PrP C : meccanismi e funzione

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1 Panuzzo Cristina PrP C : meccanismi e funzione Scuola Universitaria Interfacoltà per le Biotecnologie a.a

2 PrP C : meccanismi e funzione La proteina Prionica è una proteina ubiquitaria, codificata dal gene Prn-p situato sul cromosoma 20 e individuata in molti mammiferi in una forma benigna detta PrPC (33-35Kd). E presente sulla superficie esterna di tutte le cellule del nostro organismo (altamente espressa nel SNC) ancorata alla membrana mediante un glicosilfosfatidil inositolo (GPI). Analizzando la sua struttura aminoacidica si possono individuare 4 domini importanti (Fig 1): GPI 1-23 peptide segnale che dirige la proteina nel reticolo endoplasmatico regione ricca di octapeptidi ripetuti in tandem, in grado di legare molti metalli, tra cui Cu regione idrofobica altamente conservata C-terminale costituito da 3 α eliche e 2 foglietti β. Fig 1: Struttura aminoacidica di PrP C In rari casi può trasformasi nella forma infetta (PrPSC), indistinguibile da PrPC nella sequenza aminoacidica primaria, ma con prorietà fisiche e biochimiche molto differenti, tali da rendere PrPSC altamente resistente alle proteasi, insolubile e quindi in grado di generare aggregati che sono alla base di molte malattie neurodegenerative come la Creutzfeldt-Jacob nell uomo (BSE nei bovini, Scrapie nella pecora). Grazie a studi ad alta risoluzione, quali quelli di NMR e di cristallografia, si è dimostrata la struttura tridimensionale del C-terminale (quella dell N-T non è ancora nota). Questa regione è altamente conservata in molti mammiferi (90% di omologia), è globulare (Fig 2) e contiene 3 α eliche ( ; ; ) e 2 foglietti β ( ): Sebbene la struttura tridimensionale di PrPSC non è stata ancora definita del tutto molto probabilmente è proprio la regione al C- terminale quella responsabile della transizione da PrP C a PrPSC, caratterizzata in quest ultima da molti foglietti β, tali da conferire insolubilità e resistenza a proteasi. PrP C e Funzione Fig 2: a) struttura tridimensionale di PrP C ottenuta mediante NMR b) struttura tridimensionale predetta di PrP SC Per analizzare la funzione di PrP C il gruppo di Bueler nel 1992 (Bueler et al., 1992, Nature) ha prodotto alcuni modelli murini KO per PrP C. Il KO viene ottenuto attraverso ricombinazione omologa tra un costrutto di 4.8Kb, (costituito dai codoni 1,2,3 dell eso 3 di PrP C, la cassetta neo 2

3 sotto il controllo del promotore della timidina chinasi dell Herpes Simplex Virus TK e i codoni dell esone 3 di PrP C ), e l esone 3 di PrP C. neo Eso 1 Eso 2 Eso 3 4.8Kb neo Eso 1 Eso 2 Eso 3 Fig 3: Ricombinazione omologa tra il costrutto di 4.8Kb, contenente i codoni dal 4 al 187 dell esone 3 di Prn-p sostituiti dal gene neo, e l esone 3 di Prn-P In seguito a ricombinazione omologa i primi tre codoni dell esone 3 di Prn-p, il gene neo e i restanti 67 codoni verranno fusi in frame con conseguente inattivazione del gene. Data l elevata espressione di PrpC nel sistema nervoso, una volta individuati i topi KO si analizzano le loro abilità cognitive e di apprendimento che risulteranno altamente danneggiate nel caso in cui l assenza di PrP C generi lesioni nel sistema nervoso centrale. Per far questo vengono condotti due test: il test del nuoto e l Y-maze discrimination. Swim path (cm) Swimming test PrP+/+ PrP+/- PrP-/- Platform reversal Nel primo caso (Fig 4) si analizza la capacità dei diversi topi di raggiungere una piattaforma sommersa dall acqua (giorni 1-3) e di riorientarsi in seguito a cambiamento della sua posizione (4-5). Come si può vedere dal grafico non si individuano particolari differenze tra i diversi topi nel raggiungere la piattaforma sommersa, anche dopo averne modificato la posizione Day of training Fig 4: Test del nuoto: 3 gruppi di topi (Wild type, Prn-p +/-, Prn-p -/- ) vengono analizzati per la loro capacità raggiungere una piattaforma sommersa dall acqua (giorni 1-3) e di riorientarsi (4-5). Sull asse delle y sono indicati i cm percorsi per raggiungere la piattaforma. Nel secondo caso (Fig 5) viene testata la capacità dei diversi topi di scegliere la giusta direzione di un labirinto (evidenziata da segnali visivi e tattili) evitando così quella sbagliata, evidenziata invece da segnali dolorosi e da punizioni. Se nei primi tre giorni di allenamento si osserva una certa eterogeneità di comportamento tra i 3 gruppi al quarto giorno non si individuano più particolari differenze. Fig 5: Y-maze discrimination test: 3 gruppi di topi (Wild type, Prn-p +/-, Prn-p -/- ) vengono testati per la capacità di scegliere la giusta direzione di un labirinto (evidenziata da segnali visivi e tattili). Sull asse delle y sono indicate le % di scelte corrette Si può quindi concludere dicendo che non si evidenziano Day of training differenze significative tra i tre gruppi di topi e che quindi PrpC può essere eliminata senza creare alcun fenotipo mutato. Questo risultato può sembrare molto strano viste le caratteristiche fondamentali della proteina: espressione ubiquitaria, presenza in molti mammiferi esaminati e rapido turnover. Sembrerebbe quindi che la delezione di PrP C non determini lo sviluppo della malattia. Diventa importante capire se la patologia può essere quindi dovuta ad un accumulo di PrP SC. PrP C e PrP Sc 3 Correct choices % Y-maze test PrP+/+ PrP+/- PrP-/-

4 Per far questo il gruppo di Bueler e Weismann nel 1993 (Bueler, Weismann et al., 1993, Cell) ha condotto un esperimento nel quale omogenato di cervello murino infetto viene inoculato nel cervello di topi WT, KO per PrP C e CD-1, usati come controllo. Come si può vedere da questo grafico (Fig 6) i topi CD-1 e Prn-p +/+ mostrano i tipici sintomi neurologici e muoiono rispettivamente dopo 153 ±7/ 171 ± 11 giorni dall inoculo. I topi Pnr-p o/o invece sopravvivono all inoculo e non presentano sintomi associabili alla scrapie. Fig 6: Comparsa dei sintomi associabili all inoculo di PrP SC nei topi CD-1, Prn-p +/+ wild type e Pnr-p o/o omozigoti. Viene poi anche condotta un analisi istologica (Fig 7) delle sezioni di cervello dei topi KO per PrP C e quelli wild type inoculati. Come si può vedere la sezione di cervello di topi Pnr-p o/o inoculati con omogenato infetto (C-D) non mostra alcuna alterazione ed è indistinguibile da quella inoculata con omogenato non infetto. La sezione di cervello di topi Pnr-p +/+ inoculati con omogenato infetto (E-F) mostra invece una alta vacuolazione e pronunciata gliosi astrocitaria, fenomeno che prevede una sostituzione dei neuroni danneggiati e morti con cellule di sostegno della glia. Fig 7: Analisi istologica delle sezioni di cervello dei topi Prn-p +/+ e Pnr-p o/o : topo Pnr-p o/o inoculato con omogenato non infetto (A-B) o infetto (C-D); E-F topo Pnr-p L assenza di PrpC protegge i topi dallo danno +/+ inoculato con neurologico. omogenato infetto.la marcatura viene effetuata mediante l anticorpo Anti GFAP (anti glial fibrillary acidic protein). Per spiegare questo risultato viene anche analizzata la possibilità che nei i topi KO per PrP C, in seguito a inoculo di omogenato infetto, ci sia la produzione di anticorpi specifici per PrP C -PrP SC con conseguente distruzione delll agente infettivo e impossibilità di isorgenza della malattia (Fig 8). Viene utilizzato sia il siero di un topo KO non inoculato (M) che quello di un topo KO inoculato con l omogenato infetto (A). Il siero di topi Pnr-p o/o inoculati con la proteina prionica non presenta però anticorpi specifici contro PrpC dal momento che nessuna proteina da esso riconosciuta corrisponde alla PrpC (35-33Kd). Fig 8: Ricerca di Anticorpi nel siero di Topi Pnr-p o/o: +: proteine di omogenato di cervello Pnr-p - / -; O: proteine di omogenato di cervello Pnr-p o/o ; P: Anticorpo purificato contro PrP27-30 (PrP SC ); M: siero Pnr-p o/o non inoculato; A: siero Pnr-p o/o inoculato Da R073 questi anticorpo risultati purificato possiam contro quindi PrP27-30 concludere che: I topi senza Prp C sono protetti dal danno neurologico Il solo accumulo di PrP SC non è sufficiente per l induzione della malattia Prp C è quindi necessaria per la 4

5 patologia. L ipotesi più probabile è che PrP SC agisca trasformando molecole Prp C normali (cosa che non può fare nei KO) in Prp SC, favorendo l accumulo dell agente infettivo. PrP C & Doppel In un lavoro successivo condotto dal gruppo di Sakaguchi nel 1996 (Sakaguchi et al., 1996, Nature) vengono prodotti altri topi KO per PrP C. In questo caso però la ricombinazione omologa non coinvolge solo l esone 3 di PrP C ma tutta la regione codificante del gene. PGK-neo Eso 1 Eso 2 Eso 3 PGK-neo Fig 9: Ricombinazione omologa tra un costrutto costituito dalla cassetta neo e l intera regione codificante (eso1,2,3) di gene Prn-P. Di questi topi vengono analizzate diverse attività comportamentali, tra le quali quella motoria, mediante il Rotorod test. Come si può vedere dal grafico (Fig 10) a 92 settimane dalla nascita i topi % KO per PrP C mostrano un comportamento molto remaining on rotorod alterato, la percentuale del tempo che il topo PrP+/+ passa a correre nella ruota è molto bassa (circa il 100 Rotorod test PrP+/- 20%) rispetto agli altri due gruppi. Gli stessi topi % 80 PrP-/- KO poche settimane dopo il mostrano una 60 degenerazione cerebrale e conseguente atassia 40 (perdita del controllo dei movimenti volontari) Weeks 92 Fig 10: Rotorod test: Si analizza l attività motoria dei tre gruppi di topi (Wild type, KO e eterozigoti per Prn- P), intesa come tempo transcorso a correre nella ruota (tempi per oltre 180 secondi sono considerati normali) Di fronte a questo risultato il gruppo di Sakaguchi, molto soddisfatto, ipotizzò che era proprio l assenza di PrP C a generare il fenotipo atassico. Questo risultato fu però presto smentito dal lavoro di Moore, Analizzando il locus genico nel quale si trova PrP C egli scoprì un nuovo gene che chiamò Prnd (downstream), Doppel, così chiamato perché distante soltanto 16Kb dal gene Prn-P. Moore individuò alcune caratteristiche importanti di questa proteina: espressa in grandi quantità nel testicolo ma molto poco nel CNS ( Fig 11 a) in grado di codificare per una proteina a di 179bp molto simile a PrpC nella regione C- terminale (Fig 11 b) Fig 11: a) western blot nel quale si analizzano i livelli di espressione di Dpl in diversi tessuti (cervello, cuore, fegato e testicolo). b) Allineamento multiplo tra Dpl e PrP C di diversi mammiferi b molto conservata nei mammiferi. (Fig 12). Fig 12: Allineamento multiplo tra Dpl di diversi mammiferi (Uomo, Topo e Ratto). Con le barre nere si indicano i punti nei quali c è identità aminoacidica 5

6 Analizzando questa proteina il ricercatore osservò che mentre nei topi wild type i livelli di doppel nel cervello sono molto bassi, come deve essere, in quelli atassici questi livelli sono elevati (Fig 13). In questi ultimi Moore svelò l arcano: in seguito a ricombinazione omologa si aveva la delezione di un sito accetore di splicing situato nella regione codificante di Prn-p; il gene Dpl risultava così sotto il controllo del promotore di PrpC (che non veniva eliminato dalla ricombinazione) e veniva di conseguenza overespresso nel cervello. Fig 13: Northern blot x analizzare i livelli di mrna di Prn-P in topi wild type e topi KO per Prn-P con fenotipo atossico. Sebbene questi KO atassici non sono altro che semplici artefatti, date le caratteristiche importanti di Dpl (vicina a PrP C, molto conservata, molto simile a PrPc nel C-terminale) e il fenotipo cerebrale mutato (simile a quello indotto da PrP SC ) che essa è in grado di indurre se overespressa nel cervello diventa importante capire meglio il ruolo che potrebbe svolgere nel pathway di attivazione della malattia (probabile antagonista!). Possiamo quindi concludere dicendo che: I topi senza Prp C non hanno alcuna alterazione comportamentale I topi senza Prp C sono protetti dal danno neurologico Prp C è quindi necessaria per lo sviluppo della malattia Individuata la prima Prp-like protein, doppel, la cui funzione nel pathway di attivazione della malattia potrebbe essere molto importante. Molti sono però gli studi ancora in corso, le ipotesi anche contrastanti su tutti i meccanismi associati a questa patologia. Bibliografia: 6

7 Bueler, Weismann et al.,2004. A Mouse to Remember. Cell Press 116, Aguzzi and Polymenidou, Mammalian prion biology: One century of evolving concepts. Cell 116, Billeter et al., Prion protein NMR structure and species barrier for prion diseases. Proc.Natl.Acad.Sci 94 Bueler et al., Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature 356, Bueler, Weismann et al., Mice devoid of PrP are resistant to Scrapie. Cell 73, Sakaguchi et al., Loss of cerebellar Purkinje cells in aged mice homozygous for a distrupted PrP gene. Natue 380, Moore et al., Ataxia in Prion protein deficient mice is associatede with upregulation of the novel PrP-like protein Doppel. JMB 292,