L'impiego di sonde fluorescenti per lo sviluppo di un metodo omogeneo per la valutazione quantitativa dei prodotti della per: il sistema TaqMan

Transcript

1 ~ L'impiego di sonde fluorescenti per lo sviluppo di un metodo omogeneo per la valutazione quantitativa dei prodotti della per: il sistema TaqMan S. GELMNO, R. SESTNO, G. VONAO, P. PNZANO, M. PAZZAGLO, L. RUOCCO*, R. TANZ*, C. ORLANDO Unità di Biochimica Clinica, Dipartimento di Fisiopatologia Clinica, Università degli Studi, FRENZE *Perkin -Elmer talia, MONZA (Milano) PREMESSA La PCR è una tecnica altamente sensibile per la determinazione di sequenze di acidi nucleici (DNA e RNA) anche se presenti in un numero limitato di copie nel campione in esame. A causa della natura esponenziale della reazione di polimerizzazione e delle numerose variabili che possono interferire nella cinetica di accumulo dei prodotti stessi della reazione, la PCR nella sua forma standard è un metodo che può fornire solo dati qualitativi. l semplice esame dei prodotti di amplificazione dopo gel elettroforesi e colorazione con bromuro di etidio non permette cioè di avere una stima, seppure approssimativa, delle concentrazioni del target genomico nel campione iniziale. Nel corso degli ultimi anni quindi sono nati numerosi metodi che affrontavano il problema della PCR impiegata a scopi quantitativi con due approcci che comunque non devono essere tra loro confusi. a) Determinazione quantitativa delle concentrazioni dei prodotti della PCR. A tale scopo sono stati sviluppati numerosi metodi basati sull'uso di sonde marcate con molecole di rivelazione (radioisotopi o enzimi) che possono essere rivelate dopo ibridazione su filtro o in fase solida. Altre tecniche di misura sono invece basate sulla rivelazione attraverso procedure cromatografiche, come nel caso dell'elettroforesi capillare. Ciascuno di questi metodi deve essere comunque considerato, indipendentemente dall'accuratezza della misura del segnale specifico, un approccio in cui la precisione della misurazione finale non può fornire nessuno strumento di controllo sull'andamento e sulla variabilità della reazione della PCR. b) PCR quantitativa L'impiego di uno standard interno (a DNA o a RNA) permette una determinazione del target in cui la variabilità intrinseca della reazione di PCR viene resa ininfluente ai fini del dosaggio, per la contemporanea presenza di una seconda molecola di riferimento contro la quale tarare i risultati. n ogni procedura analitica lo standard ideale è quello che durante tutta la procedura di un dosaggio segue lo stesso destino del bersaglio in esame. Nel caso della PCR questa condizione si ottiene rapportando l'amplificazione del target ad una molecola che condivida con esso le sequenze di riconoscimento dei primers. n questo modo target e standard competono tra di loro per il legame ai primers e per la successiva amplificazione (PCR competitiva), con uno schema che ricorda da vicino quello dei metodi di dosaggio a competizione di legame. Dal rapporto dei prodotti della PCR, misurato dopo gel elettroforesi e colorazione con bromuro di etidio, si risale facilmente alle concentrazioni del target nel campione iniziale essendo owiamente note le concentrazioni del competitore aggiunto ad ogni provetta di reazione. Questo secondo tipo di approccio rappresenta sicuramente lo sviluppo più interessante per l'uso quantitativo della PCR per la determinazione di DNA e RNA, come anche dimostrato nel capitolo di Sestini et al. e Giacca et al. in questo stesso numero della rivista. principali problemi di questo metodo sono rappresentati principalmente dalla complessità della procedura di sintesi di competitori e dal a necessità di sistemi di misura dell'intensità delle bande elettroforetiche o, come è più giusto dire, del loro rapporto (analisi d'immagine o elettroforesi capillare). n questo senso è particolarmente interessante qualunque sviluppo di tecniche per la rivelazione non isotopica dei prodotti della PCR attraverso un segnale robusto e facilmente misurabile, come quello descritto in questo capitolo, e che non richieda manipolazione dei prodotti post-amplificazione (gel elettroforesi, digestione enzimatica). L PRNCPO DELLA RVELAZONE DE PRODOTT DELLA PCR UTLZZANDO L'ATTVTA' ESONUCLEASCA ~ 3' DELLA TAQ POLMERAS l principio di questa reazione stato recentemente descritto da Holland et al. (1). n questo metodo l'attività esonucleasica della Taq polimerasi viene utilizzata per staccare nucleotidi all'estremità di una sequenza a doppia elica di DNA e conseguente rilascio di mono- e oligonucleotidi. Nella miscela di reazione della PCR viene introdotto una quantità fissa di un probe scelto in modo da ibridizzare con la sequenza target all'interno della zona delimitata dai due primers di amplificazione. l probe è marcato all'estremità e non è estendibile all'estremità 3' perchè fosforilato. L'annealing di questo probe alla sequenza specifica, rappresentata da uno dei due filamenti che si generano durante la PCR, genera un substrato adatto all'azione esonucleasica della Taq polirnerasi, secondo lo schema riportato in Fig. 1. La molecola di tracciante che si trova unita al probe in posizione viene scissa per azione della Taq polimerasi ad ogni ciclo della PCR solo se il probe si trova appaiato al target amplificato e verrà quindi a trovarsi in soluzione, con una concentrazione che sarà funzione della quantità di amplificato che si accumula durante la PCR. LlGAND ASSAY VOL. 1 NUMERO 1 ANNO 1996

2 R = REPORTER Q = QUENCHER 5, _p~r~;m~e~r======~~~~~:e..:~ 3' ~::.;:======:;;;;;;;;;;;;;;;; ' 3' 4. 3'- 5 '~~=======================~ ---;::==================:;;;;;;;;;;;;;;;; -.. FGURAi Principio del metodo di rivelazione dei prodotti della PCR secondo il sistema TaqMan TM. Nellafase 1 (polimerizzazione) i primers e il probe fluorescente si legano alla sequenza target. Nellafase di estensione dei primers (2) l'attività endonucleasica -3' della Taq polimerasi provoca il distacco di nucleotidi dell'estremità (3) e successivamente il distacco del probe residuo (4). La separazione della molecola reporter dal quencher genera un segnale fluorescente la cui intensità sarà proporzionale al numero di sequenze amplificate L PRNCPO DELLA REAZONE SECONDO L SSTEMA TaqMan l sistema T aqman per la rivelazione di sequenze specifiche di acidi nucleici sfrutta proprio il sistema sopra riportato. n questo caso il probe di rivelazione consiste in un oligonucleotide fluorogenico che porta alle sue estremità una molecola di reporter e una di quencher. La vicinanza delle due specie limita la produzione di segnale fluorescente da parte del reporter a causa del principio di trasferimento di energia secondo il modello di l F6rster. Quando invece il reporter viene dissociato per azione dell'attività esonucleasica della Taq viene a trovarsi da solo in soluzione e quindi il segnale fluorescente aumenterà in maniera proporzionale alle sue concentrazioni. La reazione di annealing del probe e la sua digestione avviene ad ogni ciclo di per, senza interferire con l'accumulo esponenziale della reazione. l segnale si assomma ad ogni ciclo e il valore finale sarà quindi correlato alla quantità del prodotto della per stessa. La specificità della reazione basata sul fatto che la Taq polimerasi non può digerire il probe se non attaccato al target specifico è inoltre, data la specificrtà della sonda, il sistema non dovrebbe rivelare prodotti aspecifici della per. n questo senso una reazione del tipo sopra illustrato rappresenta il primo esempio di misura in fase omogenea in per che non richiede fasi post-amplificazione, le quali possono essere fonte di errore analitico aggiuntivo, oltre che di un maggior dispendio di tempo. Le molecole attualmente utilizzate come reporter sono il FAM (6-carbossi-fluoresceina), il TET (tetracloro-6-carbossi-fluoresceina) e l'hex (esacloro-6-carbossi-fluoresceina). Questi marcatori, se eccitati a 488 nm, emettono a lunghezze d'onda caratteristiche di 518, 538 e 556 nm, rispettivamente. Questa caratteristica permette quindi anche l'impiego di più sonde nella stessa reazione, se marcate con diverso reporter. l reporter fluorescente viene legato covalentemente all'estremità dell'oligonucleotide. La molecola quencher è un derivato della rodamina (6- carbossitetrametil-rodamina o TAMRA) ed è attaccata all'estremità 3' dell'oligonucleotide attraverso un braccio distanziatore rappresentato da un timidin-nucleotide modificato con una catena a 6 atomi di carbonio attaccato alla posizione 4' dell'anello della timina (LAN, Linker Arm Nucleotide). noltre il probe è chimicamente fosforilato in 3' per prevenire l'estensione durante la per, impedendo quindi che il probe stesso diventi a sua volta primer della reazione. Se eccitato a 488 nm il TAMRA emette fluorescenza a 582 nm (Fig 2). criteri di scelta del probe non sono particolarmente di- ~ 'in co " E co o 'in '" E w 540 "No Template Contrai (n m) Reporter (FAM) Quencher (TAMRA) FGURA 2 Spettri di emissione di un campione sottoposto a PCR COli il sistema TaqMall e di un controllo in cui è presente il template (bianco della reazione) LGAND ASSAY VOL. 1 NUMERO 1 ANNO 1996

3 l versi da quelli per la selezione di un oligonucleotide usato come sonda in esperimenti di ibridazione o come primer per la PCR. l probe deve essere un oligonucleotide di nucleotidi per assicurare una buona ibridazione e elevata specificità di legame. l contenuto di GC non dovrebbe superare il 40-60% e dovrebbe essere evitata qualunque struttura secondaria, così come zone di overlap o ibridazione con i primers e sequenze ripetute di tre/quattro nucleotidi (specialmente G). Un altro importante criterio di scelta del probe è rappresentato dalla sua temperatura di melting (T m). nfatti il probe TaqMan non viene stabilizzato durante la fase di esten-. sione della reazione di PCR, a differenza di quanto avviene invece per i due primers. l disegno del probe deve essere fatto in modo tale che la sua T m sia di almeno 5 C più alta di quella dei primers. Per far questo il probe può essere formato anche da nucleotidi. Per probes con una T m inferiore a 72 C, la classica temperatura di estensione, la reazione di PCR può essere condotta anche con un unico step di annealing/estensione ad una temperatura intermedia tra quelle ottimali per le due funzioni, al di sotto della T m del probe. L'uso di concentrazioni maggiori di MgC 2 nella miscela di reazione permette l'impiego di temperature più alte nella fase di annealing e estensione, che a loro volta favoriscono l'attività della Taq polimerasi. LA MSURA DEL SEGNALE FLUORESCENTE E L'NTERPRETAZONE DE RSULTAT La misura del segnale può essere eseguita con un lettore a 96 pozzetti (modello LS50B, Perkin Elmer) che, come detto, permette di evitare il ricorso alla risoluzione per gel elettroforesi seguita da colorazione con bromuro di etidio o autoradiografia. Ambedue queste tecniche sono incapaci di fornire dati quantitativi, anche se rapportate ad uno standard a concentrazioni note corso parallelamente ai campioni nel gel di separazione. Come già precedentemente detto nel sistema TaqMan il segnale è il risultato di cambiamenti dell'intensità dell'emissione fluorescente generata dal reporter come conseguenza della parziale digestione del probe. Per un calcolo accurato di questo segnale si devono utilizzare due semplici elaborazioni. Nella prima di esse l'emissione del quencher TAMRA, letta dallo strumento contemporaneamente a quella del reporter, viene utilizzata corne standard interno passivo. n pratica per ogni campione viene calcolato il rapporto RQ+ (reporter/quencher) tra le due letture relative allo stesso pozzetto. Questo valore consente di fatto di normalizzare possibili variazioni legate alla preparazione del campione e alla sua misura, come le fluttuazioni di volume di lettura nel pozzetto. Tutte le fluttuazioni che non sono dovute alla reazione di digestione durante l'amplificazione in provetta possono essere normalizzate per sottrazione dall'rq+ di ogni campione del valore RQ ottenuto in un campione che contiene tutti i componenti della reazione di PCR, escluso il target. Questo valore è detto RQ e di fatto corrisponde al bianco tradizionale della PCR (no template). l t:,.rq così ottenuto indica il reale valore del segnale per ogni set di esperimenti di PCR. Ricapitolando: RO+ = ntensità dell'emissione del Reporter (518 nm) con Target ntensità dell'emissione del Ouencher (582 nm) RO = ntensità dell'emissione del Reporter (518 nm) T et ntensità dell'emissione del Ouencher (582 nm)senza arg da cui: t:,.rq = (RQ+) - (RQ ) L'uso di tre o più, pozzetti contenenti l'rq consente di calcolare un valore di limite di confidenza (media ± 2 oppure 3 SO) che permetterà di individuare un valore di soglia al di sopra del quale considerare genericamente positivo il t:,.rq ottenuto nei pozzetti contenenti i campioni incogniti. Questo risulta particolarmente importante per un uso prevalentemente qualitativo del sistema. L'MPEGO DEL SSTEMA TaqMan PER LO SVLUPPO D UN SSTEMA D DOSAGGO DEL GRADO D AMPLFCAZONE DELL'ONCOGENE C-erbB-2 Nel nostro laboratorio abbiamo sviluppato numerosi sistemi di determinazione di sequenze di acidi nucleici (DNA e RNA) basati sulla PCR competitiva. Per ognuno di questi dosaggi abbiamo realizzato competitori a DNA o RNA che, pur condividendo con la rispettiva sequenza target i siti di riconoscimento dei primers, fossero però distinguibili per le dimensioni dell'amplificato (2, 3). Per questo motivo abbiamo scelto di costruire competitori che contenessero al loro interno brevi sequenze aggiuntive non omologhe, attraverso tappe successive di PCR ricombinante con il metodo della overlap extension (4). competitori così ottenuti possono essere utilizzati come tali o clonati in vettori plasmidici. Quest'ultima procedura permette di ottenere quantità illimitate di competitore lineare a DNA o RNA. nfatti per il dosaggio dell'mrna con la PCR competitiva il clonaggio in vettori di espressione permette la sintesi di competitori a RNA tramite la trascrizione "in vitro" con T7 o SP6 RNA polimerasi. Le molecole di competitore possono essere poi quantizzate e aggiunte in concentrazione nota al campione da determinare prima della retrotrascrizione. Questa possibilità permette di conferire un assoluto aspetto quantitativo alla determinazione, perchè permette di rendere del tutto trascurabili ai fini del dosaggio anche le possibili variazioni di efficienza della retrotrascrizione, che altrimenti potrebbero essere, in condizioni non controllate, loro stesse causa di inaccuratezze nel dosaggio. Per maggiori dettagli sul principio del metodo e sulla preparazione dei reagenti ci si può riferire al lavoro di Vona et al (5). Uno dei dosaggi da noi sviluppato con questo tipo di approccio è stato quello per la determinazione del grado di amplificazione dell'oncogene c-erbb-2 in DNA estratto da tumori solidi. L'amplificazione, l'aumento cioè delle copie di un oncogene che provoca nella maggior parte dei casi un conseguente aumento dell'espressione della proteina codificata, è uno dei meccanismi di attivazione attraverso il quale alcuni oncogeni contribuiscono allo sviluppo e alla progressione di numerosi tumori umani. La determinazione della frequenza e del grado di questa lesione sembra rappresentare, almeno in alcuni casi, un indice di LlGAND ASSAY VOL 1 NUMERO 1 ANNO 1996

4 , valutazione prognostica legato ad alcuni indici di evoluzione della malattia, come la metastatizzazione e la farmacoresitenza del tumore. Risulta quindi importante lo sviluppo di metodi di dosaggio semplici e standardizzabili per il riconoscimento e la misura di queste alterazioni molecolari, che rendano possibile una maggiore diffusione di questo tipo di indagini in vaste casistiche cliniche e che permettano il diffondersi di questo tipo di dosaggi al di fuori del ristretto ambito di ricerca. Allo scopo quindi di semplificare ulteriormente questo tipo di dosaggio abbiamo condotto una serie di esperimenti preliminari per valutare il sistema TaqMan nello sviluppo di un metodo semplice ma accurato per la determinazione di questo tipo di alterazione genetica. Si deve a tal scopo premettere che il dosaggio del grado di amplificazione di un gene nelle varie forme di dosaggio fino ad oggi utilizzate (dot o southern blot, PCR differenziale, PCR competitiva) è basato sempre sul rapporto tra la determinazione delle copie del gene in esame rapportate a quelle di un gene di riferimento a singola copia. Questo espediente si rende indispensabile perchè non esiste allo stato attuale un metodo per la determinazione accurata delle concentrazioni reali di DNA presenti nel campione in esame e quindi il valore di un gene di riferimento, come la ~-globina, serve a normalizzare e rendere tra di loro confrontabili campioni diversi. Nel sistema che noi abbiamo sviluppato si è resa necessaria la realizzazione di due probes, uno per la ~-globina e uno per c-erbb-2, che permettessero la determinazione finale delle copie dell'oncogene (in due dosaggi successivi). concentrazioni del target iniziale all'interno dei quali esiste linearità tra dose e segnale. Nella fase iniziale del nostro studio abbiamo quindi studiato la cinetica di accumulo di tre diversi geni, ~-actina, ~-globina e c-erbb-2, attraverso la misura di fluorescenza prodotta da altrettante sonde specifiche per le sequenze amplificate. l sistema di rivelazione per la ~-actina con il sistema TaqMan ci è stato fornito dalla Perkin-Elmer come sistema di riferimento per il quale sono già state ottimizzate le condizioni sperimentali e il protocollo di amplificazione e può rappresentare quindi un valido confronto con le altre sonde, sintetizzate per lo scopo specifico, ~ globina e c-erbb-2. A titolo esemplificativo riportiamo di seguito la struttura della sonda fluorescente per c-erbb-2: 6-FAM LAN-TAMRA / \ -TG GT GGC AT CTG CTG GTC GTG GG-3' \ P n Fig. 3 abbiamo riportato la cinetica di amplificazione della ~-actina ottenuta partendo da tre diverse concentrazioni di target genomico (750, 3000 e molecole di DNA normale) e valutata misurando l'intensità di fluorescenza a diverso numero di cicli (da 15 a 40) con intervalli di cinque cicli. L'andamento delle curve dimostra chiaramente che l'intervallo di linearità delle tre diverse PCR è sensibilmente dipendente dalle concentrazioni iniziali del campione, che influenzano la velocità con cui la reazione comincia a raggiungere la fase plateau e la pendenza della fase esponenziale della reazione. Questo dato, ormai già ampiamente noto, è di basilare importanza nello stabi- LA DPENDENZA DEL SSTEMA TaqMan DAL NUMERO DE CCL D PCR Com'è noto, nella reazione di amplificazione, ad una prima fase ad andamento esponenziale, nella quale l'entità dei prodotti di amplificazione della PCR sono direttamente proporzionali alle concentrazioni del target iniziale, segue una fase nella quale la reazione tende lentamente a plateau. Questo fenomeno si instaura dopo un numero variabile di cicli (circa 25-30) e il raggiungimento di questa fase di perdita di linearità è sicuramente funzione delle concentrazioni e della qualità del target, ma è anche legato a fattori assolutamente non prevedibili. Purtroppo, quando la reazione comincia a perdere di linearità, la quantità dei prodotti di amplificazione è tale da non permettere un'accurata misura con le tradizionali colorazioni con di etidio bromuro. n passato molti metodi di approccio alla PCR quantitati va prevedevano l'estrapolazione delle concentrazioni del larget iniziale da PCR mantenute in condizioni di assoluta linearità esponenziale, spesso ricorrendo a PCR "calde" con un nucleotide radio marcato e successive tappe di elettroforesi, recupero delle bande radioattive e calcolo della incorporazione. l metodo omogeneo TaqMan sopradescritto permette invece lo sviluppo di un segnale fluorescente che si accumula parallelamente e proporzionalmente al generarsi dei prodotti della per riconosciuti dalla sonda specifica. Ma anche per questo tipo di reazione è indispensabile predeterminare l'intervallo del numero dei cicli di amplificazione e di O' ~ 2 <l ~ 750 molecole o molecole molecole molecole letture dopo 24 ore molecole lettura dopo 24 ore molecole lettura dopo 24 ore p-actina O numero dei cicli FGURA 3 Cinetica della reazione di PCR per il gene della ~-actina al variare del numero di cicli utilizzando diverse concentrazioni iniziali di DNA. La misurazione è stata e.tlettuata ogni 5 cicli (da 15 a 40 cici).la misura del MQ a distanza di 24 ore dall'esperimento,perfettamente sovrapponibile a quella effettuata al temine della reazione di polimeri'l.zazione, evidenzia la sostanziale stabilità dei risultati ottenuti con il sistema TaqMan 45 lgand ASSAY VOL. 1 NUMERO 1 ANNO 1996

5 ~ saggio quantitativo o semiquantitativo del grado di amplificazione di c-erbb-2. Nel primo metodo la determinazione del numero delle molecole dei geni della ~-globina (gene di riferimento a singola copia) e di c-erbb-2 viene eseguita nello stesso esperimento di PCR, in cui i campioni sono amplificati dai rispettivi primers ed in presenza della specifica sonda. Dal confronto dei rapporti L',RO di ogni singolo campione con quelli ottenuti in standard a concentrazioni note di DNA di riferimento, è possibile determinare il numero delle copie dell'oncogene. l secondo metodo, da considerarsi prevalentemente semi-quantitativo, è invece basato sulla determinazione in triplicato dei geni ~-globina e c-erbb-2, all'interno dello stesso esperimento di PCR e partendo da concentrazioni y = LOG(x) r = cicli Y = 0.997LOG(x) r = cici Y = 0.664LOG(x) r = cicli DNA largel (molecole) FGURA 5 Cinetica della reazione di PCR per il gene della ~-actina al variare delle concentrazioni di DNA target (750, 6000 e molecole), a 28,31 e 34 cicli di PCR y = x r = Y = x r = lire qualunque possibile correlazione quantitativa tra amplificato e target. Restringendo ulteriormente l'intervallo di studio della fase lineare della PCR ed eseguendo campionature più frequenti ad intervalli di tre cicli (vedi Fig. 4) abbiamo osservato che la fase esponenziale per le tre dosi sopra riportate si manteneva lineare e parallela, e quindi dose dipendente, in un ristretto range intorno ai 30 cicli. Considerando quindi i dati ottenuti a 28, 31 e 34 cicli abbiamo trovato per tutte e tre le dosi di DNA target una perfetta linearità con il L',RO ottenuto (vedi Fig. 5). Comunque risulta evidente come i dati ottenuti a 28 e 31 cicli mostrano i migliori livelli di fitting e un coefficiente angolare più vicino all'unità, dimostrando una migliore dose/dipendenza della risposta analitica. A 34 cicli l'andamento viene "fittato" da una retta più piatta, che quindi corrisponde ad una regione della cinetica di PCR non più in fase realmente esponenziale. Gli esperimenti sopra riportati per la ~-actina hanno dato risultati confrontabili anche utilizzando i probes per ~ globina e c-erbb-2. Come mostrato in Fig. 6, per entrambi abbiamo ottenuto un andamento lineare nel range compreso tra le 750 e le 6000 molecole di DNA target a 30 cicli di PCR. Un altro aspetto che doveva essere valutato è quello della ripetibilità della misura che, owiamente, rappresenta una prerogativa essenziale di qualunque tipo di dosaggio. A tale scopo abbiamo eseguito il dosaggio del gene c erbb-2 in 10 replicati all'interno dello stesso esperimento e in 6 replicati in altrettante PCR, partendo da due diverse concentrazioni di DNA target (1000 e 4000 molecole). risultati dimostrano una buona ripetibilità intradosaggio (coefficiente di variazione 3,3% e 4,7%, rispettivamente), mentre i livelli della variabilità tra dosaggi mostrano coefficienti di variazione sensibilmente più alti (15,4% e 17,3%, rispettivamente). Dopo questi esperimenti preliminari nei quali sono state valutate le condizioni globali all'interno delle quali i risultati della PCR possono essere considerati estremamente correlati alle concentrazioni dei target genomici di partenza, stiamo attualmente sviluppando e confrontando fra di loro due modelli di applicazione di questa tecnica al doa..: ~ D o o 750 molecole 3000 molecole molecole a..: ~ numero di cicli FGURA 4 Cinetica della reazione di PCR per il gene della ~-actina al variare del numero di cicli utilizzando concentrazioni diverse di DNA. La misurazione è stata effettuata ogni 3 cicli (da 22 a 38 cicli) o DNA targel (molecole) FGURA 6 Cinetica della reazione di PCR per il gene della ~-globina e per l'oncogene c-erbb-2 infzlllzione di concentrazioni diverse del DNA target LlGAND ASSAY VOL. 1 NUMERO 1 ANNO 1996

6 identiche di target genomico. Per ogni campione e per ogni gene, dai tre valori di L',RQ così ottenuti possiamo calcolare un valore medio ed un intervallo di limiti di confidenza che permettano di discriminare i campioni che statisticamente hanno un valore di c-erbb-2 significativamente maggiore di quanto trovato per la ~-globina. E' chiaro che questo secondo metodo di determinazione rappresenta un approccio utilizzabile solo come screening su vaste popolazioni. Dopo il riconoscimento di casi positivi sarebbe comunque necessaria la determinazione quantitativa dell'esatto valore di amplificazione. CONCLUSON l sistema TaqMan rappresenta il primo esempio di dosaggio omogeneo dei prodotti della PCR, basandosi sulla produzione di un segnale fluorescente che si produce in maniera contemporanea e quantitativamente correlata alla produzione di amplificati specifici. Questo tipo di innovazione rappresenta un importante sviluppo per la realizzazione di sistemi di PCR nei quali la reazione possa essere seguita fedelmente durante le fasi di sintesi e accumulo dei suoi prodotti. Altri vantaggi di questa tecnica sono rappresentati dal tipo di segnale utilizzato, robusto, molto stabile e sensibile e dalla mancanza di passaggi post-pcr, con notevole risparmio di tempo e strumentazione dedicata. Nella sua configurazione il sistema sopra riportato sembra essere confacente ad un uso prevalentemente qualitativo, o al massimo semi-quantitativo, della procedura di dosaggio. L'ottimizzazione dei parametri di reazione, ed in particolare la determinazione accurata dei livelli di linearità della PCR, rappresenta comunque un pre-requisito essenziale quando si pensi di applicare il metodo a tipi di misure nelle quali l'operatore cerchi di individuare anche informazioni sul contenuto reale di acidi nucleici. Per questo il nostro studio preliminare ha teso a determinare con la massima attenzione proprio le condizioni di linearità dei vari sistemi impiegati. BBLOGRAFA 1. Holland PM, Abramson RD, Watson R, Gelfand DH. Detection oj specific polymerase chain reaction product by utilizing the -3' exonuclease activity ojthermus aquaticus DNA polymerase. Proc Nati Acad Sci USA 1991 ; 88 : Sestini R, Orlando C, Zentilin L, Gelmini S, Pinzani P, Bianchi S, Selli C, Giacca M, Pazza gli M. Measuring c-erbb-2 oncogene amplijication in jresh and paraffin-embedded tumors by competitive polymerase chain reaction. Clin Chem 1994; 40: Sestini R, Orlando C, Zentilin L, Lami D, Gelmini S, Pinzani P, Giacca M, Pazzagli M. Measurement oj gene amplificationjor c-erbb-2, c-myc, epidermal growthjactor receptor, int-2 alul N-myc by quantitative PCR with a multiple competitor template. Clin Chem 1995; 41: Diviacco S, Norio P, Zentilin L, Menzo S, Clementi M, Biamonti G. A novel procedurefor quantitative polymerase chain reaction by coamplijication oj competitive templates. Gene 1992; 122: Vona G, Pinzani P, Gelmini S, Orlando C, Pazza gli M, Sestini R. PCR competitiva: sviluppi metodologici ed applicazioni in oncologia. Ligand Assay 1996; ; LlGAND ASSAY VOL. 1 NUMERO 1 ANNO 1996