PRECIPITAZIONE FRAZIONATA DI PROTEINE Obiettivo: separare proteine sfruttando differenze di solubilità

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1 PRECIPITAZIONE FRAZIONATA DI PROTEINE Obiettivo: separare proteine sfruttando differenze di solubilità

2 SOLUBILITA DELLE PROTEINE ph FORZA IONICA SOLVENTI POLIMERI ORGANICI TEMPERATURA

3 Effetto del ph

4 Precipitazione isoelettrica Si modifica il ph avvicinandolo al pi Può essere utilizzata per allontanare proteine estranee o per purificare la proteina desiderata

5 Ioni in acqua Gli ioni interferiscono con la struttura naturale dei legami idrogeno dell acqua L effetto netto è la riduzione della viscosità Alcuni ioni si comportanoi come agenti chaotropi o denaturanti distruggono le interazioni intramolecolari che stabilizzano le macromolecole agenti cosmotropi o stabilizzanti rinforzano la struttura dell acqua (interazioni idrogeno dell acqua forti ) così stabilizzando le interazioni intermolecolari tra le proteine

6 La relazione tra solubilità di un sale e la forza ionica è esponenziale log S = β -k S μ Relazione di Cohn, dove: μ = ½ Σ c i z 2 i forza ionica β = log S 0 solubilità a μ = 0 k S costante di salting-out dipende dal sale e dalla proteina

7 Efficacia precipitante dei sali. La serie di Hofmeister (1888) Effetto cosmotropico crescente (stabilizzanti e precipitanti) Cationi: NH 4+ > Cs + > Rb+ > K + > Na + > Mg ++ > Ca ++ > Al 3+ Anioni: citrate 3- > SO 4 -- > HPO 4 -- > Cl - > I - > NO 3 - > ClO 4- > SCN - Effetto chaotropico crescente (denaturanti)

8 L effetto chaotropo è legato alla capacità di penetrare il bilayer lipidico Jonathan N. Sachs and Thomas B. Woolf J. AM. CHEM. SOC. 2003, 125,

9 CH 2 OH OH O OH OH OH OH OH O CH 2 OH O Il trealosio (α,α-glucosio) è un agente cosmotropo Abbondante nell emolinfa degli insetti

10 Effetto della forza ionica Salting-in Salting-out

11 Precipitazione frazionata con ammonio solfato Sale molto solubile e buon precipitante La concentrazione si esprime in % saturazione (soluzione satura: circa 4 M) Si può aggiungere sale solido oppure una soluzione satura Si procede per aggiunte successive La tecnica non è denaturante La densità delle proteine è maggiore della soluzione (non vero per sale di potassio)

12 Frazionamento con solventi organici Si usano solventi polari (acetone, metanolo, etanolo, dimetil-solfossido ) Diminuisce la costante dielettrica del mezzo e aumentano le interazioni soluto-soluto Occorrono temperature basse (forte rischio di denaturazione) Pericoloso su larga scala (infiammabilità)

13 Precipitazione con solventi. Acetone a 0 C e ph 6.5

14 Frazionamento con polimeri organici Rimuovono acqua di idratazione dalle proteine Si utilizzano polimeri idrofili come il polietilenglicole (PEG) con massa molecolare

15 Effetto della temperatura In un certo intervallo, parte delle proteine globulari aumentano la solubilità con T A T > 40 C, molte proteine tendono a denaturarsi e a precipitare L aumento di temperatura può essere impiegato per precipitare proteine termolabili, recuperando proteine termostabili

16 DIALISI e ULTRAFILTRAZIONE: OBIETTIVO Separare molecole o particelle tramite una membrana semi-permeabile, sfruttando differenze di dimensioni

17 Dialisi Passaggio di molecole (cristalloidi) secondo gradiente di concentrazione attraverso le membrane. Le membrane sono impermeabili alle macromolecole (colloidi) e sono dette MEMBRANE DA DIALISI h M M c c c H 2 O h = pressione oncotica, pressione osmotica dovuta alle macromolecole

18 Dialisi selettiva a c b d a d b a c b d a c b d A B A B Ripetere per rimuovere completamente c Emodialisi (glucosio, NaCl, etc.)

19 inizio della dialisi all equilibrio

20 Dialisi all equilibrio. Si può calcolare la costante di affinità di un ligando (L) per il suo recettore (R) R L R-L L L equilibrio

21 Filtrazione Le particelle più piccole si muovono attraverso la membrana assieme al fluido sotto l azione di una forza Microfiltrazione μm Ultrafiltrazione Dalton Nanofiltrazione (non interessa)

22 DIALISI e ULTRAFILTRAZIONE: APPLICAZIONI Eliminazione di molecole a basso PM (desalting) Sostituzione del tampone Concentrazione Studi di interazioni con ligandi (binding) Recupero di frammenti di DNA Rimozione di batteri (sterilizzazione) Funzioni terapeutiche (emodialisi)

23 Concentratori per ultrafiltrazione Per far passare il solvente attraverso la membrana si possono utilizzare: Pressione (in genere, azoto) Forza centrifuga (provette Centricon) Sostanze igroscopiche al di là della membrana

24 Ultrafiltrazione a pressione Cella con il campione Azoto In Ultrafiltrato Valvola Membrana filtrante Agitatore Liquido di lavaggio Out Serbatoio

25 Diafiltrazione: celle per campioni

26 Dischi per ultrafiltrazione Per concentrare o desalificare soluzioni diluite, si usano membrane di cellulosa. La microstruttura idrofilica assicura la maggiore ritenzione possibile Con il minore adsorbimento di proteine, DNA o altre macromolecole. Per campioni più ricchi in proteine (es., siero) si usano membrane in polieteresulfone (PES)

27 Filtrazione a flusso tangenziale (TFF)

28 Apparato per TFF Pompa Filtrato valvola ingresso Recipiente del campione Membrana lunghezza Filtrato recuperato

29 Applicazioni della TFF Concentrare e desalificare proteine e peptidi. Concentrare e desalificare acidi nucleici [DNA, RNA, oligonucleotidi]. Recuperare e purificare anticorpi o proteine recombinanti da terreni di cellule in coltura. Recuperare e purificare DNA plasmidici da lisati cellulari o DNA cromosomico da sangue intero. Frazionare miscele diluite di proteine. Chiarificare lisati cellulari o omogenati di tessuti. Depirogenare (rimuovere endossine) da acqua, tamponi e altre soluzioni. Preparare i campioni prima di una cromatografia su colonna. Raccogliere cellule. Ricuperare o rimuovere virus.

30 Concentratore Centricon Tappo di raccolta Campione Campo centrifugo Campione concentrato Membrana ultrafiltrante Serbatoio di raccolta Filtrato

31 Sistema Amicon Concentra 500 ul in 15 ul Resa 90% min a g

32 Rimozione di sali

33 Concentratore statico Adsorbente igroscopico di cellulosa Pozzetti per i campioni Membrana campione Setto non permeabile Campione concentrato

34 Concentratore statico: applicazioni Concentrazione di campioni clinici (urina, siero, CSF) Concentrazione di campioni per ricerca Aumento del titolo di anticorpi Rimozione di sali per ripetuta diluizione/ concentrazione Concentrazione di enzimi

35 Concentratore Savant SpeedVac camera trappola refrigerata trappola per pompa centrifuga per il solvente vapori (opzionale)