Modulo 16: La fosforilazione ossidativa

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1 1 Modulo 16: La fosforilazione ossidativa

2 La fosforilazione ossidativa NADH e FADH 2 trasferiscono e - ad alto potenziale di trasferimento all O 2 liberando una quantità di energia sufficiente per generare ATP. Il processo prende il nome di fosforilazione ossidativa. Gli e- sono trasferiti all O 2 indirettamente mediante la catena respiratoria. L energia libera resa disponibile dal flusso degli elettroni lungo la catena respiratoria è utilizzata per formare un gradiente protonico (l energia libera conservata sotto forma di potenziale elettrochimico). Il flusso transmembrana di protoni in senso inverso viene sfruttato per generare ATP da ADP e Pi. La catena respiratoria è formata da quattro complessi proteici trasmembrana I, II, III e IV, e 2 fattori solubili l ubichinone (coenzima Q) ed la proteina citocromo C. 2

3 Il potenziale di trasferimento degli elettroni: potenziali di riduzione (E 0 ) Ossidante Riducente n E 0(V) Succinate + CO 2 α-ketoglutarate Acetate Acetaldehyde Ferredoxin (oxidized) Ferredoxin (reduced) H + H NAD + NADH + H NADP + NADPH + H Lipoate (oxidized) Lipoate (reduced) Glutathione (oxidized) Glutathione (reduced) FAD FADH Acetaldehyde Ethanol Pyruvate Lactate Fumarate Succinate Cytochrome b (+3) Cytochrome b (+2) Dehydroascorbate Ascorbate Ubiquinone (oxidized) Ubiquinone (reduced) Cytochrome c (+3) Cytochrome c (+2) Fe (+3) Fe (+2) ½ O H + H 2 O E 0 è il potenziale di riduzione standard (ph 7, 25 C) ed n è il numero di elettroni trasferiti. E 0 si riferisce alla reazione parziale (semireazione) dell ossidante che si riduce Ox + 2e- + 2H + red H 2

4 Relazione tra ΔE e ΔG In una reazione di ossidoriduzione, gli elettroni si muovono spontaneamente verso atomi o molecole che hanno un potenziale di riduzione maggiore: E =E acc - E don se E >0 La reazione procede spontaneamente nella direzione scritta. La differenza di potenziale di riduzione ΔE permette di calcolare la variazione di energia libera (ΔG) G o = -nf E o n = numero di elettroni, F= costante di Faraday (96,48 kj mol -1 V -1 la quantità di carica di una mole di elettroni) Una reazione di ossidazione-riduzione con un valore positivo di ΔE avrà un valore di ΔG negativo e procederà spontaneamente. 4

5 Differenza di potenziale tra NADH e ossigeno molecolare Quanta energia viene rilasciata dalla ossidazione di NADH da parte dell ossigeno? ½ O H e - H 2 O NAD+ + H e - NADH La reazione complessiva è: ½ O 2 + NADH + H + H 2 O + NAD + E 0 (V) = V E 0 (V) = V E 0=E acc 0- E don 0 = (+0.82 V) - (-0.32 V ) = 1,14 V G o = -nf E o = -2 x 96,48 kj mol -1 V -1 x (1,14 V) = -220 kj mol -1 Si ricorda che dall idrolisi dell ATP si ricava -30,5 kj mol -1 per la sua sintesi sono necessari 30,5 kj mol-1 L ossidazione del NADH si ricava una quantità sufficiente per sintetizzare ATP, avviene indirettamente ed è accompagnata dalla formazione di un gradiente protonico. 5

6 I componenti della catena respiratoria Il trasferimento elettronico dal NADH (e dal FADH 2 ) all O 2 coinvolge diversi trasportatori solubili (ubichinone) oppure gruppi prostetici legati a proteine (citocromi e proteine Fe-S) l ubichinone (coenzima Q) Centri ferro-zolfo delle proteine ferro-zolfo Gruppi prostetici dei citocromi di tipo a, b, e c. 6

7 I componenti della catena respiratoria Proteine integrali di membrana : Complesso I : NADH-Q ossidoriduttasi, 43 subunità, FMN, 7 centri Fe-S Complesso II: Succinato deidrogenasi (ciclo krebs) 4 subunità, FAD, Fe-S Complesso III: Q- citocromo C ossidoriduttasi, 11 subunità, cit b, cit-c 1, Fe-S Complesso IV: Citocromo C ossidasi, 13 subunità, (cit a, cit a3, CuA, CuB) 7

8 Flusso degli elettroni attraverso la catena di trasporto degli elettroni dal NADH all ossigeno I complessi trasportatori di elettroni sono disposti in sequenza ad l affinità crescente per gli elettroni in modo che fluiscano spontaneamente dall NADH verso l ossigeno (ΔE>0, ΔG<0) (Succinato DH) Flusso degli elettroni indicato dalla freccia Blu 8

9 La citocromo C ossidasi (complesso IV) Il complesso IV catalizza la reazione di riduzione dell O 2 Contiene eme a eme a 3 e 3 ioni rame che passano ciclicamente da Cu + a Cu 2+ Una dopo l altra 4 molecole di Citocromo C si legano all enzima e trasferiscono un elettrone alla volta riducendo una molecola di O 2 a H 2 O 9 4 cyt c interm + 8 H + mat + O 2 4 cyt c ox + 2 H 2 O + 4 H + interm Sono trasportati 4H+ ogni 4 elettroni ceduti ad una molecola di ossigeno

10 L energia rilasciata durante il trasferimento elettronico è conservata nella formazione di un gradiente protonico NADH + 11 H + matr + 1/2 O 2 = NAD H + interm + H 2 O L energia contenuta nella differenza di concentrazione protonica e di separazione di carica rappresenta una forma di conservazione dell energia liberata dal trasferimento elettronico ed è chiamata forza motrice protonica C 2 C 1 Spazio intermembrana Matrice 10

11 Energia di un gradiente protonico Quanta energia si ricava dalla formazione di un gradiente protonico? (vedi modulo 9 trasporto di membrana) ΔG = 2,303 RT log10 (c 2 /c 1 ) + ZF ΔV La differenza di ph tra l esterno e l interno della membrana mitocondriale è di 1,4 unità, (ph inferiore nello spazio intermembrana) Nelle condizioni del mitocondrio quindi: ΔV = 0,14 V, Z = 1, log10 (c 2 /c 1 ) = 1,4 ΔG= (2,303 x 8,32 x 10-3 kj mol -1 K -1 x 310 K x 1,4) + (+1 x 96,48 kj mol -1 V -1 x 0,14 V) = 21,8 kj mol -1 Ciascun protone (ione ossonio H 3 O + ) portato dalla matrice verso lo spazio intermembrana richiede 21,8 kj mol-1 e fornisce 21,8 kj mol-1 quando rientra nella matrice 11

12 Trasporto di elettroni e sintesi di ATP attraverso il meccanismo chemiosmotico. Spazio intermembrana Matrice mitocondriale 1 Tappa: il trasporto degli elettroni permette di pompare protoni attraverso la membrana Trasporto degli elettroni 2 Tappa: il gradiente protonico passa attraverso la ATP sintasi e si forma ATP Fosforilazione dell ADP 12 Molecular biology of the cell, 4th ed. Figure 14-1.

13 L ATP Sintasi ( F 1 F 0 ATPasi ) Il flusso protonico inverte la sua direzione: i protoni tornano alla matrice attraverso un canale protonico. L ATP sintasi: è formata da due domini funzionali: una unità di conduzione protonica con aspetto di uno stelo (subunità F 0 ) e da una unità catalitica a forma di sferula (F 1 ). 13

14 La struttura della ATP sintasi F 1 = complesso periferico di membrana formata da 5 polipeptidi diversi: 3 3 (il sito catalitico dell ATP sintasi) e dalle proteine γδε. La subunità γ si inserisce nell esamero 3 3 spezzandone la simmetria. F o = complesso transmembrana forma il canale protonico (subunità a,b,c 10 ) L enzima è dotato di: una parte mobile (rotore): formata dall anello c e dello stelo centrale γε una parte fissa (statore) comprendente il resto della molecola ( 3 3 e giunzione esterna a b δ) 14

15 La catalisi rotazionale è alla base del meccanismo di sintesi dell ATP ADP 3- + HPO H + ATP 4- + H 2 O Le tre subunità β a seconda dell interazione con subunità γ assumono conformazioni diverse per il legame con i nucleotidi adenilici: L, lassa che lega ADP e Pi, chiusa T tesa, che catalizza la formazione di ATP, chiusa O aperta, permette il rilascio del nucleotide La subunità γ ruotando interconverte le tre forme 15

16 Il flusso dei protoni intorno all anello C determina la sintesi di ATP Il passaggio di H + tramite F 0 determina una rotazione di F 0 e della subunità γ rispetto i trimeri di F1. Subunità c: due α-eliche transmembrana con un residuo di Asp al centro Subunità a: due semicanali che permettono agli H + di penetrare nella membrana Percorso dei protoni all interno della membrana Il movimento di H + attraverso i semicanali della subunità a da una zona di alta concentrazione (intermembrana) ad una a bassa concentrazione di H+ (matrice) fornisce l energia per la rotazione di C. 16

17 L ossidazione del glucosio rende circa 30 molecole di ATP La stechiometria del pompaggio di H + e della sintesi di ATP è costituita da numeri non interi. Il trasporto di una coppia di elettroni attraverso NADH e FADH 2 genera il pompaggio di circa 10 H + (4+4+2), il passaggio di circa 4 protoni per ogni ATP formato, Stime indicano che: NADH = 10H + trasportati ~ 2.5 ATP FADH 2 = 6H + trasportati ~ 1.5 ATP Dalla completa ossidazione di una molecola di glucosio si ottengono molecole di ATP. La differenza (30 o 32) dipende dal sistema di trasferimento dell NADH prodotto nel citoplasma nel mitocondrio. 17

18 Il controllo della fosforilazione ossidativa La velocità di respirazione (consumo di ossigeno) nei mitocondri è controllata dalla disponibilità di ADP quale substrato per la fosforilazione. L ATP viene formato solo alla velocità con cui viene consumato. Gli elettroni non fluiscono attraverso la catena di trasporto degli elettroni se contemporaneamente ADP non viene fosforilato ad ATP. I livelli di ADP influenzano anche la velocità del ciclo dell acido citrico. 18