LE CELLULE STAMINALI: dalla ricerca di base alle applicazioni

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1 LE CELLULE STAMINALI: dalla ricerca di base alle applicazioni

2 Perché ci troviamo oggi a parlare delle cellule staminali? Driesch (fine 800) dimostra la totipotenza dei blastomeri dell embrione precoce di riccio di mare 2 o 4 piccole larve Isolamento di blastomeri (stadio di 2 o 4 cellule)

3 Caratteristiche generali Hanno Tutte queste grandecaratteristiche potenziale proliferativo e la possibilità di manipolarle e geneticamente rendono le Sono capaci fisicamente di autorinnovamento cellule staminali oggetto di estremo interesse in Possiedono ampie potenzialità differenziative: diversi campi di ricerca e di terapia clinica, grazie Totipotenza alle attuali sofisticate tecnologie. Pluripotenza Nel contempo, la trasposizione delle ricerche dagli Multipotenza animali all uomo, introduce implicazioni etiche che Sono presenti in tuttistessa gli stadi di sviluppo: pongono la ricerca al centro dell interesse di Embrionale (ESC) altre discipline (anche non scientifiche). Fetale (FSC) Adulto (ASC) Provvedono: allo sviluppo embrionale e fetale alla rigenerazione ed all omeostasi di organi adulti

4 Segmentazione nei mammiferi ed origine delle ESC

5 Destino delle popolazioni cellulari della blastocisti

6 Stadi di sviluppo e potenziale differenziativo L uovo fecondato e gli stadi embrionali a 2 e 4 cellule sono totipotenti e possono dare origine ad ogni tipo di cellula. Le cellule della massa cellulare interna della blastocisti sono pluripotenti perché possono dare origine a tutti i tipi cellulari dell embrione, ma non ai tessuti extraembrionali

7 Cellule staminali embrionali (ESC)

8 Cellule staminali embrionali (ESC) Edwards (1967): da blastocisti di coniglio vengono ottenute cellule che, coltivate in vitro, formano aggregati (embryoid bodies) o monostrati che possono essere propagati per diverse generazioni e congelati.

9 Evans e Kaufman (1981): coltivano blastocisti di topo, ottenendo ESC pluripotenti. Una cellula è pluripotente se: È capace di formare embryoid bodies È capace di formare teratocarcinomi se iniettata in un organismo ospite È capace di formare chimere se iniettata in una blastocisti ospite

10 Science, Vol 282, Issue 5391, , 6 November 1998 Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts James A. Thomson, * Joseph Itskovitz-Eldor, Sander S. Shapiro, Michelle A. Waknitz, Jennifer J. Swiergiel, Vivienne S. Marshall, Jeffrey M. Jones These cell lines should be useful in human developmental biology, drug discovery, and transplantation medicine.

11 Cellule staminali pluripotenti umane (ESC, EGC,ECC) ESC EGC ECC

12 Caratteristiche delle ESC Le caratteristiche principali delle cellule staminali embrionali sono dunque la pluripotenza e la capacità di auto rinnovarsi Tra i meccanismi molecolari dell autorinnovamento e del mantenimento della pluripotenza sembrano svolgere un ruolo chiave le modificazioni alla struttura della cromatina.

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14 Struttura della cromatina nelle ESC L organizzazione strutturale della cromatina influisce sulla funzionalità del genoma modulando l affinità dei regolatori trascrizionali con i loro bersagli. Nelle ESC la cromatina è prevalentemente decondensata (eucromatina) e ricca di modificazioni istoniche attive Con il differenziamento si accumulano regioni di eterocromatina, contenenti modificazioni istoniche repressive

15 Le proprietà delle cellule staminali di pluripotenza self-renewal sono legate anche alla capacità di effettuare divisioni cellulari simmetriche e asimmetriche

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18 Applicazioni delle ESC alla ricerca biologica: studi in vivo Produzione di animali chimerici Produzione di animali transgenici Iniezione di DNA in un pronucleo femminile Studi in vivo che permettono di investigare: La funzione di geni normali nello sviluppo (ad es., sovraespressione di geni) La funzione di geni alterati nella patogenesi di malattie (ad es., espressione di geni umani mutati)

19 Applicazioni delle ESC alla ricerca biologica: studi in vitro Allestire linee di ESC, controllandone il differenziamento Studiare i meccanismi alla base delle proprietà di self-renewal e di pluripotenza: Isolare le ESC e farle proliferare Variare il mezzo di coltura, eliminando od aggiungendo fattori che si suppongono implicati nel differenziamento e studiandone l effetto Alterare geneticamente le cellule, studiandone l effetto Studiare i meccanismi di malattie genetiche: Isolare le ESC e farle proliferare Transfettare le cellule staminali con un gene mutato Studiare il comportamento delle cellule dissezionando i meccanismi patogenetici Studiare la risposta a specifici trattamenti (farmaci, RNAi,etc.)

20 Applicazioni terapeutiche delle ESC

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22 Applicazioni terapeutiche delle ESC

23 Applicazioni terapeutiche delle ESC Trapianto cellulare L approccio terapeutico con ESC è promettente per il trattamento di patologie caratterizzate da un estesa morte cellulare, soprattutto a carico di tessuti perenni o resi incapaci di rigenerare: Malattie neurodegenerative (AD, PD, HD etc.) Distrofie muscolari Malattie cardiache (infarto, ischemia, malattie coronariche croniche, etc.) Leucemie AIDS Malattie genetiche Ma quale fonte utilizzare per produrre hesc?

24 Derivazione di linee di hesc POSSIBILI FONTI DI hesc Utilizzo di embrioni soprannumerari derivanti da IVF Produzione di embrioni tramite trasferimento nucleare da cellule somatiche di paziente in oociti di donatrici ( clonazione terapeutica ) PROBLEMATICHE ETICHE E SOCIALI Consenso informato per chi dona gli oociti La blastocisti è già un essere umano o solo un insieme di cellule? La clonazione terapeutica è veramente diversa da quella riproduttiva? Le cellule staminali clonate possono costituire una terapia realistica? Solo per pazienti ricchi? Cellule staminali geneticamente modificate L utilizzo terapeutico può incidere sul giudizio etico? (ovvero: Sopprimere una vita per salvarne un altra? )

25 Fonti alternative di staminali pluripotenti

26 Potenziali fonti di hesc Biopsia di singoli blastomeri

27 Potenziali fonti di hesc coltura di morule morte

28 Potenziali fonti di hesc Partenoti

29 La riprogrammazione cellulare Se le cellule differenziate originano da cellule staminali, è possibile ottenere cellule staminali da cellule differenziate? Il differenziamento è una trasformazione reversibile?

30 La riprogrammazione cellulare L idea è: Prendere una cellula matura da un organo qualsiasi per trasformarla in cellula pluripotente

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35 Riprogrammazione cellulare mediante trasferimento nucleare Mi sembrava chiaro che l'esperimento più importante, trapiantare nuclei da cellule differenziate, dovesse ancora essere fatto (Gurdon, 1962)

36 La clonazione dei mammiferi: Dolly Wilmut et al, 1997

37 Geni della pluripotenza Perché le cellule differenziate perdono la pluripotenza? Pur contenendo lo stesso genoma delle cellule capostipiti, non lo esprimono nella stessa maniera Un gene si esprime producendo mrna e proteina Nelle cellule differenziate alcuni geni sono silenziati o spenti

38 Riprogrammazione cellulare mediante trasferimento di geni Cellule staminali embrionali Yamanaka e Blau, geni importanti per la pluripotenza: Oct4, Sox2, Nanog, Istone B4. Trasferimento dei geni mediante virus in cellule differenziate Ottenimento di cellule staminali pluripotenti indotte (cellule ips) Cellule staminali pluripotenti indotte (ips) Fibroblasti Yamanaka, 2006

39 Le cellule ottenute da Yamanaka erano davvero pluripotenti? Cellule del fegato Neuroni Cellule muscolari Takahashi et al, 2007

40 Possibili applicazioni delle cellule ips L approccio terapeutico con ESC è promettente per il trattamento di patologie caratterizzate da un estesa morte cellulare, soprattutto a carico di tessuti con scarsa capacità di rigenerazione: Malattie neurodegenerative Distrofie muscolari Malattie cardiache Leucemie AIDS Malattie genetiche

41 Cellule staminali mesenchimali per la cura della SLA

42 Ma allora Vannoni aveva ragione??? Nel brevetto di Vannoni si parla di cellule mesenchimali che si trasformano in neuroni funzionanti in sole due ore, un tempo di differenziamento cellulare impossibile dal punto di vista biologico e mai documentato in letteratura. La stessa ricerca del gruppo della Schegelskaya, che aveva ispirato Vannoni nel 2007, parla di un differenziamento ottenuto incubando le cellule di partenza per diversi giorni e con una concentrazione di acido retinoico pari a un decimo di quella indicata nel brevetto. La conclusione dell ufficio brevetti è che, nelle condizioni sperimentali descritte, la comparsa di cellule simil-nervose sarebbe probabilmente l effetto di cambiamenti citotossici all interno della coltura. Nel 2013 la rivista Nature scopre che la richiesta di brevetto di Vannoni non contiene solo errori e omissioni. Una fotografia chiave, che dovrebbe documentare la presenza in coltura delle cellule nervose in seguito al differenziamento, non è originale. È la stessa pubblicata in una ricerca del 2003, proprio la ricerca del gruppo della Schegelskaya. Ecco le parole della ricercatrice russa: Nel suo brevetto sono state utilizzate due figure pubblicate nei miei articoli (anni ) con altri coautori prima di aver conosciuto Vannoni. Queste figure non possono essere usate in nessun brevetto senza il permesso mio e dei coautori. Quell immagine, dunque, non solo non può testimoniare l efficacia del protocollo presentato da Vannoni e dalla sua biologa, poiché raffigura qualcosa che è avvenuto in condizioni sperimentali completamente diverse, ma costituisce anche una frode scientifica. Il risalto è tale che lo studioso e medico giapponese Shinya Yamanaka, premio Nobel per la medicina nel 2012 e presidente della Società Internazionale per la Ricerca sulle Cellule Staminali, pubblica un comunicato in cui esprime preoccupazione per l'autorizzazione da parte delle autorità italiane di un metodo del quale non si conosce la sicurezza e privo di qualunque evidenza di efficacia.

43 e se si utilizzassero cellule staminali adulte per la riprogrammazione? Alcune cellule staminali dei tessuti adulti sono particolarmente plastiche o versatili

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