvente, cioè riduzione del consumo durante i processi industriali e gli alimenti conservano le loro qualità nutrizionali. Gli effetti negativi sull utilizzo dei forni a microonde possono essere l eventuale perdita di colore e sapore e nelle matrici alimentari di grande pezzatura, e il riscaldamento potrebbe essere non omogeneo. ANTIOSSIDANTI Antiossidanti esogeni Vitaminici Vitamina E Vitamina C Vitamina A Non vitaminici Carotenoidi (beta-carotene, licopene, luteina) Polifenoli (resveratrolo, idrossitirosolo, acidi fenolici, stilbeni, lignani, flavonoidi ). Catechine. Origine minerale Zinco Rame Selenio. Antiossidanti endogeni Vitaminici Acido lipoico : induce l attività di alcuni antiossidanti enzimatici. Enzimatici Superossidodismutasi -SOD Catalasi CAT Glutatione perossidasi. Perché sono importati gli antiossidanti? Perché hanno un potenziale effetto protettivo nei confronti dello stress ossidativo indotto dai radicali liberi È ormai noto che alla base delle patologie cronico degenerative, l invecchiamento cellulare la causa principale è dato dallo stress ossidativo e le difese degli antiossidanti.gli antiossidanti sono molecole che si suddividono in due gruppi endogeni ed esogeni presenti negli alimenti soprattutto della dieta mediterranea. Essi hanno un potenziale effetto protettivo nei confronti dello stress ossidativo, inibendo cosi i radicali liberi. Viste le proprietà fondamentali degli antiossidanti

5 l obbiettivo finale è quello di creare alimenti nutraceutici, quindi produrre alimenti funzionali arricchiti di sostanze benefiche (come i carotenoidi, i polifenoli, resveratrolo). La progettazione di un alimento funzionale, può essere ottenuta secondo metodiche di trattamento diverse per preservarne le molecole funzionali naturalmente presenti nell alimento. LO SCOPO DELLA TESI Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare l attività antiossidante di molecole bioattive, provenienti da matrici alimentari naturali trattate termicamente e/o tecnologicamente, mediante l utilizzo dell incapsulazione, al fine di migliorarne la stabilità, biodisponibilità e la solubilità senza che venga compromesso il valore nutrizionale. La ricerca si è suddivisa in varie fasi: 1. Determinazione dell attività antiossidante e attività polifenolica nelle matrici vegetali mediante metodi colorimetrici ABTS e DPPH e l attività polifenolica mediante il Folin- Ciocalteau. 2. Determinazione delle attività antiossidante nelle matrici vegetali sottoposte a trattamenti termici. 3. Pianificazione dello screening dei fattori del processo attivazione dello stato solido per la determinazione delle condizioni di processo ottimali e realizzazione delle prove sperimentali sulla base del Disegno sperimentale prescelto. 4. Analisi quali- quantitativa delle sostanze prescelte mediante UV. Per quanto riguarda la scelta delle matrici è stata effettuata tra gli alimenti più diffusi nella Dieta Mediterranea come il pomodoro, la zucca, gli infusi di tè verde, foglie d olivo, karkadè, rosa canina, e frutti rossi (lamponi, mirtilli) e i loro derivati.

6 MATERIALI E METODI I campioni alimentari scelti, per le loro ricche caratteristiche compositive, sono stati analizzati tal quali o come materie prime nella preparazione di alimenti più complessi, quindi salse, infusi, puree, liofilizzati. Ogni matrice alimentare è stata trattata secondo processi chimico-fisici conservando le proprietà iniziali. I campioni derivati del pomodoro (passate, doppio e triplo concentrato) e della zucca (Cucurbita maxima) sono stati sottoposti a due processi di trasformazione: la liofilizzazione e la cottura a microonde (potenze utilizzate sono state 300W, 500W e 750W). Gli infusi di tè verde, le foglie d olive, karkadè e rosa canina sono stati analizzati sia a temperatura ambiente sia a temperatura di 80 C. Infine, i campioni di frutti rossi (mirtillo, lamponi, e purea di frutti di bosco) non hanno subito trattamenti termici, ma fisici come la disidratazione e la micronizzazione. Successivamente, tutte le matrici alimentari sono state sottoposte a diverse procedure di estrazione e preparazione al fine di valutare quale permettesse di aumentare la resa in termini di: Contenuto di polifenoli (metodo di FOLIN-Ciocalteau) Attività antiossidante (mediante ABTS e DPPH) Determinazione della TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). Il metodo Folin-Ciocalteau Questa tecnica colorimetrica permette la determinazione del contenuto dei polifenoli totali.

7 Il reattivo di Folin- Ciocalteau è costituito da miscela di sodio tungstato e sodio molibdato che aggiunto al campione è in grado di assumere una colorazione blu proporzionale al numero di residui fenolici presenti. Nella procedura utilizzata, 1ml degli estratti precedentemente preparati è stato addizionato con 500µl di reattivo di Folin- Ciocalteau, e dopo 3 minuti è stato aggiunto 1ml di soluzione di carbonato di sodio al 7,5% (infuso di foglie d olivo), 10% (Karkadè) e 20% per le altre analisi. Ogni campione è stato portato a volume (10ml) con acqua distillata e lasciato a riposo a temperatura ambiente per un ora. La misurazione è stata effettuata mediante lettura allo spettrofotometro alla lunghezza d onda di 765 nm, utilizzando come riferimento la curva di calibrazione dell acido Gallico. ABTS e DPPH Entrambi i metodi colorimetrici si basano sulla capacità pro-ossidante che hanno i radicali liberi nei confronti di substrati facilmente ossidabili. Sono due tecniche dirette, stabili, facilmente riproducibili e ampiamente applicate per l individuazione dell attività antiossidante totale sulle matrici vegetali. Per questa procedura l ABTS (Acido 2,2-azinobis( 3- etibenzotiazolin -6- solfonico) deve essere attivato mescolando 5ml di ABTS (7mM) con 88 ųl di persolfato di potassio (140mM). Così la soluzione assume un intensa colorazione blu- verde. La miscela così ottenuta ha attivato l ossidazione dell ABTS, ma richiede un periodo di stabilizzazione di circa 16 ore, al buio e a temperatura ambiente. Successivamente, la soluzione è stata diluita in etanolo fino ad ottenere un assorbanza di 0,70± 0,02 ad una lunghezza d onda di 734 nm dello spettrofotometro. La soluzione cosi formata è utilizzata per le prove. Inoltre, l ABTS è stato utilizzato per valutare la TEAC espressa, come TROLOXequivalenti ovvero le mmoli di Trolox aventi attività antiossidanti pari 1mg di estratto

8 Invece, per la preparazione della soluzione madre del DPPH ( 2,2- diphenil -1-picryl- hydrazyl) 0,6 Mm sono stati pesati esattamente 23,660mg di DPPH e diluiti in 100ml di metanolo. La soluzione ottenuta è di colore viola scuro. Proseguendo un aliquota della soluzione madre è stata diluita con metanolo per raggiungere un assorbanza di 1,1 ± 0,02, misurata a 545nm. Infine, aggiungendo un aliquota di ABTS (o DPPH), ai campioni si ottiene una decolorazione in base alla quantità di antiossidanti presenti nelle matrici. RISULTATI Contenuto dei polifenoli totali In questo progetto, la determinazione dei polifenoli totali presenti nelle matrici vegetali, è stata compiuta su alcune matrici vegetali, ossia foglie d olivo (Bianchera e Leccino, due varietà tipica della zona locale triestina), tè verde (Thamu long special), karkadè, rosa canina, mirtillo, purea di frutti rossi, lamponi. Infuso delle foglie d olivo Il contenuto di polifenoli totali negli infusi di foglie d olive a caldo (C) e freddo (F) delle due varietà scelte, ha dato risultati migliori nei campioni estratti a caldo, rispettivamente con concentrazioni di 26,73 e 48,10 mg//ml. Per di più l infuso a caldo della varietà Leccino presenta il contenuto polifenolico superiore del 79,95% rispetto a quella Bianchera. Negli infusi a freddo(f) il contenuto.

9 Tè verde Durante questa ricerca sono state confrontate le concentrazioni del tè verde ottenute nelle varie forme, sia come infuso di foglie essiccate, sia come infuso di foglie micronizzate, sia liofilizzato ottenuto dall infuso di foglie micronizzate. Quest ultimo campione ha aumentato notevolmente l estrazione, fino ad essere maggiore del 74,2% rispetto agli infusi tradizionali. Contenuto in polifenoli: Foglie d olivo e tè verde FOGLIE OLIVE Tè VERDE Varietà Polifenoli totali mg/ml Bianchera C. 26,73 ± 1,32 Bianchera F. 2,73 ± 0,28 Campioni Tè verde Thamu long Special Polifenoli totali (mg/100 ml) Inf. conc.f oglie essiccate 775 ± 4,36 Leccino C 48,10 ±3,56 Inf. conc. foglie micronizzate 1350 ± 12,45. Leccino F. 2,69 ± 0.44 Liofilizzato 2691 ± 16,61 (mg/g estratto secco) Leccino C. >79,95%. Liofilizzato > attività polifenolica. Karkadè, Rosa canina La micronizzazione dei campioni di karkadè e della rosa canina, ha aumentato sicuramente l estrazione dei polifenoli, tant è vero che il campione micronizzato di karkadè ha evidenziato l incremento maggiore pari al 281,6%, che si è rivelato maggiore rispetto al campione essiccato; invece per la rosa canina micronizzata l aumento è stato del 221,1% paragonato al campione essiccato.

10 Estratto di Mirtillo, Lamponi e Purea di Frutti rossi Considerando la quantità polifenolica degli estratti di base di frutti rossi si nota che la quantità di molecole bioattive trovata non è significativa rispetto al campione tale quale. Attività polifenolica di mirtillo,lamponi, purea di frutti di bosco Campioni Polifenoli totali mg/100ml Mirtilli freschi 15,14 ±1,05 Mirtilli integratore 4,38 ± 0,87 Purea di frutti rossi 5,65 ± 1,12 Lamponi 4,55 ± 1,19 Attvità Antiossidante La determinazione dell attività antiossidante è stata eseguita su tutti campioni considerati sia tal quali, sia sulle matrici sottoposti a diversi trattamenti termici, allo scopo di evidenziare il metodo più efficiente per ottenere una maggiore quantità di molecole bioattive. Dopo di che di ogni aliquota è stata calcolata l IC50, ossia la concentrazione di estratto (espressa in mg/l) che riduce del 50% la concentrazione iniziale di DPPH e/o dell ABTS. Pomodoro e derivati Le analisi per l attività antiossidante sui derivati del pomodoro sono state effettuate su aliquote di doppio e triplo concentrato, passata di pomodoro e passata arricchita di licopene tali quali o trattati alle microonde. Come

11 si nota dal grafico, i derivati del pomodoro sottoposti a cottura con microonde risultano avere una capacità antiossidante maggiore tra il 2,99% al 32,8%. Differenze della TEAC tra campioni tal quali e trattati con MW a 500W +14,09% +23,43% mmol Campioni non trattati vs campioni trattati

12 Zucca Come si può notare dal grafico, i trattamenti applicati sulla zucca non hanno evidenziato notevoli riduzioni della capacità antiossidante rispetto ai valori individuati dal campione fresco. L applicazione delle microonde a 750W denota il più significativo aumento della TEAC (13,23%), mentre solo la cottura per vapore ha dato un aumento del 25,78%. Attività antiossidante: Zucca ,05% +13,23% teac dpph mmol

13 Infuso di foglie d olivo e tè verde Sia calcolando l attività antiossidante delle due varietà locali di piante d olivo scelte sia quella del tè verde hanno dimostrato di essere matrici vegetali ricche di molecole bioattive. Durante la ricerca della TEAC del tè verde sono stati paragonati i risultati dei campioni dell infuso della Bianchera e del Leccino del tè verde. Il DPPH ha manifestato una particolare attività rispetto a questi campioni perché i risultati sono stati maggiori. Attività antiossidante: foglie d olivo e tè verde TEAC DPPH BIANC.F LECC.F teaverde Karkadè e Rosa canina La TEAC degli infusi di Karkadè e Rosa canina ha evidenziato che entrambi questi vegetali sono caratterizzati da una notevole attività antiossidante legata non solo alla componente fenolica ma anche alla componente carotenica. Anche in questo caso emerge la differenza tra gli infusi fatti con i fiori integri e quelli fatti con i fiori micronizzati, in cui è osservabile un aumento pari al 72,4% per il Karkadè e al 67,3% per la Rosa Canina.

14 Resveratrolo, purea di frutti rossi, mirtillo e lamponi I campioni di frutta rossa scelti sono stati paragonati con la molecola del resveratrolo per valutare l azione antiossidante; il resveratrolo è una molecola caratteristica dei prodotti vegetali ricchi principalmente in antocianidine e procainidine. I lamponi liofilizzati denotano un importante capacità antiossidante totale elevata, rispetto al DPPH, mentre le TEAC complessive sono risultate decisamente meno significative. Attività antiossidante: frutti rossi Mirtillo, lamponi, purea di frutti rossi o L attività antiossidante è stata paragonata con il Resveratrolo. 3,5 3 2,5 2 1,5 TEAC dpph 1 0,5 0 resveratrolo purea mirtillo lamponi mmol INCAPSULAZIONE DI MOLECOLE BIOATTIVE MEDIANTE ATTIVAZIONE ALLO STATO SOLIDO (SSA) È una tecnica brevettata che permette di ottenere nuovi materiali compositi definiti co-macinati. La SSA impiega alta energia di tipo vibrazionale e implica il trattamento di sostanze funzionali con polimeri, matrici e carriers appropriati, in assenza di solventi. Tutto ciò per poter

15 modificare la solubilità, la biodisponibilità, i parametri chimico fisici e il rilascio del principio attivo. Solo alcune molecole oggetto di questo studio sono state sottoposte ad incapsulazione, mediante la tecnica dell attivazione allo stato solido, ossia Karkadè, Mirtillo e Rosa Canina. Preparazione dei comacinati Per la preparazione dei campioni di co- macinato sono state individuate le migliori condizioni sperimentali. Prima della costruzione del disegno sperimentale è stato necessario determinare i fattori di prodotto e di processo di tipo quantitativo (rapporto aroma è co-macinante, tempo, rapporto polveri e mezzi co-macinanti, rapporto disassamento e movimento) e qualitativo, ossia il materiale adsorbente (due tipi di Maltodestrine,Silice, Fecola e Ciclodestrine) e il materiale co-macinante (i co-macinati scelti in base alla differente natura dei campioni,ossia lipidica, silicea, polisaccaridica e appartenenti alla famiglia delle gomme naturali). Valutazione del rilascio delle sostanze attive Dopo la determinazione del contenuto di antiossidanti, i comacinati sono stati sottoposti al Saggio di Dissoluzione per le forme farmaceutiche solide, secondo il metodo ufficiale della FU XI. 10 grammi di comacinato sono stati posti alla base del contenitore di vetro contenente una soluzione tampone al ph fisiologico di 7.4, sotto agitazione e ad una temperatura di 37 C. Al tempo definito di 1, 5, 20, 40, 60, 120, 180 e 240 minuti sono state prelevate aliquote di 5ml di liquido delle quali è stata letta l assorbanza per la determinazione della TEAC e gli altri per la determinazione dei polifenoli, della vitamina C e dei carotenoidi. I risultati della TEAC nei comacinati ottenuti in questo studio hanno dimostrato che tutti campioni hanno dimostrato una perdita più o meno significativa dell attività antiossidante, tale perdita è strettamente correlata al polimero utilizzato. Tutti i campioni supportati su silice

16 hanno ridotto drasticamente il valore della TEAC, mentre i campioni supportati su maldodestrine e ciclo destrine hanno conservato l attività antiossidante. Appare evidente che la procedura di incapsulazione di molecole bioattive oggetto di questo studio permette di mantenere l attività antiossidante e determinare un rilascio modulato nel tempo delle molecole bioattive. Tale metodica può rappresentare una valida soluzione sia per la formulazione di integratori dietetici, che per la produzione di alimenti arricchiti con considerevoli proprietà nutraceutiche. CONCLUSIONI Le applicazioni pratiche del trattamento con le microonde possono rivelarsi utili per la preparazione di alimenti nutraceutici. Rispetto alle matrici esaminate, si è potuto infatti constatare che le microonde non hanno pregiudicato il profilo qualitativo e quantitativo degli analiti ricercati. Si è dimostrato che in alcuni processi ad alta potenza migliorano la disponibilità quantitativa delle molecole bioattive ad azione antiossidante. Bisogna sottolineare che la scelta del trattamento migliore è stata definita non solo sulla base dei risultati quali-quantitativi migliori ma anche sul mantenimento delle proprietà organolettiche tipiche dell alimento (sapore, aroma, colore, texture). Ad esempio, nella zucca questo aumento può essere dato da una migliore distruzione delle cellule vegetali e dei cloroplasti contenti nelle molecole carotenoiche. Un ulteriore scopo di questo studio è stato quello di aumentare le caratteristiche salutistiche dei polifenoli vegetali, mediante processi che offrano una protezione nei confronti dei principi attivi, migliorando sia la stabilità che la biodisponibilità. Pur rivelandosi un buon metodo di preservazione delle molecole attive, tecnologicamente le microonde non trovano applicazione industriale causa la mancanza di sistemi su larga scala che utilizzano questo trattamento.