Trascrizione dell RNA e Traduzione delle Proteine

Transcript

1 Trascrizione dell RNA e Traduzione delle Proteine 7 1

2 Flusso dell informazione genetica Dogma centrale 7 2

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5 RNA differisce da DNA per: -zucchero, ribosio -zucchero non DEOSSI -basi azotate -a singolo filamento -struttura complessa anche se non a doppia elica 7 5

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8 Sequenza equivalente a quella dell RNA trascritto, stessa polarità

9 Differenze con la replicazione/duplicazione del DNA: - RNA polimerasi - Trascritto di RNA a singolo filamento si stacca dalla doppia elica quasi subito e quindi è possible sintetizzare nuove molecole - Frammenti corti - RNA polimerasi non utilizza innesco-primer - Tasso di errore 1x 10-4 (invece che 1x10-7 come nel DNA) 7 9

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11 TIPI DI RNA RNA messaggeri (mrna) codificano le proteine RNA ribosomiali (rrna) formano il nucleo centrale del ribosoma e catalizzano la sintesi proteica microrna (mirna) regolano l espressione genica RNA transfer (trna) fungono da adattatori tra l mrna e gli amminoacidi nella sintesi delle proteine Altri RNA non codificanti attivi nello splicing, nella regolazione dei geni, nel mantenimento dei telomeri e in molti altri processi 7 11

12 La Trascrizione nei batteri. L RNA polimerasi è un complesso multiproteico contenente un fattore detto sigma che è staccabile L RNA pol si possono attaccare solo debolmente al DNA. Tuttavia quando l RNA pol incontra una particolare sequenza di DNA definita sequenza promotore vi si attacca con forza ed inizia la trascrizione. Questa particolare sequenza viene riconosciuta tramite il fattore sigma. Dopo questo fenomeno la pol apre il DNA per un breve tratto ed uno dei due filamenti inizia a svolgere il ruolo di stampo. Dopo la sintesi dei primi ribonucleotidi il fattore sigma si stacca e la trascrizione avanza rapidamente fino a che la pol incontra un segnale sul DNA detto terminatore che la fa prima fermare e poi staccare (preceduto da una sequenza simmetrica che formerà una forcina ). Nei batteri il segnale terminatore è una serie di A e T preceduta da una sequenza simmetrica. 7 12

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14 Non tutte le sequenze hanno le caratteristiche per essere riconosciute dal fattore sigma, la serie delle caratteristiche che una sequenza deve avere per essere riconosciuta è definita consenso. La sequenza precisa di questa consenso determina la forza del promotore ossia la capacità di attrarre le polimerasi. I promotori dei geni più abbondanti sono più forti dei promotori dei geni più rari. Alla stessa maniera dei promotori, anche i terminatori contengono una vasta gamma di sequenze. Nelle cellule eucariotiche la situazione è simile. Le sequenze dei promotori solitamente sono asimmetriche. Poiché il DNA ha due filamenti due molecole di RNA potrebbero essere trascritte da qualsiasi posizione usando ciascun filamento di DNA come stampo. L unica imposizione è che la trascrizione avvenga in direzione 5 >3 e che quindi sia sempre lo stampo 3 >5 ad essere impiegato. Chiaramente le direzioni saranno opposte. La scelta del filamento stampo per ciascun gene è determinata dalla posizione e dall orientamento del promotore 7 14

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16 Una differenza sostanziale tra i batteri e le cellule eucariotiche è rappresentata dal fatto che i procarioti hanno solo una RNA polimerasi mentre gli eucarioti ne possiedono tre: l RNA polimerasi I, II e III. Nonostante esse abbiano certe sub-unità in comune, esse trascrivono geni diversi. Le RNA polimerasi I e III trascrivono geni che codificano RNA transfer, RNA ribosomali e piccoli RNA. L RNA polimerasi II trascrive la maggioranza dei geni che codificano proteine. La pol II eucariotica e quella batterica sono strettamente correlate ma ci sono almeno due differenze sostanziali tra questi enzimi: 1) Mentre la pol batterica più il fattore sigma possono iniziare la trascrizione su uno stampo di DNA anche in vitro e senza altre proteine, la pol II eucariotica richiede l aiuto di diverse proteine accessorie per iniziare a trascrivere. Queste proteine vengono dette Fattori trascrizionali generali. 2) negli eucarioti l inizio della trascrizione deve tenere in conto lo stato di compattamento della cromatina. 7 16

17 Per iniziare la trascrizione di un gene la RNA pol II richiede molti fattori generali della trascrizione che servono èer piazzare la pol sul promotore, iniziare la trascrizione e rilasciare la pol dal promotore quando inizia la trascrizione TFIID serve per iniziare l attacco del complesso di trascrizione ad una sequenza di DNA ricca di T ed A definita TATA box piazzata 25 basi dall inizio della trascrizione. Altri fattori vengono poi assemblati per consentire l inizio della trascrizione formando un complesso d inizio che guida la pol II sul promotore dopo di che il fattore TFIIH permette alla pol II di accedere al punto di inizio sullo stampo di DNA. La trascrizione in una cellula eucariotica richiede un numero maggiore di proteine tra cui proteine regolatrici dette attivatori trascrizionali che legandosi a specifiche sequenze di DNA aiutano la pol II a posizionarsi sul punto iniziale della trascrizione. Per iniziare la trascrizione deve esistere un complesso poli proteico detto mediatore necessario a regolare le diverse proteine attivatrici richieste per questo processo. 7 17

18 Negli eucarioti la trascrizione rappresenta solamente un primo passaggio nella trasmissione dell informazione dal DNA alle proteine. Dopo che il filamento di RNA è stato trascritto viene sottoposto a modificazioni covalenti ad entrambe le estremità e alla rimozione delle sequenze introniche. Quest ultimo fenomeno si chiama splicing dell RNA messaggero. Questa modificazione permette inoltre di generare diverse proteine dallo stesso gene semplicemente modificando lo schema dello splicing! Le modificazioni dell estremità di una molecola di RNA riguardano l aggiunta di un cappuccio al 5 della molecola definito Cap e di una coda di poly A all estremità

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20 Non appena si sono prodotti i primi nucleotidi l mrna viene dotato di un cap attraverso una serie si tre modificazioni:1) una fosfatasi toglie il fosfato in 5. 2) una guanil transferasi attacca una GMP in modo inusuale ossia ) un a metil transferasi metila la G in posizione 7 sulla guanina. Nel nucleo questi cap sono associati ad un complesso proteico detto CBC. Anche le estremità 3 dei mrna sono modificate. Sulla coda della pol II viaggiano due complessi detti fattore di stimolazione del taglio (CStF) e fattore di specificità del taglio e della poliadenilazione (CPSF). Quando questo complessi trovano la sequenza adeguata sull RNA innescano altre proteine che per prima cosa tagliano il messaggero, quindi la poly-a polimerasi inizia a trasferire nucleotidi A alla catena di RNA. Dopo che l estremità 3 è stata tagliata la pol II continua ancora a valle la trascrizione del DNA. Presto però la pol II si stacca e questo RNA viene degradato. 5 Cap 3 polya 7 20

21 Capping-aggiunta di cappuccio al

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24 Sequenze di splicing 7 24

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27 ISOFORME DI mrna 7 27

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29 .. ma alcuni RNA non servono per codificare proteine. Si tratta di RNA che possiedono funzioni alternative all interno della cellula. Gli RNA più abbondanti sono quelli ribosomali che formano il nucleo del ribosoma necessario alla traduzione proteica. Questi rrna sono trascritti dall RNA pol I. Per ottenere un numero molto grande di rrna la cellula eucariotica possiede copie multiple dei geni che codificano per l rrna (circa 200 copie per genoma aploide nell uomo). Essi non vengono cappati e poliadenilati. Ci sono quattro tipi di rrna negli eucarioti definiti dalla loro velocità di sedimentazione espressa in Svedberg. Gli rrna 18S, 5,8S e 28S sono prodotti dalla modificazione di un rrna precursore di grosse dimensioni, mentre l rrna 5S è prodotto dalla RNA pol III trascrivendo un gene localizzato in una regione diversa del genoma. Lo svedberg (simbolo S) è un'unità di misura del tasso di sedimentazione che non fa parte del Sistema Internazionale. Uno svedberg, dimensionalmente uguale ad una unità di tempo, è pari a secondi. L'unità prende il nome dal quello del fisico e chimico svedese Theodor Svedberg, vincitore del Premio Nobel per la chimica nel 1926 per il suo lavoro sulla chimica dei colloidi e l'invenzione dell'ultracentrifuga. Nell'ultracentrifugazione, il tasso di sedimentazione di una particolare macromolecola è calcolato dividendo la velocità di sedimentazione costante (espressa in m/s) per l'accelerazione applicata (espressa in m/s 2 ) e moltiplicando poi per

30 Nucleolo Il nucleolo è la più grande fabbrica di ribosomi della cellula. Si tratta di un grosso aggregato di macromolecole comprendenti gli stessi geni che codificano per gli rrna, i precursori degli rrna e le molecole mature situato nel nucleo ma non separato da membrane. Inoltre contiene tutte le molecole che sono necessarie per la maturazione degli RNA ribosomali. I geni codificanti per l rrna sono distribuiti in 10 gruppi ciascuno disposto vicino alla punta di 5 coppie di cromosomi diversi. Quando la cellula entra in mitosi i cromosomi si condensano ed il nucleolo si distrugge. Dopo la mitosi la cromatina ritorna al suo stato naturale ed il nucleolo si riforma. 7 30

31 La traduzione negli eucarioti. La conversione dell informazione contenuta nell mrna in proteina viene definita traduzione. Poichè il DNA è scritto con un alfabeto fatto di quattro lettere mentre le proteine sono scritte con un alfabeto fatto da venti lettere, per questa ragione la sequenza nucleotidica di un messaggero deve essere tradotta in proteina seguendo determinate regole. Queste regole sono state decifrate negli anni 60 e rappresentano il codice genetico. Si scoprì che l RNA è un polimero fatto di 4 lettere e che ciascun amminoacido è codificato da una tripletta di tre lettere. Ma in questo modo le possibili combinazioni sarebbero 4X4X4=64, ben maggiori delle venti combinazioni necessarie. Per questa ragione alcune triplette non dovrebbero essere usate o il codice genetico dovrebbe presentare un fenomeno di ridondanza, ossia diverse triplette dovrebbero codificare per lo stesso amminoacido. Ciascuna tripletta si chiama codone e rappresenta o un amminoacido o un segnale di stop al processo di traduzione. 7 31

32 La reazione fondamentale durante la sintesi proteica è la formazione di un legame covalente tra un gruppo carbossilico all estremità di una catena polipeptidica in crescita e un gruppo amminico libero su di un amminoacido libero in arrivo. 7 32

33 La tripletta codificante sull mrna non si lega direttamente all amminoacido ma ad una molecola adattatore che può riconoscere tramite un suo sito il codone e presentare all altra estremità l amminoacido: RNA transfer o trna lunghe poco più di 80 nucleotidi e sono sintetizzati dalla RNA pol III. Queste molecole si ripiegano nello spazio in modo complesso ed assumono una forma a L. Una delle due estremità contiene l anticodone che riconosce il codone sull mrna mentre l atra estremità è usata per tenere legato l amminoacido. 7 33

34 Ciascuna molecola di trna si lega ad uno dei 20 aa che rappresenta il suo partner ideale. L enzima che catalizza questa reazione è l amminoaciltrna sintetasi. Ovviamente per evitare errori il sistema possiede dei meccanismi di sicurezza che fanno si che ci siano meno di un errore ogni accoppiamenti. 7 34

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39 Codone Nella traduzione proteica una sequenza di nucleotidi viene tradotta in in una sequenza di amminoacidi. In linea di principio una sequenza di RNA può essere letta in ognuno dei tre quadri di lettura. Ovviamente ciò dipende dalla base scelta per la partenza, ma esiste un codice di punteggiatura che permette solo uno dei tre quadri di lettura 7 39

40 trna iniziatore che porta l aa Metionina è diverso da tutti gli altri trna per la Metionina. E capace di legarsi al sito P del ribosoma subunità minore anche in assenza della subunità maggiore Con i fattori di inizio della traduzione, il trna iniziatore riconosce il Capping dell mrna al

41 La terminazione della traduzione La fine del messaggio avviene quando il ribosoma incontra uno dei tre segnali di stop della traduzione: UAA; UAG; UGA che sono stati chiamati codoni di stop. Questi codoni non si appaiano ad un trna ma si legano a fattori detti di rilascio. Quando in posizione A entra un fattore di rilascio la peptidil transferasi è costretta a legare una molecola di acqua all ultimo amminoacido. Questa reazione libera l estremità della catena peptidica e il ribosoma si separa rilasciando l mrna. 7 41

42 La sintesi della proteine prevede inizi multipli da parte dei ribosomi su ciascuna molecola di mrna. Non appena il ribosoma ha tradotto una parte sufficiente di proteina l estremita 5 dell RNA viene nuovamente agganciata da un altro ribosoma. Le molecole di mrna si trovano nel citosol sotto forma di poliribosomi definiti anche polisomi che altro non sono che grossi complessi composti da parecchi ribosomi agganciati ad una molecola di mrna I poliribosomi 7 42