PCR Polymerase Chain Reaction = Reazione a catena della polimerasi

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1 PR Polymerase hain Reaction = Reazione a catena della polimerasi mplifica un frammento di D di cui si conosce almeno in parte la sequenza Utilizza un enzima, la D Polimerasi, per copiare una molecola di D La reazione è ciclica e viene ripetuta più volte La tecnica è molto sensibile e consente di identificare un gene partendo anche da una singola molecola di D Franco Lucchini - RB Università attolica del Sacro uore - remona

2 Franco Lucchini - RB Università attolica del Sacro uore - remona Primer1 Primer2 D ucleotidi aq D Polimerasi I componenti necessari per la PR:

3 1 iclo / 1 fase : Denaturazione emperatura = 95 I due filamenti complementari di D si dissociano Franco Lucchini - RB Università attolica del Sacro uore - remona

4 1 iclo / 2 fase : ppaiamento emperatura = 55 I primers si associano ai filamenti di D dove è presente una sequenza complementare Franco Lucchini - RB Università attolica del Sacro uore - remona

5 1 iclo / 3 fase : Polimerizzazione emperatura = 72 Per azione della polimerasi vengono sintetizzati i nuovi filamenti. Iniziando dai primer, vengono inseriti i nucleotidi complementari rispetto al filamento originale (, ) aq D Polimerasi Franco Lucchini - RB Università attolica del Sacro uore - remona

6 2 iclo / 1 fase : Denaturazione emperatura = 95 La reazione si sussegue ciclicamente, raddoppiando ad ogni ciclo (in linea eorica) i filamenti che fungono da stampo per la polimerasi. Franco Lucchini - RB Università attolica del Sacro uore - remona

7 2 iclo / 2 fase : ppaiamento emperatura = 55 Franco Lucchini - RB Università attolica del Sacro uore - remona

8 2 iclo / 3 fase : Polimerizzazione emperatura = 72 Le copie di D effettuate a partire dai filamenti sintetici hanno una lunghezza fissa e predeterminata lunghezza fissa lunghezza fissa Franco Lucchini - RB Università attolica del Sacro uore - remona

9 Franco Lucchini - RB Università attolica del Sacro uore - remona 3 iclo / 3 fase : Polimerizzazione emperatura = 72 iclo per ciclo i filamenti sintetizzati aumentano di numero, secondo una progressione quasi geometrica Frammenti di dimensione determinata, pari alla distanza tra le regioni identificate dai primer

10 D originale essuna copia 1 iclo 2 frammenti copia di lunghezza indeterminata iclo 4 frammenti copia di lunghezza indeterminata 2 frammenti copia di lunghezza determinata 3 iclo 6 frammenti copia di lunghezza indeterminata 8 frammenti copia di lunghezza determinata 4 iclo 8 frammenti copia di lunghezza indeterminata 22 frammenti copia di lunghezza determinata Progressione della Reazione Franco Lucchini - RB Università attolica del Sacro uore - remona

11 l 30 ciclo (teoricamente) : 70 frammenti aspecifici e frammenti specifici Franco Lucchini - RB Università attolica del Sacro uore - remona

12 Marcatore di riferimento per il peso molecolare Bande che caratterizzano due campioni contenenti la sequenza in esame Le molecole così amplificate e di lunghezza nota testimoniano la presenza del gene ricercato. Esse possono essere facilmente visualizzate ed identificate tramite analisi elettroforetica Franco Lucchini - RB Università attolica del Sacro uore - remona

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