Aggiornamento sugli aspetti laboratoristici della Procreazione Medicalmente Assistita

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1 Aggiornamento sugli aspetti laboratoristici della Procreazione Medicalmente Assistita Lodovico PARMEGIANI GynePro Medical Group Bologna, Italy

2 Laboratorio di Procreazione Medicalmente Assistita Evoluzione delle tecniche evoluzione tecniche di inseminazione ICSI versus FIVET Physiologic ICSI IMSI perfezionamento sistemi di coltura nuove formulazioni terreni coltura con bassa tensione di ossigeno (5%) nuovi sistemi di valutazione embrionaria microscopia time-lapse metabolomica tecniche introdotte nella routine clinica diagnosi preimpianto (PGD-PGS) trattamento coppie sierodiscordanti crioconservazione ovociti tecniche di fecondazione oocyte banking crioconservazione tessuto ovarico

3 Laboratorio di Procreazione Medicalmente Assistita Evoluzione delle tecniche evoluzione tecniche di inseminazione ICSI versus FIVET Physiologic ICSI IMSI perfezionamento sistemi di coltura nuove formulazioni terreni coltura con bassa tensione di ossigeno (5%) nuovi sistemi di valutazione embrionaria microscopia time-lapse metabolomica tecniche introdotte nella routine clinica diagnosi preimpianto (PGD-PGS) trattamento coppie sierodiscordanti crioconservazione ovociti tecniche di fecondazione oocyte banking crioconservazione tessuto ovarico

4 ICSI versus FIVET Registro Nazionale PMA - Italia The European IVF monitoring consortium for ESHRE 55% 52% 67% 45% 48% 33% FIVET ICSI ICSI Society for Assisted Reproduction Technologies USA 55% 59% 66% 45% 41% 34% FIVET ICSI PRO tasso di fertilizzazione più alto maggiore n. embrioni disponibili CONTRO checkpoints della selezione spermatica fisiologica bypassati

5 1992 ICSI oggi Palermo et al, Lancet :17 18 interazione spermatozoo-acido ialuronico (HA) checkpoint della fecondazione naturale physiologic HA-ICSI miglioramento qualità embrionaria incremento tasso di impianto riduzione del rischio di ICSI di spermatozoi con anomalie cromosomiche e/o cromatiniche Parmegiani et al, Fert Steril 2010;93:598-4; JARG 2009;27:13-6; RBM Online 2010;

6 PRO Intracytoplasmic morphologically selected sperm injection - IMSI miglioramento dello sviluppo embrionario Vanderzwalmen et al, RBM Online 2008; 17: aumento del tasso gravidanza e riduzione di quello di aborto Souza Setti et al, RBM Online 2010; 21:450 5 physiologic HA-IMSI Parmegiani et al, Fert Steril 2010;93:598-4 CONTRO attrezzatura costosa Bartoov et al, Fertil Steril 2003; 80: time consuming circa 120 minuti Antinori et al, RBM Online 2008; 16: non applicabile a tutti i pazienti IMSI con spermatozoi di seconda scelta non migliora i risultati Cassuto et al, Fertil Steril 2009; 92: ruolo ancora controverso non migliora i risultati clinici in rigorosi studi prospettici randomizzati De Vos et al, Hum Reprod 2013; 28:

7 Laboratorio di Procreazione Medicalmente Assistita Evoluzione delle tecniche evoluzione tecniche di inseminazione ICSI versus FIVET Physiologic ICSI IMSI perfezionamento sistemi di coltura nuove formulazioni terreni coltura con bassa tensione di ossigeno (5%) nuovi sistemi di valutazione embrionaria microscopia time-lapse metabolomica tecniche introdotte nella routine clinica diagnosi preimpianto (PGD-PGS) trattamento coppie sierodiscordanti crioconservazione ovociti tecniche di fecondazione oocyte banking crioconservazione tessuto ovarico

8 sequenziali Nuove formulazioni terreni di coltura diverse formulazioni da DAY 0 al transfer simulare i diversi ambienti nel quale l embrione si sviluppa one-step Gardner RBM Online 2003;6: stessa formulazione dal DAY 0 al transfer l embrione prende il nutrimento che gli serve da un terreno ricco Wirleitner et al, RBM Online 2010;21;776:82 specifici per transfer arricchiti con ialuronano (Embryoglue- UTM) aumento tasso di impianto Urman et al, Fertil Steril 2008;90:604 arricchiti con fattori di crescita migliorano qualità embrionaria Sjolblom Hum Reprod 1999;14:3069 indicati in caso di aborti ripetuti aumento tasso impianto ORIGIO GM-CSF study 2011: multi centre, randomized, parallel group, doubleblinded, placebo-controlled, efficacy on 1,332 patients.

9 Coltura con bassa tensione di ossigeno (5% versus 20%) contribuisce allo sviluppo più rapido degli embrioni umani di buona qualità sia in DAY 2-3 che in DAY 5-6 Kovačič and Vlaisavljević RBM Online 2008;17:229-6 dovrebbe essere lo standard per la coltura embrionaria in tutti i mammiferi inclusi gli umani Vajta et al, RBM Online 2010;20:453-69

10 Laboratorio di Procreazione Medicalmente Assistita Evoluzione delle tecniche evoluzione tecniche di inseminazione ICSI versus FIVET Physiologic ICSI IMSI perfezionamento sistemi di coltura nuove formulazioni terreni coltura con bassa tensione di ossigeno (5%) nuovi sistemi di valutazione embrionaria microscopia time-lapse metabolomica tecniche introdotte nella routine clinica diagnosi preimpianto (PGD-PGS) trattamento coppie sierodiscordanti crioconservazione ovociti tecniche di fecondazione oocyte banking crioconservazione tessuto ovarico

11 Microscopia time-lapse monitoraggio in continuo degli embrioni potenziali markers dinamici di vitalità Kirkegaard et al, Hum Reprod 2012;27: determinazione del timing esatto delle divisioni embrionarie modello multivariato per classificare gli embrioni in base al loro potenziale di impianto Meseguer et al, Hum Reprod 2011;10:

12 Metabolomica analisi del profilo metabolomico dei terreni di coltura in cui crescono gli embrioni informazioni aggiuntive alle attuali strategie di valutazione embrionaria scelta dell embrione che ha maggiori potenzialità di impianto Botros et al, Mol Hum Reprod 2008;12: valenza ancora sperimentale

13 Laboratorio di Procreazione Medicalmente Assistita Evoluzione delle tecniche evoluzione tecniche di inseminazione ICSI versus FIVET Physiologic ICSI IMSI perfezionamento sistemi di coltura nuove formulazioni terreni coltura con bassa tensione di ossigeno (5%) nuovi sistemi di valutazione embrionaria microscopia time-lapse metabolomica tecniche introdotte nella routine clinica diagnosi preimpianto (PGD-PGS) trattamento coppie sierodiscordanti crioconservazione ovociti tecniche di fecondazione oocyte banking crioconservazione tessuto ovarico

14 Preimplantation Genetic Diagnosis/Screening (PGD/PGS) 1990 ricerca di una presunta malattia genetica nell embrione che è stato fatto sviluppare in vitro eseguita in alcuni centri al mondo Handyside et al, Nature 1990;344:768-0 oggi laser, implementazione tecniche di genetica PGD procedura clinica routinaria nei centri PMA d eccellenza Munne et al, Fertil Steril 2010;94: possibilità di analizzare tutto il cariotipo in tempi rapidissimi array-comparative Genome Hybridization (CGH) diffusione di Preimplantation Genetic Screening (PGS) Wells and Delhanty, Mol Hum Repr 2000;6: Incremento tassi di successo PMA+PGS ancora da dimostrare Staessen et al, Hum Reprod 2010;25:1199

15 Trattamento coppie sierodiscordanti HIV o HCV-HBV positive 1997 inseminazione intrauterina oggi Semprini et al, Lancet 1997;349: FIVET, ICSI Lugtgens et al, Hum reprod 2009;11;2676-8; Hu et al, Hum Reprod 2011;7:1860-7; Garrido et al, Hum Reprod 2012;27; criopreservazione gameti ed embrioni di pazienti HIV, HCV, HBV Cobo et al, Fertil Steril 2012;97:74-8

16

17 Crioconservazione ovociti impiegato in prevalenza lo slow freezing Chen C, Lancet 1986;1: ; Parmegiani et al, Human Reproduction 2008;23: Noyes et al, RBM Online 2009;18:769-6 oggi alta efficienza della vitrificazione Kuwayama et al, RBM Online 2005; ; Chian et al RBM Online 2008;.16;608-10; Cobo et al, Fertil Steril 2008;89: opzione clinica nei trattamenti IVF Cobo et al, RBM Online 2012;24:424-2; Fertil Steril 2011;96:277-5; Parmegiani et al, Journ of Reprod Stem Cell Biotechnology 2012; VOL 3, N 1: 22-40

18 Oocyte banking oggi programmi di ovo-donazione con ovociti congelati Cobo et al, RBM Online 2011;23:341-6; Hum Reprod 2010;25: ; Nagy et al, Fertil Steril 2009;92:520:6 preservazione della fertilità nelle pazienti oncologiche Noyes et al, JARG 2010;27:495-9; Cobo et al, Clin Transl Oncol 2008;10: preservazione della fertilità per ritardare la maternità Dondorp and De Wert Hum Reprod 2009;24:1779 5; van Loendersloot et al, Hum Reprod 2011;26:3054:60

19 Tessuto ovarico 2000 slow freezing Octay and Tilly, Lancet 2004; 17;364 tecnica sperimentale, da non proporre come opzione clinica Practice committe of ASRM and SART, Fertil Steril 2006;86:S142-7 predisposizione a riconsiderare l etichetta sperimentale Practice committe of ASRM and SART, Fertil Steril 2009;92: oggi slow freezing o vitrificazione Silber et al, Fertil Steril 2010;94: opzione per preservare fertilità Tessuto, intero ovaio ancora basso numero di nati dopo re-impianto Donnez et al, Clin Obstet Gynecol 2010;53:787-6; Fertil Steril 2011;95:1787; Ann Med :437-50; Silber et al, Fertil Steril 2010;94:2191-6; Revelli et al, Fertil Steril 2013; 99:227-30

20 slow freezing Tecniche di criopreservazione bassa concentrazione di crioprotettori disidratazione lenta delle cellule ridurre la formazione di cristalli di ghiaccio intracellulari ed il danno cellulare velocità di raffreddamento graduale e controllata da un computer vitrificazione passaggio di stato liquido/solido senza formazione di cristalli volume minimo di terreno elevata viscosità alta concentrazione dei crioprotettori alta velocità per cooling/warming Specifici dispositivi/carriers immersione diretta in azoto liquido

21 Tecnologia e normativa: il caso della vitrificazione la vitrificazione delle cellule riproduttive umane si esegue in modo efficiente con specifici open carriers Kuwayama et al, RBM Online 2005;11:300-8 rischio di contaminazione del terreno di coltura al warming se il LN 2 usato per la vitrificazione e/o lo stoccaggio è accidentalmente contaminato Bielanski et al, Cryobiology 2000;40:110-6; 2003;46:146-2; Theriogenology 2012;77: Parmegiani et al, RBM Online 2011;23:505-11

22 Aseptic Open Vitrification la giusta dose di radiazione UV deattiva la crescita di qualsiasi microrganismo in LN 2 epatite: 8000 UV μws/cm 2 Parmegiani et al, Hum Reprod 2009; 24:2969 rapida decontaminazione di piccoli volumi di LN 2 certificazione di μws/cm 2 per ogni ciclo di sterilizzazione Parmegiani et al, RBM Online 2010;22:503 LN 2 sterile e certificato permette l applicazione clinica della vitrificazione Aseptic Open Vitrification Parmegiani et al, RBM Online 2011;23: ; Parmegiani and Rienzi, Hum Reprod 2011;26:3204-5

23 Quando si otterrà il 100% di impianto embrionario? Forse nel 2053 per le pazienti più giovani Extrapolating the past trend to the future, it is predicted that 100% success rates are attainable for the youngest age group (<35 years of age) within the next 41 years (AD 2053) On the other hand, the projected timeline may be considered too optimistic as some patients may continue to fail even if the technical and analytical knowledge base is sure to increase considerably Certain types of infertility may remain difficult to treat in the future even if overall likelihood of implantation reaches a maximum Cohen et al., RBM Online 2012;25: EVOLUTION IN PGS

24 Il nuovo laboratorio di Procreazione Medicalmente Assistita evoluzione tecniche di inseminazione ICSI versus FIVET Physiologic ICSI IMSI perfezionamento sistemi di coltura nuove formulazioni terreni coltura con bassa tensione di ossigeno (5%) nuovi sistemi di valutazione embrionaria microscopia time-lapse metabolomica tecniche introdotte nella routine clinica diagnosi preimpianto (PGD-PGS) trattamento coppie sierodiscordanti crioconservazione ovociti tecniche di fecondazione oocyte banking crioconservazione tessuto ovarico Team Embriologia GynePro: Bernardi S, Troilo E, Arnone A, Maccarini AM, Rastellini A, Lanzilotti S

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