La tecnica Real-Time PCR nelle analisi alimentari: Sicurezza e prevenzione delle frodi

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1 La tecnica Real-Time PCR nelle analisi alimentari: Sicurezza e prevenzione delle frodi -Dr. Matteo D Andrea- -Product Specialist PCR, R-Biopharm Italia-

2 Scandali alimentari: Sempre maggiore attenzione a cosa mangiamo

3 Necessità di analisi sempre più sensibili e affidabili SENSIBILITA OGM SPECIFICITA PATOGENI REAL TIME PCR ID SPECIE ANIMALI VIRUS VELOCITA ALLERGENI AFFIDABILITA

4 DNA è presente in tutti gli organismi viventi DNA trasporta tutte le informazioni genetiche DNA ha un linguaggio composto da 4 lettere: A, T, G e C DNA è una molecola lineare, polimerica a doppio filamento DNA può essere replicata facilmente DNA è una molecola stabile La sequenza del genoma è specifico per ogni singolo individuo Le varie parti del genoma possono avere un grado differente di specificità La molecola target: DNA ATGCCGTAGCT AGCTCTCCGAT CGCTAAGCTGC TAATATAGCTA TATTAGATCTG GAAATTTTCTC GATACTGACTG ATCGATAGACG CGTATATATCG AGCTAGCTACG

5 PCR: Considerazioni generali PCR è l acronimo di Polymerase Chain Reaction PCR è stata inventata nel 1983 da Kary Mullis (Premio Nobel 1993) PCR è basata su una reazione enzimatica PCR produce una grande quantità di copie identiche di una corta e definita sequenza di DNA partendo da poche copie PCR ha un ampio spettro di applicazioni nella ricerca e nella analitica PCR è uno strumento perfetto per le analisi alimentari

6 Real-Time PCR: Work flow AITA Milano DNA Preparazione del campione, (arricchimento) ed estrazione del DNA Preparazione Real-Time PCR Analisi dei risultati

7 T[ C] PCR Step 1 Denaturazione 95 C t[sec] Step 1: Denaturazione del DNA a doppio filamento grazie alla temperatura (95 C) Risultato: (Due) filamenti singoli

8 T[ C] AITA Milano PCR Step 2 Appaiamento dei primer specifici t[sec] 60 C Step 2: Appaiamento dei primer specifici grazie all abbassamento della temperatura (60 C) Risultato: Identificazione del gene di interesse specifico da parte dei primer e creazione del punto di attacco da cui l enzima Taq Polimerasi può cominciare a creare un nuovo filamento

9 T[ C] AITA Milano PCR Step 3 Allungamento t[sec] 72 C Taq Taq Step 3: Allungamento della sequenza a partire dai primers e produzione di un nuovo doppio filamento complementare da parte della Taq-Polimerasi alla giusta temperatura (72 C) Risultato: Due copie a doppio filamento della sequenza target

10 PCR e Fluorescenza FRET! FRET Taq La probe (sonda) è un oligonucleotide con una sequenza complementare ad una parte della sequenza target La sonda si appaia al DNA insieme ai primer durante lo step di annealing Attaccato alla sonda c è un fluoroforo ed un quencher (spegnitore) che inibisce l emissione di luce da parte del fluoroforo La sonda viene idrolizzata dalla Taq Polimerasi per attività esonucleasica 5-3 La Taq separa il quecher dal fluoroforo e quest ultimo può in questo modo sviluppare fluorescenza

11 35-45 Cicli x10 9 Real Time PCR: Analisi in tempo reale della fluorescenza

12 Di cosa abbiamo bisogno? Specifici FRET Mastermix Buffer con Mg 2+ A T G C Taq Unità Ottica - DNA templato di partenza - Coppia di oligonucleotidi specifici - primers e probe - dntps (nucleotidi) - Buffer con Mg 2+ (Cofattore) - Taq DNA Polimerasi Termociclatore

13 PCR all together now... Unità Ottica fluorescence Ct 8 Ct 12 Ct 15 cycles Termociclatore

14 Organismi Geneticamente Modificati

15 Organismi Geneticamente Modificati Piante transgeniche nelle quali sono state inserite artificalmente nuove sequenze genetiche. Questi processi non sono riproducibili in maniera naturale Le sequenze genetiche introdotte servono principalmente a fornire alla pianta resistenza agli erbicidi o resistenza contro gli insetti OGM che resistono alla siccità o cibi funzionali basati su inneschi genetici (Es: Riso con vitamina A) sono veramente rari Gli OGM sono coltivati da anni in America settentrionale e meridionale. In Europa sono fortemente limitati ma c è il possibile rischio contaminazioni. History

16 Perchè Real-Time PCR? Gli OGM sono degli alimenti in cui sono stati inseriti artificialmente nuovi geni Per questo l analisi del DNA è un metodo diretto per identificare la presenza di eventi OGM Real-time PCR è il metodo d elezione per la ricerca degli OGM in alimenti: E veloce, sensibile, specifico, di facile utilizzo e permette anche di eseguire analisi quantitative

17 Etichettatura degli OGM per alimenti e mangimi Etichettatura Alimenti e mangimi che sono, contengono o sono prodotti da eventi OGM autorizzati (incluso additivi alimentari) sono obbligatoriamente da segnalare in etichetta Eccezioni Solo le tracce di eventi OGM autorizzati possono essere esenti da tale obbligo se queste non superano la soglia dello 0,9 % e se la loro presenza è involontaria e tecnicamente inevitabile. Mai permessi Alimenti e mangimi che contengono eventi OGM non autorizzati (0% tolleranza)

18 Strategia generale per la detection degli OGM AITA Milano Estrazione DNA C è qualche OGM? Alimenti/mangimi Che OGM c è? E autorizzato? positivo DNA campione SCREENING 35S/NOS/FMV! negativo GMO-free!

19 Analisi OGM: Screening Plant- DNA Costrutto genetico Plant- DNA 5 Promoter Gene Terminator 3 Start new variety Stop Marker Tutti OGM +FMV Non rilevato oggi 35S+ NOS Il metodo migliore di screening per il momento è la rilevazione di: - 35S promotore - NOS terminatore - FMV (34S) promotore

20 SureFood GMO 4plex 35S/NOS/FMV + IAC Reagenti base PCR Buffer con Mg 2+ dntps Taq Polimerasi Campione di DNA IAC: controllo di amplificazione interno 35S NOS FMV Detection-System Detection-System Detection-System + + FRET FRET FRET FRET 1 reazione (= 1 tubo!) 4 informazioni FAM Cy5 ROX VIC

21 35S (FAM) FMV (ROX) 0,5% RR-Soja NOS (Cy5) IAC (VIC) 0,5% RR-Soja NTC 0,5% RR-Soja

22 Strategia generale per la detection degli OGM AITA Milano Estrazione DNA C è qualche OGM? Proibito! Alimento/mangime proibito in EU! Alimenti/mangimi Che OGM c è? E autorizzato? IDENTIFICAZIONE Profilo Screening + altre info sul campione + altre analisi + esperienza analitica +... positivo Nonautorizzatoautorizzato Contiene OGM DNA campione SCREENING 35S/NOS/FMV negativo GMO-free! Qual è la quantità relativa di OGM nel campione? E sopra o sotto lo 0.9 %? QUANTIFICAZIONE! GMO / specie di pianta rispettiva > 0.9 % Deve essere etichettato come contiene OGM! < 0.9 % Non necessita etichettatura!

23 Come determinare la quantità relativa di OGM? AITA Milano standard evento OGM specifico con numero di copie di DNA note (e.g. MON810) campione numero di copie di OGM e di pianta sconosciute X standard DNA vegetale con numero copie di DNA note (e. g. mais) Y fluorescence fluorescence LOQ >5 copie di DNA o 0.1% C t C t Ct Ct Ct Ct Ct Ct Ct Ct X C t Y C t Log copy number X Log copy number Y X Copie DNA MON810 (Gene TARGET) Contenuto relativo di MON810 [%] = x 100 Copie DNA MAIS (Gene REFERENCE) Y

24 IDENTIFICAZIONE SPECIE ANIMALI

25 Notevole smercio internazionale di carne e prodotti derivati Procedure di produzioni e acquisti in nazioni/stabilimenti diversi con normative differenti Ridotta tracciabilità Possibilità di frode: carne ad alto costo rimpiazzata da carne di qualità e costo inferiore senza corretta dichiarazione in etichetta Certificati di lotto poco chiari; errori o frodi volontarie che possono portare a false dichiarazioni Perdita di reputazione con conseguenti perdite finanziarie per chi si è ritrovato vittima di questo sistema Necessità di analisi di controllo affidabili e veloci lungo la catena produttiva e sul prodotto finale

26 Perchè Real-Time PCR? Le specie sono definite in base alle loro caratteristiche genetiche conservate nel loro DNA Per questo l analisi del DNA è un metodo diretto per identificare la presenza di una determinata specie Real-time PCR è il metodo d elezione per analisi alimentari basate sul DNA: E veloce, sensibile, specifico, di facile utilizzo e permette anche di eseguire analisi quantitative

27 MULTIPLEX PCR RILEVAZIONE SIMULTANEA DI DIFFERENTI SPECIE ANIMALI EPPENDORF LOD: 0.5% TARGET 1 Cavallo TARGET 2 Asino FAM Cy5 Mg 2+, Buffer Nucleotidi Taq Polimerasi primers probes TARGET 1-2 IAC DNA primers, probe IAC VIC TARGET 3 IAC=Controllo di inibizione

28 QUANTIFICAZIONE RELATIVA RETTA TARATURA GENE TARGET (ES: CAVALLO) RETTA TARATURA GENE REFERENCE (CARNE) Ct value CAMPIONE LOQ Ct value >5 copie di DNA o 0.05% CAMPIONE Numero copie DNA target Numero copie DNA reference Copie DNA Cavallo (Target) Copie DNA Carne (Reference) x 100 = % Cavallo nel campione di carne

29 ALLERGIE ALIMENTARI

30 Allergie alimentari: Un fattore di rischio importante per la produzione alimentare Il bacio della morte qualcosa di più di una leggenda metropolitana : Quantità estremamente basse di sostanze allergeniche negli alimenti possono causare reazioni estremamente gravi nei soggetti allergici fino allo shock anafilattico Non c è nessuna cura per i soggetti che soffrono di allergie alimentari. L unica possibilità è la completa eliminazione della sostanza allergenica dalla dieta. Una conoscenza dettagliata della composizione dell alimento è fondamentale per garantire la sicurezza dei soggetti allergici

31 Regolamentazione Europea: Direttiva 2007/68/EC Gli Allergeni che devono essere per forza etichettati sono elencati nella tabella III: - Cereali che contengono glutine (grano, segale, orzo, avena, farro, kamut) - Crostacei - Uova - Pesce - Arachidi - Soia - Latte - Frutta a guscio (Mandorla, nocciola, noce, anacardo, noce pecan, noce brasiliana, pistacchio, noce macadamia) - Sedano - Senape - Sesamo - Lupino - Molluschi - Solfiti

32 Perchè Real-Time PCR? DIATRIBA ELISA VS PCR ELISA rimane il metodo di elezione per la ricerca degli allergeni perchè va a ricercare la proteina allergenica in maniera diretta. Ma le proteine possono essere termolabili, degrdarsi a seguito di processi termici e non essere rilevabili. PCR rilevazione indiretta dell allergene tramite il DNA. DNA, molecola molto stabile, resiste anche a shock termici. La metodica Real Time PCR è più sensibile. Possibile rilevare più allergeni contemporaneamente tramite tecnica Multiplex PCR, quantificazione assoluta con matrice di riferimento.

33 SureFood ALLERGEN QUANT Quantificazione assoluta in PPM con l utilizzo di standard certificato Step 1: Estrazione dei campioni e del materiale di riferimento SureFood QUANTARD 40 (farina di mais con all interno 40 ppm di ogni allergene della Tabella III) standard known copy numbers fluorescence Food sample sample unknown concentration X threshold SureFood QUANTARD Allergen S3301 SureFood QUANTARD Allergen known concentration 40 ppm C t C t 10 5 C t 10 3 C t 10 1 Step 2: Real-time PCR per campioni, materiale di riferimento e standard di DNA Ct sample Ct reference Ct C t C t X reference Step 3: Quantificazione con l aiuto del DNA standard K reference copy number Log copy K sample K reference number Step 4: Transformazione a ppm l aiuto del materiale di riferimento K sample X allergen 40 concentration [ppm] ppm

34 Real-time PCR per campioni, materiale di riferimento e DNA standard Real-time PCR: - Campione DNA - SureFood QUANTARD 40-DNA Standard DNA Copie di DNA note Campione Concentrazione incognita X SureFood QUANTARD Allergen 40 Concentrazione nota 40 ppm - Diluizione seriale di standard DNA con concentrazione nota di copie di gene target fluorescence I valori di C t values per campioni, materiali di riferimento e standard vengono forniti direttamente dal software dello strumento Real time PCR C t C t C t C t sample C t QUANTARD threshold C t

35 Transformazione a ppm con l aiuto del materiale di riferimento La relazione tra il numero di copie di DNA calcolate del materiale di riferimento e la sua concentrazione nota di 40 ppm è la base per trasformare il numero di copie calcolate del campione incognito in una concentrazione in ppm Il calcolo basato su parametri forniti dallo strumento possono essere ricollegati ad una unica formula Data la complessità del calcolo viene fornito un foglio excel pre compilato in cui bisogna aggiungere solo i dati forniti dallo strumento X K reference K sample copy number K Kreference c reference X 40 ppm allergen concentration [ppm] sample sample ppm ppm c reference ppm Ct sample a s Ct reference a s c reference ppm K K reference

36 VIRUS E PATOGENI ALIMENTARI Epatite A/Norovirus

37 Perchè Real-Time PCR? Obbiettivo analisi Assenza di batteri patogeni (es: Salmonella) in 25 g in alimenti o mangimi testati Microbiologia classica (3 giorni): Prearricchimento Arricchimento selettivo. Piastra selettiva Isolamento colonia Biochimica serologica. Risultato Real Time PCR (16/ ore): Arricchimento qpcr Risultato MALDI- TOF Vantaggi Real Time PCR Sensibilità e specificità Velocità e possibilità di automazione Sicurezza per l operatore e possibilità di lavorare con organismi non coltivabili o virus Pathogens

38 EPATITE A NEI FRUTTI ROSSI CONGELATI Le informazioni raccolte dall indagine Dal 1 gennaio al 30 giugno 2013 sono stati segnalati al Seieva, 471 casi di Epatite A, rispetto a una media di 190 casi notificati nello stesso periodo nei 2 anni precedenti. I dati evidenziano che questo aumento si è concentrato in 7 Regioni settentrionali, nelle quali si registra il 58% dei casi segnalati: P.A. di Trento e Bolzano, Emilia-Romagna, Lombardia, Friuli Venezia Giulia, Piemonte e Veneto. Un incremento importante è stato registrato anche in Puglia Pathogens

39 MULTIPLEX PCR RILEVAZIONE SIMULTANEA DI NOROVIRUS/EPATITE A TARGET 1 Norovirus I&II TARGET 2 Epatite A FAM Cy5 EPPENDORF Retrotrascrittasi Mg 2+, Buffer Nucleotidi Taq Polimerasi primers probes TARGET 1-2 Retrotrascrizione RNA>cDNA direttamente nel termociclatore RNA Virale IAC DNA primers, probe IAC VIC TARGET 3 IAC=Controllo di inibizione

40 CONCLUSIONI La tecnica Real Time PCR viene utilizzata oramai in diversi campi delle analisi alimentari Risulta una tecnica altamente specifica, sensibile ed affidabile Con la tecnica Multiplex PCR si possono rilevare contemporaneamente diversi target durante una unica seduta analitica riducendo drasticamente i tempi di analisi Possibilità di quantificare in maniera precisa ed affidabile percentuali di matrici incognite all interno degli alimenti (OGM/ID SPECIE ANIMALE) Utilizzo di materiali certificati per trasformare le copie di DNA in PPM e fornire quantificazioni assolute sempre più precise Anche target pericolosi da maneggiare come i virus possono essere analizzati con più sicurezza da parte dell operatore

41 Thank you for your attention!